CN113712906A

CN113712906A - 抗ctla-4抗体制剂及其应用

Info

Publication number: CN113712906A
Application number: CN202010430026.5A
Authority: CN
Inventors: 黄丹丹; 吴用; 苏紫琪; 曹迪; 秦超; 刘翠华; 李胜峰
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明提供抗CTLA‑4抗体制剂及其应用，属于生物医药技术领域。在一些实施方案中，本发明抗体制剂包含以下组分：5‑40mg/mL抗CTLA‑4抗体或其片段，10‑30mM缓冲剂，200‑260mM稳定剂，0.02‑0.2mg/mL螯合剂，0.1‑0.4mg/mL表面活性剂，水；液体制剂的pH值为5.4‑6.2。本发明抗体制剂具有良好的稳定性。

Description

抗CTLA-4抗体制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及抗CTLA-4抗体制剂及其应用。

背景技术

CTLA-4是一种影响T细胞功能的关键抑制性受体，在免疫应答的启动阶段发挥关键作用。当抗原被MHCI类或II类抗原提呈细胞运输到T细胞受体(TCR)时，TCR上的信号就会放大，并被共刺激分子抵消。T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合后，会发出一种需要T细胞全激活的信号。这种CD28/B7的结合导致白介素2及其他刺激性的细胞因子产生的增加，提高代谢，促进细胞周期进程，上调细胞存活基因，最终使T细胞得到增殖和分化。当CD28结合并引起T细胞增殖后，CTLA-4被运送并表达在T细胞表面(Linsley PS,et al.(1996),Immunity.4(6):535-43.)。TCR的激活信号越强烈，越多的CTLA-4被运送并表达。当在细胞表面上时，CTLA-4的抑制信号就被传播(Egen JG,et al.(2002),Immunity.16(1):23-35)。与CD28相比，CTLA-4与B7有更高的亲和力，并能阻碍更进一步的共激活(Krummel MF,et al.(1995),J Exp Med.182(2):459-65.)。并且，CTLA-4表达的细胞能通过内吞作用捕获和降解B7-1和B7-2(Qureshi OS,et al.(2011),Sceience.332(6029):600-3.)。

目前较为人所知的CTLA-4单克隆抗体是百时美施贵宝公司的伊匹单抗(Ipilimumab)，以及阿斯利康公司尚处于临床阶段的曲美母单抗(Tremelimumab)。它们的机理都是通过阻断CTLA-4与B7的结合，解放B7蛋白使其能跟CD28结合，从而增强T细胞的增殖反应。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种适用于特定抗体的制剂。

本发明的另一个目的是提供一种储藏和递送中保持稳定的抗体制剂。

本发明的另一个目的是提供抗体制剂在制备用于治疗与CTLA-4相关疾病的药物中的应用。

一方面，本发明提供一种含抗CTLA-4抗体的液体制剂，其包含以下组分：4-80mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，缓冲剂，稳定剂，螯合剂，表面活性剂，水；液体制剂的pH值为5-7。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：

(1)4-80mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，

(2)8-45mM缓冲剂，

(3)180-290mM稳定剂，

(4)0.01-0.3mg/mL螯合剂，

(5)0.1-0.5mg/mL表面活性剂，

(6)水；

液体制剂的pH值为5.2-6.5。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：

(1)5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，

(2)10-30mM缓冲剂，

(3)200-260mM稳定剂，

(4)0.02-0.2mg/mL螯合剂，

(5)0.1-0.4mg/mL表面活性剂，

(6)水；

液体制剂的pH值为5.4-6.2。

在一些实施方案中，缓冲剂不包括Tris缓冲剂。

在一些实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂或其组合。在一些实施方案中，所述组氨酸缓冲剂包含组氨酸和组氨酸盐酸盐(如L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐)，所述醋酸缓冲剂包含醋酸和醋酸钠。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸缓冲剂或组氨酸缓冲剂与醋酸缓冲剂的组合物。在一些实施方案中，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇或其组合物。在一些实施方案中，所述稳定剂选自海藻糖或蔗糖。在一些实施方案中，所述螯合剂包含依地酸二钠。在一些实施方案中，所述螯合剂为依地酸二钠。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或其组合物。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体或其片段的浓度为约5mg/mL、约9mg/mL、约13mg/mL、约17mg/mL、约24mg/mL、约29mg/mL、约31mg/mL、约36mg/mL、约40mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约10mM、约14mM、约17mM、约21mM、约25mM、约29mM、约30mM，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，稳定剂的浓度为约200mM、约210mM、约219mM、约227mM、约235mM、约244mM、约251mM、约260mM，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，螯合剂的浓度为约0.02mg/mL、约0.09mg/mL、约0.12mg/mL、约0.17mg/mL、约0.2mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.1mg/mL、约0.18mg/mL、约0.24mg/mL、约0.3mg/mL、约0.36mg/mL、约0.4mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，当缓冲剂为组氨酸缓冲剂或组氨酸缓冲剂与醋酸缓冲剂的组合物时，液体制剂的pH值为约5.4、约5.5、约5.7、约5.9、约6.1、约6.2，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，当缓冲剂为醋酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂、或组氨酸缓冲剂与醋酸缓冲剂的组合物时，液体制剂的pH值为约5.7、约5.74、约5.81、约5.86、约5.9，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂包含7-15mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段。在一些实施方案中，液体制剂中抗CTLA-4抗体或其片段的浓度为约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL、约15mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂中包含17-23mM组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，液体制剂中组氨酸缓冲剂的浓度为约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂包含220-250mM蔗糖。在一些实施方案中，液体制剂中蔗糖的浓度为约220mM、约224mM、约228mM、约232mM、约237mM、约239mM、约241mM、约243mM、约247mM、约250mM，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂包含0.02-0.05mg/mL依地酸二钠。在一些实施方案中，液体制剂中依地酸二钠的浓度为约0.02mg/mL、约0.03mg/mL、约0.032mg/mL、约0.033mg/mL、约0.038mg/mL、约0.04mg/mL、约0.043mg/mL、约0.048mg/mL、约0.05mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂包含0.1-0.3mg/mL聚山梨酯80。在一些实施方案中，液体制剂中聚山梨酯80的浓度为约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.19mg/mL、约0.21mg/mL、约0.26mg/mL、约0.3mg/mL，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂的pH值为5.7-5.9。在一些实施方案中，液体制剂的pH值为约5.7、约5.73、约5.75、约5.78、约5.8、约5.83、约5.87、约5.9，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：

(1)10mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，

(2)20mM组氨酸缓冲剂，

(3)240mM蔗糖，

(4)0.033mg/mL依地酸二钠，

(5)0.2mg/mL聚山梨酯80，

(6)水；

液体制剂的pH值为5.8。

在一些实施方案中，所述液体制剂含无菌水或注射用水。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与所述SEQ IDNO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链可变区包含的序列与所述SEQ ID NO:1具有至少约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约99％、约100％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链可变区包含的序列与所述SEQ ID NO:2具有至少约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约99％、约100％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:3具有至少约90％同一性的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:4具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链包含的序列与所述SEQ IDNO:3具有至少约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约99％、约100％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链包含的序列与所述SEQ ID NO:4具有至少约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约99％、约100％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段为全人源单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段由CHO细胞表达。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段由敲除了α-(1,6)-岩藻糖转移酶的CHO细胞表达。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段由CHO-BAT-KF fut8(-/-)细胞(WO2019029713A1专利已公开上述细胞)表达。抗CTLA-4抗体或其片段通过常规方法进行纯化，如低速离心使细胞和培养基分离，高速离心上清液，并依次进行蛋白A亲和纯化和离子交换纯化。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中岩藻糖基化水平≤5％。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中岩藻糖基化水平为约0、约0.1％、约0.3％、约0.4％、约0.6％、约1.3％、约1.9％、约2.2％、约2.8％、约3.3％、约3.7％、约4.1％、约4.5％、约5％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中高甘露糖糖型总量<5％。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中高甘露糖糖型总量为约0.1％、约0.3％、约0.9％、约1.18％、约1.7％、约2.6％、约3.3％、约4.1％、约4.9％、约4.99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中唾液酸化糖型总量<3％。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中唾液酸化糖型总量为约0.1％、约0.2％、约0.36％、约0.8％、约1.5％、约2.2％、约2.7％、约2.9％、约2.99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

本发明另一面提供了所述液体制剂在制备用于治疗与CTLA-4相关疾病的药物中的应用。本发明另一方面提供了一种治疗与CTLA-4相关疾病的方法，所述方法包括对患者施用有效剂量的所述液体制剂。

在一些实施方案中，与CTLA-4相关疾病包括癌症，所述液体制剂可用于治疗癌症例如排斥可移植的肿瘤。在一些实施方案中，与CTLA-4相关疾病为黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，***癌，淋巴瘤或肾癌。

在一些实施方案中，所述液体制剂的给药方式可为注射或输液；给药的部位为肠外、静脉、黏膜、舌下、肌肉、皮内、鼻腔、腹腔、动脉内或皮下。

在一些实施方案中，所述患者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述患者是人。

本发明另一方面提供了所述液体制剂的制备方法，包括将各组分在溶剂中混合制成液体制剂。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)配置缓冲液，无菌过滤；

(2)通过UF/DF超滤，采用步骤(1)制备的缓冲液对抗体溶液进行超滤换液，然后进行浓缩得到抗体浓缩物；

(3)配制含有缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、螯合剂的辅料母液，将无菌过滤后的辅料母液添加到步骤(2)制备的抗体浓缩物中，得到液体制剂。

为了保持抗CTLA-4抗体或其片段的稳定性，本发明通过选择适当的缓冲体系、优化稳定剂、螯合剂和添加表面活性剂，开发得到的液体制剂可以显著抑制冷冻/复融循环期间、长期存储和温度变化过程中酸峰、二聚物、多聚物、降解物和不溶性微粒的形成。本发明抗CTLA-4抗体或其片段在上述制剂中，经过至少5次反复冻融后稳定性良好，在室温可稳定保存至少6个月。本发明的液体制剂可用于稳定地保存临床治疗用的抗CTLA-4抗体或其片段，对于治疗与CTLA-4相关疾病有重大意义。

定义

除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。

“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。

“氨基酸”是指指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如羧基α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。本申请中所用的术语“氨基酸”可以是指天然发生的羧基α-氨基酸或非天然氨基酸，天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

术语“抗体”以其广义使用，且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们显示期望的生物学活性。

“抗体片段”包括(comprise)全长抗体的一部分，通常包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)₂和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体(linearantibody)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“单克隆抗体”(mAb)是由相同的免疫细胞制备的抗体，所述免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体可以具有单价亲和力，因为它们结合相同的表位(抗体识别的抗原部分)。相反，多克隆抗体与多个表位结合，并且通常由几种不同的浆细胞分泌。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术制备。

本发明中缓冲剂的量，是指组成缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的总量。在一些实施方式中，采用摩尔浓度作为缓冲剂的量的单位，其数值指缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的摩尔浓度。如，由组氨酸和组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂作为缓冲剂时，给定浓度的组氨酸缓冲剂(如20mM)是组氨酸和组氨酸盐酸盐的组合浓度(如组氨酸为8mM，组氨酸盐酸盐为12mM；或者组氨酸为6mM，组氨酸盐酸盐为14mM；或者组氨酸为8.46mM，组氨酸盐酸盐为11.54mM等)。

本发明所述的制剂可以用所述辅料或其水合物或盐类配制。比如组氨酸盐酸盐，又称盐酸组氨酸，可以是无水组氨酸盐酸盐，也可以是组氨酸盐酸盐水合物，如组氨酸盐酸盐一水合物；如，“12mM组氨酸盐酸盐”可以为1L液体制剂中含有12mmol组氨酸盐酸盐或12mmol组氨酸盐酸盐一水合物；如，制剂中加入“2.52g组氨酸盐酸盐一水合物”等同于制剂中加入2.3g组氨酸盐酸盐。又比如，制剂中既可以加入海藻糖，又可以加入对应量的海藻糖二水合物；如，“225mM海藻糖”可以为1L液体制剂中含有225mmol海藻糖或225mmol海藻糖二水合物；如，制剂中加入“85g海藻糖二水合物”等同于制剂中加入76.9g海藻糖。又比如，制剂中既可以加入依地酸(EDTA)二钠，又可以加入对应量的依地酸二钠二水合物或依地酸；如，“0.033mg/mL依地酸二钠”可以为1L液体制剂中加入0.037g依地酸二钠二水合物或0.033g依地酸二钠或0.029g依地酸。

“有效剂量”是可以治疗疾病或病症的量。本发明的液体制剂对人体的施用量会随着患者的年龄、体重、性别、用药形态、健康状况及疾病危重程度而不同。

“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任意一种动物，包括但不限于人、狗、马、猫、兔、猪、牛、鼠等。在一些实施方式中，哺乳动物是人。

患者疾病“治疗”指的是(1)阻止疾病在有倾向性或还没表现疾病症状的患者中出现；(2)抑制疾病或症状或阻止其发展；或(3)减轻或消除疾病或症状或致其退化。

“稳定性”是指包含抗体的液体制剂中，抗体或其片段在给定的生产、制备、运输和/或贮存条件下不发生、或仅极少地发生聚集、降解或片段化。“稳定”制剂在给定的生产、制备、运输和/或贮存条件下保持生物学活性。可通过例如SEC-HPLC、IEC-HPLC、CE-SDS(NR)、灯检及浑浊度、不溶性颗粒、DLS检测粒子粒径等技术测量的所述制剂的聚集、降解或片段化程度等，从而评估所述抗体的稳定性。在一些实施方案中，“稳定”制剂指制剂在室温可稳定保存至少3个月、至少6个月或至少12个月。

具体实施方式

本发明提供一种含抗CTLA-4抗体或其片段的液体制剂。在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：4-80mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，缓冲剂，稳定剂，螯合剂，表面活性剂，水；液体制剂的pH值为5-7。

在一些实施方案中，缓冲剂不包括Tris缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂或其组合。在一些实施方案中，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖或甘露醇。在一些实施方案中，所述螯合剂包含依地酸二钠。在一些实施方案中，所述螯合剂为依地酸二钠。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或其组合物。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段为全人源单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段由CHO细胞表达。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段由中国仓鼠卵巢细胞CHO-BAT-KF fut8(-/-)(即CHO-BAT-KF)细胞表达，CHO-BAT-KF细胞中敲除了α-(1,6)-岩藻糖转移酶。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中岩藻糖基化水平≤5％，高甘露糖糖型总量<5％，唾液酸化糖型总量<3％。

在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中岩藻糖基化水平为约0、约0.1％、约0.3％、约0.4％、约0.6％、约1.3％、约1.9％、约2.2％、约2.8％、约3.3％、约3.7％、约4.1％、约4.5％、约5％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中高甘露糖糖型总量为约0.1％、约0.3％、约0.9％、约1.18％、约1.7％、约2.6％、约3.3％、约4.1％、约4.9％、约4.99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。在一些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体或其片段中唾液酸化糖型总量为约0.1％、约0.2％、约0.36％、约0.8％、约1.5％、约2.2％、约2.7％、约2.9％、约2.99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，10-30mM缓冲剂，200-260mM稳定剂，0.02-0.2mg/mL螯合剂，0.1-0.4mg/mL表面活性剂，水；液体制剂的pH值为5.4-6.2。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，10-30mM醋酸缓冲剂，200-260mM海藻糖，0.02-0.2mg/mL依地酸二钠，0.1-0.4mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为5.7-5.9。在一些实施方案中，所述稳定剂为蔗糖或甘露醇。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯20。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，10-30mM组氨酸缓冲剂，200-260mM蔗糖，0.02-0.2mg/mL依地酸二钠，0.1-0.4mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为5.4-6.2。在一些实施方案中，所述稳定剂为海藻糖或甘露醇。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯20。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，10-30mM组氨酸缓冲剂和醋酸缓冲剂的组合物，200-260mM蔗糖，0.02-0.2mg/mL依地酸二钠，0.1-0.4mg/mL聚山梨酯20，水；液体制剂的pH值为5.7-5.9。在一些实施方案中，所述稳定剂为海藻糖或甘露醇。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约5mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约10mM组氨酸缓冲剂，约200mM海藻糖，约0.02mg/mL依地酸二钠，约0.1mg/mL聚山梨酯20，水；液体制剂的pH值为约5.4。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约9mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约14mM醋酸缓冲剂，约219mM海藻糖，约0.09mg/mL依地酸二钠，约0.24mg/mL聚山梨酯20，水；液体制剂的pH值为约5.7。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约24mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约17mM醋酸缓冲剂，约227mM蔗糖，约0.12mg/mL依地酸二钠，约0.3mg/mL聚山梨酯20，水；液体制剂的pH值为约5.81。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约29mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约21mM组氨酸缓冲剂，约235mM蔗糖，约0.17mg/mL依地酸二钠，约0.3mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.7。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约31mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约25mM组氨酸缓冲剂，约244mM蔗糖，约0.11mg/mL依地酸二钠，约0.3mg/mL聚山梨酯80与聚山梨酯20的组合物，水；液体制剂的pH值为约5.9。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约36mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约29mM组氨酸缓冲剂，约251mM甘露醇，约0.16mg/mL依地酸二钠，约0.36mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约6.1。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约30mM组氨酸缓冲剂与醋酸缓冲剂的组合物，约260mM甘露醇，约0.2mg/mL依地酸二钠，约0.4mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.9。

在一些实施方案中，所述液体制剂包含以下组分：约40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约30mM醋酸缓冲剂，约248mM甘露醇，约0.2mg/mL依地酸二钠，约0.3mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.9。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：7-15mg/mL的抗CTLA-4抗体或其片段，17-23mM的组氨酸缓冲剂，220-250mM蔗糖，0.02-0.05mg/mL的依地酸二钠，0.1-0.3mg/mL的聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为5.7-5.9。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：约7mg/mL的抗CTLA-4抗体或其片段，约17mM的组氨酸缓冲剂，约220mM蔗糖，约0.02mg/mL依地酸二钠，约0.1mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.7。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：约9mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约20mM组氨酸缓冲剂，约228mM蔗糖，约0.032mg/mL依地酸二钠，约0.19mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.75。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：约10mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约20mM组氨酸缓冲剂，约240mM蔗糖，约0.033mg/mL依地酸二钠，约0.2mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.8。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：约14mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，约22mM的组氨酸缓冲剂，约243mM蔗糖，约0.043mg/mL依地酸二钠，约0.26mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.87。

在一些实施方案中，液体制剂包含以下组分：约15mg/mL的抗CTLA-4抗体或其片段，约23mM组氨酸缓冲剂，约250mM蔗糖，约0.05mg/mL的依地酸二钠，约0.3mg/mL聚山梨酯80，水；液体制剂的pH值为约5.9。

在一些实施方案中，所述液体制剂含的水为无菌水或注射用水。

在一些实施方案中，与CTLA-4相关疾病包括癌症或用于排斥可移植的肿瘤。在一些实施方案中，与CTLA-4相关疾病为黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，***癌，淋巴瘤或肾癌。

在一些实施方案中，所述液体制剂的给药方式可以为注射、输液；给药的部位为肠外、静脉、黏膜、舌下、肌肉、皮内、鼻腔、腹腔、动脉内或皮下。

在一些实施方案中，采用等渗溶液(如0.9％注射用NaCl溶液)对所述含抗CTLA-4抗体的溶液进行稀释，经稀释后随即以静脉输注的方式给药。在一些实施方案中，采用等渗溶液(如0.9％注射用NaCl溶液)对所述含10mg/mL抗CTLA-4抗体的溶液进行稀释，经稀释后随即以静脉输注的方式给药。在一些实施方案中，稀释后抗CTLA-4抗体的浓度为约0.05mg/mL-约5mg/mL或约0.5mg/mL-约1mg/mL。在一些实施方案中，稀释后抗CTLA-4抗体的浓度为约0.05mg/mL、约0.07mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.5mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约1.7mg/mL、约2.4mg/mL、约2.9mg/mL、约3.1mg/mL、约3.8mg/mL、4.1mg/mL、约4.6mg/mL或约5mg/mL。

在一些实施方案中，有效量可为0.1-100mg/每kg患者体重。在一些实施方案中，有效量为0.1-20mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约2mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约3mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约10mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约20mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约30mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约50mg/每kg患者体重。在另一些实施方案中，有效量为约100mg/每kg患者体重。在一些实施方案中，可根据需要每日、每周、每月和/或每年以每小时/天/周/月单次或多次给予患者有效量的抗CTLA-4抗体或其片段。

本发明另一方面提供了所述液体制剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配置缓冲液，无菌过滤；

(2)通过UF/DF超滤，采用步骤(1)制备的缓冲液对抗体进行超滤换液，然后进行浓缩，得到抗体浓缩物；

(3)配制含有缓冲剂、稳定剂、表面活性剂和螯合剂的辅料母液，调节到合适的pH值；将无菌过滤后的辅料母液添加到步骤(2)制备的抗体浓缩物中，得到液体制剂。

实施例

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

抗CTLA-4抗体的制备

本发明抗CTLA-4抗体为单克隆抗体1，其采用基因工程技术由CHO-BAT-KF细胞表达(参照Wood et al.(1990),J Immunol.145:3011)，并且通过一系列的层析步骤纯化所得。单克隆抗体1为全人源IgG，分子量为148kDa，其每条重链含有448个氨基酸，分子量为51kDa，每条轻链含有215个氨基酸，分子量为23kDa；另外，本发明单克隆抗体2也是采用基因工程技术由CHO细胞(CHO细胞未除α-(1,6)-岩藻糖转移酶)表达。单克隆抗体1和单克隆抗体2的氨基酸序列完全相同，氨基酸序列见表1。对表达后的单克隆抗体1和单克隆抗体2进行检测，单克隆抗体1和单克隆抗体2的重链如SEQ ID NO:3所示，轻链如SEQ ID NO:4所示。

对单克隆抗体1和单克隆抗体2进行糖型检测分析，测定结果见表2。

表1抗CTLA-4抗体的氨基酸序列

表2部分糖型百分含量

抗CTLA-4全人源抗体的体外结合活性研究

在BIAcore上进行了单克隆抗体1、单克隆抗体2与CTLA-4-His抗原(义翘神州)体外结合活性的检测。将待测的单克隆抗体1、单克隆抗体2用HBS-EP稀释至5μg/mL，抗原CTLA-4-His用HBS-EP稀释至100nM，并以此为起始浓度作2倍梯度稀释，得100、50、25、12.5、6.25、3.125nM的CTLA-4-His稀释液。用Protein A芯片进行检测，5μg/ml药物稀释液以10μL/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获15s使捕获量约为600RU；之后流速调为30μL/min，依次进分析物不同浓度的CTLA-4-His稀释液(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间180s，解离时间600s，最后进Glycine 1.5缓冲液60s对芯片进行再生并进入下一个循环。用数据分析软件EvaluationSoftware3.1对实验结果进行分析，得出各抗体样品对CTLA-4亲和结合的动力学参数，见表3。

表3抗CTLA-4抗体与CTLA-4亲和结合的动力学参数

样品	k<sub>a</sub>(1/Ms)	k<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
				单克隆抗体2	1.04e+05	1.03e-03	9.89e-09
单克隆抗体1	7.61e+04	8.9e-04	1.17e-08

注：k_a：结合速率；k_d：解离速率；K_D：结合解离平衡常数，也即亲和力。

如表3所示，本发明单克隆抗体1进行ADCC效应的增强后(去岩藻糖)，并没有改变其与CTLA-4抗原的结合能力。

抗CTLA-4抗体的抗肿瘤药效

将MC38细胞以5×10⁵个/0.1mL浓度接种于B-hCTLA4人源化雌性小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到约124mm³时按肿瘤体积随机分组，每组8只，分别为：G1组(IgG，1mg/kg)、G2组(单克隆抗体1，0.1mg/kg)、G3组(单克隆抗体1，0.3mg/kg)。所有组给药途径均为腹腔注射，每3天给药1次，连续给药6次，末次给药28天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照，计算相对肿瘤抑制率(TGI％)。

整个实验过程中，所有实验动物在给药期间活动和进食状态良好，实验动物体重均有一定程度的上升。单克隆抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠体重的影响见表4，单克隆抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠肿瘤体积的影响见表5。

表4抗CTLA-4抗体对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠体重的影响

注：a：平均数±标准误；b：给药组体重与溶剂对照组体重在给药25天后统计学比较，t-test。

表5抗CTLA-4抗体对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠肿瘤体积的影响

如表4和表5所示，本发明单克隆抗体1在各个给药浓度下均有显著抑制肿瘤生长的效果；在发挥抗肿瘤生长作用的同时，单克隆抗体1未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。

制剂制备

配置缓冲液，通过UF/DF超滤采用过滤后的缓冲液对抗体溶液进行超滤换液，然后进行浓缩得到抗体浓缩物；按照配方比例配制适当的含有缓冲剂和/或稳定剂和/或表面活性剂和/或螯合剂的辅料母液，调节到合适的pH值；将适当量的无菌过滤后的辅料母液添加到适当量的抗体浓缩物中，得到液体制剂。实施例中采用的溶剂为注射用水。

缓冲剂筛选

采用多种缓冲剂体系进行抗体稳定性研究。鉴于抗CTLA-4抗体的性质，本发明初步筛选后确定以下多种缓冲剂体系：His、HAC、CB、Sua、Tris。

上述各英文缩写的含义：

His：20mM组氨酸缓冲剂，pH 5.8；

HAc：20mM醋酸缓冲剂，pH 5.8；

CB：20mM柠檬酸缓冲剂，pH 5.8；

Sua：20mM琥珀酸缓冲剂，pH 5.8；

Tris：20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH 7.0。

进行稳定性实验的抗体-缓冲剂体系中，His、HAC、CB、Sua所含有的单克隆抗体1为10mg/mL，缓冲剂为20mM，缓冲液的pH值为5.8。研究各种配方在高温40℃的条件下放置4周，单体纯度(SEC-HPLC，简称SEC)和电荷异构体(IEC-HPLC，简称IEC)变化的趋势，见表6。

表6缓冲剂筛选

根据以上实验结果，组氨酸缓冲剂为最优缓冲剂，醋酸缓冲剂次之，Tris缓冲剂较差：组氨酸缓冲液中SEC-HPLC单体纯度和IEC-HPLC主峰含量都高于其他缓冲体系。可见，组氨酸缓冲液对单克隆抗体1的保护作用最优。

pH范围初步筛选

进行pH范围筛选的体系中，所含有的抗体、缓冲剂见表7。

表7pH范围筛选

根据以上结果，当抗体加入缓冲液高温(40℃)测试中(缓冲液中未加入其他成分)，当缓冲体系是pH值为5.5-6.5(不包括6.5)的组氨酸缓冲液时，其SEC-HPLC聚体和IEC-HPLC酸峰含量相对较低，SEC-HPLC单体纯度和IEC-HPLC主峰含量相对较高。

pH精细筛选

在组氨酸缓冲体系中进行pH范围精细筛选，各体系中所含有的抗体、缓冲液、稳定剂、金属离子螯合剂、表面活性剂见表8；82mg/mL蔗糖的摩尔浓度为240mM。

表8pH精细筛选

根据以上结果，当单克隆抗体1中加入的缓冲液中还加入稳定剂、金属离子螯合剂、表面活性剂时，当缓冲体系是pH值为5.4-6.2的组氨酸缓冲液时，其稳定性较好，以pH值为5.8更好。

表面活性剂振荡稳定性研究

进行表面活性剂筛选的体系中，所含有的抗体、缓冲液、稳定剂、金属离子螯合剂、表面活性剂，见表9。

在抗体制剂中，在剧烈的振荡下，容易发生聚集，产生不溶性颗粒，可以通过添加一定量的表面活性剂来防止。在本实验中，向含有缓冲液、稳定剂、金属离子螯合剂的配方中分别添加0.1mg/mL聚山梨酯20、0.2mg/mL聚山梨酯20、0.4mg/mL聚山梨酯20、0.1mg/mL聚山梨酯80、0.2mg/mL聚山梨酯80、0.4mg/mL聚山梨酯80，观察在振荡72h后样品的质量与浊度。实验条件：把不同表面活性剂组合的制剂，在200rpm下，平放，常温振荡72h，在振荡0h及72h检测溶液性状、SEC、IEC、浊度，结果见表9。

表9表面活性剂筛选

结果显示，在振荡的过程中，加入的0.1-0.4mg/mL聚山梨酯20或聚山梨酯80表面活性剂都能对抗体蛋白起到保护作用，浊度没有明显变化。

液体制剂配方

本发明液体制剂能够稳定保存活性成分单克隆抗体1，稳定性较好的制剂配方如本发明液体制剂A、B、C、D、E、F、G、H、I；其中，J制剂作为对比制剂，如下表。

表10A液体制剂A配方

表10B液体制剂B配方

表10C液体制剂C配方

表10D液体制剂D配方

表10E液体制剂E配方

表10F液体制剂F配方

表10G液体制剂G配方

表10H液体制剂H配方

表10I液体制剂I配方

表10J液体制剂J配方

冻融实验

在抗体制剂中，经过冷冻/复融循环时，容易产生不溶性颗粒，可以通过添加稳定剂、表面活性剂来稳定抗体。本发明液体制剂B的反复冻融结果见表11。

表11液体制剂B的冻融实验结果

结果表明，本发明液体制剂B从-80℃冻结，37℃解冻，反复冻融五次，澄清度、颜色、不溶性微粒、SEC-HPLC、IEC-HPLC均没有明显变化，说明该制剂在反复冻融实验中性质稳定，无析出物，不影响单克隆抗体1的性状。

加速稳定性研究

将上述制剂A、制剂B、制剂C、制剂D、制剂E、制剂F、制剂G、制剂H、制剂I和制剂J放置于恒温箱中，在25±2℃的条件下放置6个月，分别于第0、2、3、6个月末取样。按稳定性重点考察项目进行检测，考察单克隆抗体1的单体纯度(SEC-HPLC)、电荷异构体(IEC-HPLC)、非还原毛细管凝胶电泳(CE-SDS(NR))，见表12、表13。

表12加速稳定性研究的SEC-HPLC结果

表13加速稳定性研究的IEC-HPLC结果

结果表明，制剂J在SEC-HPLC中，主峰下降较其他制剂快，表现为聚体的增加；IEC-HPLC主峰下降迅速，表现为酸峰的快速增加；这意味着对比制剂J不能稳定地保存单克隆抗体1，而本发明制剂A-I能稳定地保存单克隆抗体1，尤其是本发明制剂B。

相容性检测

通过加速稳定性实验以及长期稳定性实验，得出本发明液体制剂与药瓶和胶塞具有良好的相容性，符合包装的要求。

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 抗CTLA-4抗体制剂及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种液体制剂，其特征在于，包含以下组分：

(1)5-40mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，

(2)10-30mM缓冲剂，

(3)200-260mM稳定剂，

(4)0.02-0.2mg/mL螯合剂，

(5)0.1-0.4mg/mL表面活性剂，

(6)水；

液体制剂的pH值为5.4-6.2。

2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂选自组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂中的至少一种，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖和甘露醇中的至少一种，所述螯合剂包含依地酸二钠，所述表面活性剂选自聚山梨酯20和聚山梨酯80中的至少一种。

3.如权利要求1或2所述的液体制剂，其特征在于，所述抗CTLA-4抗体或其片段的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述抗CTLA-4抗体或其片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3任一项所述的液体制剂，其特征在于，所述抗CTLA-4抗体或其片段为单克隆抗体，所述抗CTLA-4抗体或其片段中岩藻糖基化水平≤5％，高甘露糖糖型总量<5％，唾液酸化糖型总量<3％。

5.如权利要求1-4任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含7-15mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段。

6.如权利要求1-5任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含17-23mM组氨酸缓冲剂。

7.如权利要求1-6任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含220-250mM蔗糖。

8.如权利要求1-7任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含0.02-0.05mg/mL依地酸二钠。

9.如权利要求1-8任一项所述的液体制剂，其特征在于，液体制剂包含0.1-0.3mg/mL聚山梨酯80。

10.一种液体制剂，其特征在于，包含以下组分：

(1)10mg/mL抗CTLA-4抗体或其片段，

(2)20mM组氨酸缓冲剂，

(3)240mM蔗糖，

(4)0.033mg/mL依地酸二钠，

(5)0.2mg/mL聚山梨酯80，

(6)水；

液体制剂的pH值为5.8。