CN112662794A - 玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测技术领域，公开了一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒，包括：正向引物SEQIDNO：1；反向引物SEQIDNO：2；以及探针SEQIDNO：3。试剂盒构建方法包括：利用NA培养基活化菌株，接种环刮板收集菌体，提取细菌DNA，核酸测定仪验证提取效果，于‑20℃保存备用；进行引物探针设计与合成，进行引物筛选与体系建立并进行验证；验证荧光RAA检测方法的特异性；模拟样品及真实样品检测效果验证，即可得玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。本发明反应快速，所用时间仅为20min，特异性强且灵敏度高，并通过了实际样品与模拟样品检测验证。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
背景技术
目前，密执安棒形杆菌内布拉斯加亚种引起玉米内州萎蔫病，可导致玉米高达44％的损失，是玉米上重要的细菌性病原物，也是我国重点关注的检疫性病原物。Cmn首先在美国内布拉斯加州中部发现，后逐步扩展至美国多州和加拿大部分地区，我国尚未有报道。Cmn主要通过种子传带进行远距离传播，利用GRAP模型预测显示，在我国大部分玉米种植区均适合定植。尽管我国玉米产量连续多年稳定在2亿吨以上，但随着国内工业消费需求及饲料消费需求激增，每年仍需大量进口玉米。随着玉米进口贸易的发展，Cmn传入中国风险剧增，一旦入侵将严重威胁我国玉米生产，影响我国粮食生产安全。因此，建立并掌握一种准确、快速的检测方法对于有效监控Cmn扩散情况至关重要。
目前，针对Cmn的检测主要集中在传统分离培养、酶联免疫检测及常规分子生物学检测上。分离培养及血清学检测耗时较长、操作复杂且灵敏性较低，难以满足现场快速检测要求。以聚合酶链式反应为基础发展起来的传统分子生物学检测方法，包括普通PCR、巢氏PCR、实时荧光PCR方法等，均需经过变性-退火-延伸等变温过程，控温严格，故需要特定仪器支持且耗时较长，不利于现场实验室快速检测。环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是目前应用比较广泛的体外恒温扩增技术，该技术利用Bst DNA聚合酶，通过4-6条引物的链替换反应产生互补序列，实现恒温(60～65℃)条件下DNA扩增。玉米内州萎蔫病菌LAMP检测方法的建立，实现了恒温条件下快速检测Cmn，该方法具备特异性强、灵敏度高等优点，且通过实际样品验证，可用于现场玉米样品的检测。但该方法所得产物为大小不一的一系列条带，无法进行克隆、测序，检测结果无法进一步验证。重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)有效克服这一“缺点”，该技术在恒温条件下可实现目的片段的指数级扩增，产物为单一序列条带。RAA使用从细菌或真菌中提取的重组酶，通过恒温条件下重组酶与引物DNA结合成聚合体，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding,SSB)的帮助下使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的互补链，整个反应过程仅需20min便可完成。利用RAA技术进行细菌、病毒、支原体等病原微生物检测，具有快速、灵敏、特异等优点，是目前进行检测研究的热点。Tambong James T等通过基因组分析等方法，筛选出纤维素酶基因部分序列可以作为靶标序列进行玉米内州萎蔫病菌的分子生物学鉴定。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：分离培养及血清学检测耗时较长、操作复杂且灵敏性较低；传统分子生物学检测方法要求严格控温，需要特定仪器支持，耗时较长；LAMP检测方法产物为大小不等一系列条带，无法对结果进行克隆测序等进一步验证。
解决以上问题及缺陷的难度为：RAA技术可以实现39℃恒温条件下，20min快速完成检测反应，操作简便、反应迅速；难点为靶标序列筛选及引物设计。
解决以上问题及缺陷的意义为：建立一种体外恒温条件下快速检测玉米内州萎蔫病菌的检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
本发明是这样实现的，一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒包括：
正向引物SEQ ID NO：1；反向引物SEQ ID NO：2；以及探针SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种构建所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法包括：
步骤一，利用NA培养基活化菌株，接种环刮板收集菌体，提取细菌DNA，核酸测定仪验证提取效果，于-20℃保存备用；
步骤二，进行引物探针设计与合成，进行引物筛选与体系建立；利用灭菌ddH2O将确定的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度；
步骤三，验证荧光RAA检测方法的特异性；模拟样品及真实样品检测效果验证，即可得玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
进一步，步骤一中，所述菌株活化包括：于28℃，活化48h。
进一步，步骤二中，所述进行引物探针设计与合成包括：
(1)分析C.michiganensis近缘亚种间纤维素酶基因序列差异，选取CelB序列为模板设计引物和探针；
(2)参照Genbank序列HE614873，设计引物cmn1、cmn2扩增靶标序列，利用BLAST将cmn1/cmn2序列与全数据库序列比对，确定引物组合是否100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配；
(3)若引物组合100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配，则以Cmn DNA为模板，利用引物cmn1/cmn2扩增目的序列，并将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序；
(4)参照RAA原理，设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。
进一步，步骤(3)中，所述扩增包括：
反应体系为50μL体系，包括：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25μL，10μM的(cmn1/cmn2)2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL；
扩增条件为94℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min下。
进一步，步骤二中，所述进行引物筛选包括：
提取Cmn DNA，以灭菌ddH2O进行10倍等梯度稀释，随机选取引物组合，分别以不同浓度的Cmn DNA为模板，进行荧光RAA检测，确定荧光RAA对Cmn最低检测浓度；以最低检测浓度DNA为模板，首先以上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物1R、2R、3R、4R组合，进行荧光RAA检测，筛选出扩增效率最高的正向引物、反向引物和引物组合；其次将筛选出的正向引物、5F、6F、7F分别与筛选的反向引物、5R、6R、7R组合，探索扩增效率最高的引物组合；最后比较分析筛选出的引物组合，筛选出稳定性好、扩增效率高的引物组合。
进一步，所述梯度浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6ng/μL。
进一步，步骤二中，所述体系建立包括：
反应体系：缓冲液ABuffer40.9μL，B Buffer 2.5μL，上游引物和下游引物各2.0μL(10mM)，荧光探针0.6μL(10mM)，DNA模板2.0μL；
扩增条件：39℃30s，共40个循环。
进一步，步骤三中，所述验证荧光RAA检测方法的特异性包括：
提取Cmm，Cmi，Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz的DNA，并测定浓度，以11株参考菌株DNA为模板，不同浓度的Cmn DNA为阳性对照，灭菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测，验证荧光RAA检测方法的特异性。
进一步，步骤三中，所述模拟样品及真实样品检测效果验证包括：
1)利用灭菌ddH2O将1.2.1收集的Cmn菌体混匀，制备菌悬液；利用涂板法，测定菌悬液浓度为5.7×105cfu/mL；
2)筛选经玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法检测结果为阴性的进境饲用样本，磨成粉状分成4份，每份10g；
3)将制备好的菌悬液加入研磨样品中，混匀制备成阳性模拟样本；
4)采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取4个阳性模拟样本和24个真实玉米样本DNA，进行荧光RAA检测；同时，以GB/T 36840-2018：玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法复核验证。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒在玉米内州萎蔫病菌检测中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用荧光RAA技术，以玉米内州萎蔫病菌CelB序列为模板，设计并筛选引物、探针，构建玉米内州萎蔫病菌荧光RAA快速检测方法。
本发明针对玉米内州萎蔫病菌CelB序列片段设计引物和探针，通过引物筛选、特异性验证和灵敏性测定等实验，建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法。本发明反应快速，所用时间仅为20min，特异性强且灵敏度高达130fg/μL，并通过了实际样品与模拟样品检测验证。荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏、简便，满足现场准确、快速检测要求，可为有效监测玉米内州萎蔫病菌提供新思路。本发明分析比较Cmn及其近缘亚种纤维素酶基因序列，筛选出Cmn保守序列作为靶标序列，利用荧光RAA技术，设计并筛选引物、探针，构建玉米内州萎蔫病菌荧光RAA快速检测方法。
本发明建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法与LAMP检测方法相比，荧光RAA检测既有恒温、灵敏、特异的优势，同时更简便、更快速，RAA只需要一对引物，便可20min实现特定片段的扩增，且产物为单一条带。通过与荧光探针的结合，RAA技术可实现扩增过程的动态监控，进行定量检测。本发明尝试利用模板DNA 10倍梯度稀释液进行荧光RAA定量检测研究，以模板LOG浓度为横坐标、相对荧光强度△Rn>20000的循环数为纵坐标建立标准曲线，显示：当选取样本浓度为26.1、2.6、2.6×10-1ng/μL的数据进行拟合标准曲线，可得标准曲线y＝-3.5x+21.792(R2＝0.9932)，但随着选取样本浓度的降低，拟合的标准曲线可信度R2<0.95，分析原因或与模板梯度稀释不够均匀有关，有必要制备标准质粒进行荧光RAA定量检测研究。
本发明利用RAA扩增技术进行玉米内州萎蔫病菌的检测，按照RAA原理设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。利用不同引物组合进行荧光RAA检测实验，发现：尽管所尝试引物组合都能扩增，但扩增效率差异显著(图2-图4)。分析原因，或与RAA利用引物与重组酶蛋白结合成二聚体原理有关，不同引物序列与重组酶蛋白结合效率不同。因此，有必要进一步研究RAA中引物与重组酶蛋白之间的结合机制，以指导引物设计，提高效率。
本发明筛选出引物组合，结合探针P建立的荧光RAA检测方法可在20min内检出玉米内州萎蔫病菌。引物特异性检测结果表明，两不同浓度的玉米内州萎蔫病菌表现明显扩增现象为阳性，包括2株近似亚种的其它11株对照菌株无明显扩增现象为阴性，表明荧光RAA检测方法的特异性强。荧光RAA检测方法对玉米内州萎蔫病菌DNA的检测灵敏度为130fg/μL，比LAMP检测方法50fg灵敏度稍低。荧光RAA检测模拟玉米样本和真实玉米样本，检测结果与参照国家标准GB/T 36840-2018：玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法一致。表明建立的荧光RAA检测方法快速、灵敏、特异，适用于现场实验室快速检测玉米内州萎蔫病菌。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的正向引物1F，2F，3F，4F与1R，2R，3R，4R组合40循环后相对荧光强度示意图。
图3是本发明实施例提供的正向引物2F，5F，6F，7F与4R，5R，6R，7R组合40循环后相对荧光强度示意图。
图4是本发明实施例提供的正向引物2F与3R，4R，6R组合40循环后相对荧光强度示意图。
图5是本发明实施例提供的引物1F/1R荧光RAA灵敏性检测结果示意图。
图6是本发明实施例提供的引物2F/6R荧光RAA灵敏性检测结果示意图。
图7是本发明实施例提供的荧光RAA特异性实验示意图。
图8是本发明实施例提供的多序列分析及引物、探针位置示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒包括：
正向引物SEQ ID NO：1：gttactggtgaatgtgagcacggggttgc；
反向引物SEQ ID NO：2：cacgtctgagctcgtcatcactgcgaagt；
以及探针SEQ ID NO：3：acgtgatgcggctcgacgccacggtgcact[FAM-dT]c[THF][dT-BHQ1]gccccagctgttcg-block。
靶标序列SEQ ID NO：4为：
TGCTCGATCTTAACCGCGACCCCACGAGGAAGCGGCGCCGGCCACCGAGCGGGATGCGCTCGACGGCCGACGCCGCGGATGATGGGCGGGAGCCCTGGTCAGTTACTGGTGAATGTGAGCACGGGGTTGCTCGGAGCCTGAGTTCCCGCGACGTTCAGACCGACGTGCATGGTCTGTCCGGCCGGGATCTTGGCGGCCCAGCCATCACCGGTGCACGTGATGCGGCTCGACGCCACGGTGCACTTCATGCCCCAGCTGTTCGTGACAGCCGTGATTCCGGGGCTGTCCCAGGAGACCGTCCAACTCGACACCGCGGACTTCGCAGTGATGACGAGCTCAG ACGTGTAGCCCGTGGGCCACGATCCGTCCAGCTTGTA
如图1所示，本发明实施例提供的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法包括：
S101，利用NA培养基活化菌株，接种环刮板收集菌体，提取细菌DNA，核酸测定仪验证提取效果，于-20℃保存备用；
S102，进行引物探针设计与合成，进行引物筛选与体系建立；利用灭菌ddH2O将确定的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度；
S103，验证荧光RAA检测方法的特异性；模拟样品及真实样品检测效果验证，即可得玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
步骤S101中，本发明实施例提供的菌株活化包括：于28℃，活化48h。
步骤S102中，本发明实施例提供的进行引物探针设计与合成包括：
分析C.michiganensis近缘亚种间纤维素酶基因序列差异，选取CelB序列为模板设计引物和探针；参照Genbank序列HE614873，设计引物cmn1、cmn2扩增靶标序列，利用BLAST将cmn1/cmn2序列与全数据库序列比对，确定引物组合是否100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配；若引物组合100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配，则以CmnDNA为模板，利用引物cmn1/cmn2扩增目的序列，并将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序；参照RAA原理，设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。
本发明实施例提供的扩增包括：
反应体系为50μL体系，包括：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25μL，10μM的(cmn1/cmn2)2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL；
扩增条件为94℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min下。
步骤S102中，本发明实施例提供的进行引物筛选包括：
提取Cmn DNA，以灭菌ddH2O进行10倍等梯度稀释，随机选取引物组合，分别以不同浓度的Cmn DNA为模板，进行荧光RAA检测，确定荧光RAA对Cmn最低检测浓度；以最低检测浓度DNA为模板，首先以上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物1R、2R、3R、4R组合，进行荧光RAA检测，筛选出扩增效率最高的正向引物、反向引物和引物组合；其次将筛选出的正向引物5F、6F、7F分别与筛选的反向引物5R、6R、7R组合，探索扩增效率最高的引物组合；最后比较分析筛选出的引物组合，筛选出稳定性好、扩增效率高的引物组合。
本发明实施例提供的梯度浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6ng/μL。
步骤S102中，本发明实施例提供的体系建立包括：
反应体系：缓冲液ABuffer40.9μL，B Buffer 2.5μL，上游引物和下游引物各2.0μL(10mM)，荧光探针0.6μL(10mM)，DNA模板2.0μL；
扩增条件：39℃30s，共40个循环。
步骤S103中，本发明实施例提供的验证荧光RAA检测方法的特异性包括：
提取Cmm，Cmi，Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz的DNA，并测定浓度，以11株参考菌株DNA为模板，不同浓度的Cmn DNA为阳性对照，灭菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测，验证荧光RAA检测方法的特异性。
步骤S103中，本发明实施例提供的模拟样品及真实样品检测效果验证包括：
利用灭菌ddH2O将1.2.1收集的Cmn菌体混匀，制备菌悬液；利用涂板法，测定菌悬液浓度为5.7×105cfu/mL；筛选经玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法检测结果为阴性的进境饲用样本，磨成粉状分成4份，每份10g；将制备好的菌悬液加入研磨样品中，混匀制备成阳性模拟样本；采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取4个阳性模拟样本和24个真实玉米样本DNA，进行荧光RAA检测；同时，以玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法复核验证。
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
实施例1：
1材料与方法
1.1试验材料
收集2018-2019年从舟山口岸进境的饲用玉米，共计24个样品，每个样品2kg，备用。供试菌株共12株，其中玉米内周萎蔫病菌(Clavibacter michiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)、玉米细菌性枯萎病菌菌株(Pantoea.stewartiisubsp.stewarii，Pss)为ATCC标准菌株，编号分别为ATCC 27794、ATCC 29229，由杭州海关综合技术服务中心赠送；丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.syringae，Pssy)、砖红色微杆菌(Microbacterium testaceum，Mt)、密执安棍状杆菌诡谲亚种(Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus，Cmi)、密执安棍状杆菌密执安(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)、黄单胞菌(Xanthomonasoryzae，Xo)为本实验室保存，伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis，Ba)、玉米迪克氏菌(Dickeya zeae，Dz)、欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi var.zea，Ecz)成团泛菌(Pantoea agglomeran，Pag)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis，Pan)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
主要仪器和试剂：实时荧光PCR仪(美国应用生物***公司，ABI7500)；荧光RAA试剂盒(杭州众测生物技术有限公司，S002ZC)、TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0(宝生物工程(大连)有限公司，9763)、新型植物基因组DNA提取试剂盒(根生化科技(北京)有限公司，DP320)、2×TaqPCR StarMix with Loading Dye(GenStar-康润生物，A012)。
1.2方法
1.2.1DNA提取与验证
利用NA培养基活化菌株(28℃，48h)，接种环刮板收集菌体。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，核酸测定仪(Nanodrop 2000)验证提取效果，-20℃保存备用。
1.2.2CelB序列筛选、引物探针设计与合成
从NCBI数据库中下载Cmn菌株NCPPB2581全基因组序列(序列号：HE614873)，筛选出纤维素酶基因序列，对应碱基2525339nt-2525973nt，利用BLAST分析Cmn纤维素酶基因序列与其它C.michiganensis近缘亚种间序列差异(序列信息见表1)，筛选出CelB序列。
表1实验所用基因序列
Table 1Genome sequences of bacterial strains used in this study
a：以Cmn菌株NCPPB2581纤维素酶基因序列为参考序列进行Blast分析；
a:Chose the cellular gene sequence of NCPPB2581 strain as referencesequence to Blast analysis
以菌株NCPPB2581全基因组序列为靶标，利用Primer premier 5.0设计引物cmn1：TGCTCGATCTTAACCGCGAC；cmn2：TACAAGCTGGACGGATCGTG，分别对应基因组2525241nt、2525598nt。利用BLAST将Cmn1/cmn2序列与全数据库序列比对，显示：引物组合与Cmn菌株7580(CP033722)HF4(CP033722)61-1(CP033722)NCPPB2581(HE614873)匹配率为100％，产物大小均为377bp，与其他序列数据无匹配现象。
以Cmn DNA为模板，利用引物cmn1/cmn2扩增目的序列。反应体系为50μL体系：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25μL，cmn1/cmn2(10μM)各2μL，DNA模板2μL，ddH2O19μL。扩增条件：94℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min下。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序。应用MEGA6.06对测序的CelB序列和C.michiganensis亚种间序列(序列信息见表1)进行多重比对，分析序列间差异。
以CelB靶标序列为模板，参照RAA引物、探针设计原理，设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P，并利用Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHom e)与全基因数据库序列比对验证引物、探针特异性。引物、探针序列信息见表2、图1。本实验靶标序列克隆、测序，引物、探针的合成均由生物工程技术(上海)有限公司完成。
表2荧光RAA引物、探针
注：FAM：6-羧基荧光素；BHQ：荧光淬灭基团；THF：四氢呋喃
Note：FAM：6-Carboxyfluorescein；BHQ：Black hole quencher；THF:Tetrahydrofuran；
1.1.1引物筛选与体系建立
荧光RAA检测采用试剂盒推荐反应体系和反应程序。反应体系：缓冲液ABuffer40.9μL，B Buffer 2.5μL，上游引物和下游引物各2.0μL(10mM)，荧光探针0.6μL(10mM)，DNA模板2.0μL。扩增条件：39℃30s，共40个循。
按照方法1.2.1提取Cmn DNA(26.1ng/μL)，以灭菌ddH2O进行10倍等梯度稀释，梯度浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10- 6ng/μL。随机选取引物组合，分别以不同浓度的Cmn DNA为模板，进行荧光RAA检测，初步探索荧光RAA对Cmn最低检测浓度。
以最低检测浓度DNA为模板，首先以上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物1R、2R、3R、4R组合，进行荧光RAA检测，筛选出扩增效率最高的正向引物、反向引物和引物组合；其次将筛选出的正向引物、5F、6F、7F分别与筛选的反向引物、5R、6R、7R组合，探索扩增效率最高的引物组合；最后比较分析筛选出的引物组合，筛选出稳定性好、扩增效率高的引物组合。
1.1.2灵敏性测定、特异性验证
利用灭菌ddH2O将初步探索的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度。
按照方法1.2.1提取Cmm，Cmi，Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz的DNA，以11株参考菌株DNA为模板，不同浓度的Cmn DNA(Cmn-1、Cmn-2)为阳性对照，灭菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测，验证荧光RAA检测方法的特异性。
1.1.3模拟样品及真实样品检测效果验证
利用灭菌ddH2O将1.2.1收集的Cmn菌体混匀，制备菌悬液。利用涂板法，测定菌悬液浓度为5.7×105cfu/mL。筛选经GB/T 36840-2018：玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法检测结果为阴性的进境饲用样本(编号1-3103304)，磨成粉状分成4份，每份10g。将制备好的菌悬液加入研磨样品中，混匀制备成阳性模拟样本。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取4个阳性模拟样本和24个真实玉米样本DNA，进行荧光RAA检测。同时，以GB/T 36840-2018检测方法复核验证。
2结果与分析
2.1引物、探针序列分析
以Cmn菌株NCPPB2581纤维素酶基因序列为参考序列，经BLAST分析结果(表1)显示：纤维素酶基因部分序列(CelB序列，2525339nt-2525815nt)与C.michiganensis其它亚种基因组序列的一致性仅有70％左右，相比其它纤维素酶基因序列(2526816nt-2525973nt)与C.michiganensis亚种基因组序列一致性在82.46-84.55％之间，Cmn菌株CelB序列差异更大，同时CelB序列在Cmn不同菌株间具有高保守性，一致性均在95％以上。故，选取Cmn菌株NCPPB2581纤维素酶基因部分序列CelB序列，对应碱基2525339nt-2525815nt为目标序列进行荧光RAA引物、探针设计。
利用引物cmn1/cmn2经PCR扩增、克隆测序获取片段大小为377bp序列。BLAST分析序列，显示：该序列与Cmn序列NCPPB 2581(HE614873)、61-1(CP033723)、7580(CP033722)、HF4(CP033721)一致性100％，与C.michiganensis近似亚种(Cmi，Cmm，Cmc，Cms)一致性只有不到70％。利用MEGA 6.06对测序靶标序列与表2中C.michiganensis亚种基因组序列进行比对分析，结果(图8)显示，测序靶标序列中的CelB序列(部分)在不同株系Cmn中具有高保守性，与近缘亚种间存在明显基因位点差异，可以作为鉴定Cmn的特异性序列片段。
将设计的荧光RAA探针P序列经Primer-Blast与全数据库序列比对，分析显示：探针P对Cmn菌株NCPPB 2581(HE614873)、61-1(CP033723)、7580(CP033722)、HF4(CP033721)识别率和覆盖率均为100％，对数据库其他序列数据无识别现象；将设计的正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F和反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R组合分别与数据库序列比对，分析结果显示，所有引物组合均对Cmn菌株NCPPB 2581(HE614873)、61-1(CP033723)、7580(CP033722)、HF4(CP033721)100％识别。例：引物1F、1R分别对应菌株NCPPB 2581(HE614873)2525335nt、2525547nt，对应菌株7580(CP033722)2525691nt、2525903nt，对应菌株61-1(CP033723)2525698nt、2525910nt，对应菌株HF4(CP033721)2526093nt、2526305nt，产物大小均为213bp，对其他序列数据无识别现象；引物2F、6R分别对应菌株NCPPB 2581(HE614873)2525342nt、2525585nt，对应菌株7580(CP033722)2525696nt、2525939nt，对应菌株61-1(CP033723)2525703nt、2525946nt，对应菌株HF4(CP033721)2526098nt、2526341nt，产物大小均为244bp，对其他序列数据无识别现象。
2.2荧光RAA体系建立
选取引物组合1F1R，分别以不同浓度的Cmn DNA进行荧光RAA检测，结果：浓度为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4ng/μL的Cmn DNA，经荧光RAA检测均呈现典型的扩增曲线，而浓度为2.6×10-5ng/μL的Cmn未有典型曲线。故，以引物组合R1F1的荧光RAA最低检测浓度为2.6×10-4ng/μL。
以浓度为2.6×10-4ng/μL的Cmn DNA为模板，上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物R1、R2、R3、R4组合，分别进行荧光RAA检测，结果(图2至图4)显示：同一反向引物与不同正向引物组合中，与引物2F组合的扩增效率比与1F、3F、4F组合的扩增效率都高，例：引物2F1R荧光RAA 40循环相对荧光强度△Rn为339522.9，远大于1F1R(△Rn＝248390.3)、3F1R(△Rn＝153493.6)、4F1R(△Rn＝293477.5)，故：选取2F作为最佳正向引物；同一正向引物与不同反向引物组合中，没有一明确反向引物在与正向引物组合中扩增效率均为最高，例：与1F组合效率最高的是1R(△Rn＝248390.3)，与2F组合效率最高的是3R(△Rn＝465121.7)，与3F组合效率最高的是4R(△Rn＝275858.6)，与，4F组合效率最高的是3R(△Rn＝349036.5)，但反向引物4R与不同正向引物组合扩增效率表现最稳定，故选取4R作为最佳反向引物；考虑引物组合扩增效率，2F/3R(△Rn＝465121.7)、2F/4R(△Rn＝405603.0)引物组合扩增效率最高。
将正向引物2F、5F、6F、7F分别与4R、5R、6R、7R组合，2.6×10-4ng/μL的Cmn DNA为模板进行荧光RAA检测，结果显示2F/6R(△Rn＝282768.9)组合扩增效率远远大于其他引物组合扩增效率。分别以引物组合2F/3R、2F/4R、2F/6R进行荧光RAA检测实验，每个样本四个重复，分析比较不同引物组合的扩增效率及稳定性。结果表明：引物组合2F/6R(△Rn＝314051.0)扩增效率高于引物组合2F/3R(△Rn＝141673.0)、2F/4R(△Rn＝240258.5)，且表现稳定。故，最终选取引物组合2F/6R与探针P，建立玉米内州萎蔫病菌的的荧光RAA检测方法。
2.3灵敏性及特异性测定
利用灭菌ddH2O，将浓度为2.6×10-4ng/μL(261fg/μL)的Cmn DNA2倍等梯度稀释成浓度为130、65fg/μL。以三种浓度的DNA为模板，每个浓度5个重复，并以灭菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测。结果显示(图6)：荧光RAA检测方法可检测浓度为261、130fg/μL的样品，而浓度为65fg/μL的5个重复中，有3个重复40个循环后检测到只有不到20000的相对荧光强度，而另外2个则没有检测到有效强度荧光信号，证明荧光RAA方法不能有效检测浓度为65fg/μL的样本。故，建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法的灵敏度为130fg/μL，比引物1F1R组合的荧光RAA灵敏度提高2倍，比实验室建立的LAMP检测方法50fg灵敏度稍低。
利用2株近缘亚种菌株(Cmi、Cmm)和9株其它菌株(Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz)，并以DNA浓度分别为26.1，1.3×10-4ng/μL的Cmn样本Cmn-1、Cmn-2为阳性对照，灭菌ddH2O为阴性对照，验证以引物2F6R、探针P组合建立的荧光RAA检测体系的特异性。结果(图7)：荧光RAA检测出两种不同DNA浓度的Cmn样品Cmn-1、Cmn-2，未检出包括2株近似亚种Cmi、Cmm内的其他菌株。表明，以引物2F6R和探针P组合的荧光RAA检测体系可以特异检出Cmn。
图5至图6中，E0-E7 DNA浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6ng/μL,N阴性对照。图7中1-11，玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞杆菌番茄致病变种、砖红色微杆菌、密执安棍状杆菌诡谲亚种、密执安棍状杆菌密执安、成团泛菌、菠萝泛菌、黄单胞菌、伯克霍尔德氏菌、玉米迪克氏菌、欧氏杆菌；N：无菌水；Cmn-1：浓度为26.1ng/μL Cmn基因组；Cmn-2：浓度为1.3×10-4ng/μL Cmn基因组。
2.4模拟样本及真实样品检测效果
将制备好的玉米内州萎蔫阳性模拟样本(4份)和进境玉米样本(24份)，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行荧光RAA检测，同时用GB/T 36840-2018：玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法验证。结果显示，两种方法均检出4份模拟样本，均未检出24份进境玉米样本，检出率100％。证实，新建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法可用于玉米种子样本的检测。
3建立的玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法与LAMP检测方法相比，荧光RAA检测既有恒温、灵敏、特异的优势，同时更简便、更快速，RAA只需要一对引物，便可20min实现特定片段的扩增，且产物为单一条带。通过与荧光探针的结合，RAA技术可实现扩增过程的动态监控，进行定量检测。本发明尝试利用模板DNA 10倍梯度稀释液进行荧光RAA定量检测研究，以模板LOG浓度为横坐标、相对荧光强度△Rn>20000的循环数为纵坐标建立标准曲线，显示：当选取样本浓度为26.1、2.6、2.6×10-1ng/μL的数据进行拟合标准曲线，可得标准曲线y＝-3.5x+21.792(R2＝0.9932)，但随着选取样本浓度的降低，拟合的标准曲线可信度R2<0.95，分析原因或与模板梯度稀释不够均匀有关，有必要制备标准质粒进行荧光RAA定量检测研究。
本发明利用RAA扩增技术进行玉米内州萎蔫病菌的检测，按照RAA原理设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。利用不同引物组合进行荧光RAA检测实验，发现：尽管所尝试引物组合都能扩增，但扩增效率差异显著(图2至图4)。分析原因，或与RAA利用引物与重组酶蛋白结合成二聚体原理有关，不同引物序列与重组酶蛋白结合效率不同。因此，有必要进一步研究RAA中引物与重组酶蛋白之间的结合机制，以指导引物设计，提高效率。
4结果
本发明针对玉米内州萎蔫病菌CelB序列片段设计引物和探针，通过引物筛选、特异性验证和灵敏性测定等实验，建立了玉米内州萎蔫病菌荧光RAA检测方法。该方法反应快速，所用时间仅为20min，特异性强且灵敏度高达130fg/μL，并通过了实际样品与模拟样品检测验证。荧光RAA检测方法快速、特异、灵敏、简便，满足现场准确、快速检测要求，可为有效监测玉米内州萎蔫病菌提供新思路。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 舟山海关综合技术服务中心
<120> 玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttactggtg aatgtgagca cggggttgc 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgtctgag ctcgtcatca ctgcgaagt 29
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgtgatgcg gctcgacgcc acggtgcact tcatgcccca gctgttcg 48
<210> 3
<211> 377
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctcgatct taaccgcgac cccacgagga agcggcgccg gccaccgagc gggatgcgct 60
cgacggccga cgccgcggat gatgggcggg agccctggtc agttactggt gaatgtgagc 120
acggggttgc tcggagcctg agttcccgcg acgttcagac cgacgtgcat ggtctgtccg 180
gccgggatct tggcggccca gccatcaccg gtgcacgtga tgcggctcga cgccacggtg 240
cacttcatgc cccagctgtt cgtgacagcc gtgattccgg ggctgtccca ggagaccgtc 300
caactcgaca ccgcggactt cgcagtgatg acgagctcag acgtgtagcc cgtgggccac 360
gatccgtcca gcttgta 377
Claims (10)
1.一种玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒包括：
正向引物SEQ ID NO：1；反向引物SEQ ID NO：2；以及探针SEQ ID NO：3；靶标序列为SEQID NO：4。
2.一种构建如权利要求1所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒的玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法包括：
步骤一，利用NA培养基活化菌株，接种环刮板收集菌体，提取细菌DNA，核酸测定仪验证提取效果，于-20℃保存备用；
步骤二，进行引物探针设计与合成，进行引物筛选与体系建立；利用灭菌ddH2O将确定的最低检测浓度DNA稀释，进行最佳引物组合的荧光RAA检测，测定荧光RAA检测方法的灵敏度；
步骤三，验证荧光RAA检测方法的特异性；模拟样品及真实样品检测效果验证，即可得玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒。
3.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤一中，所述菌株活化包括：于28℃，活化48h。
4.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤二中，所述进行引物探针设计与合成包括：
(1)分析C.michiganensis近缘亚种间纤维素酶基因序列差异，选取CelB序列为模板设计引物和探针；
(2)参照Genbank序列HE614873，设计引物cmn1、cmn2扩增靶标序列，利用BLAST将cmn1/cmn2序列与全数据库序列比对，确定引物组合是否100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配；
(3)若引物组合100％识别Cmn菌株，且与其他序列数据不匹配，则以Cmn DNA为模板，利用引物cmn1/cmn2扩增目的序列，并将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收，进行克隆测序；
(4)参照RAA原理，设计正向引物1F、2F、3F、4F、5F、6F、7F，反向引物1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R和探针P。
5.如权利要求4所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述扩增包括：
反应体系为50μL体系，包括：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 25μL，10μM的(cmn1/cmn2)2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL；
扩增条件为94℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min下。
6.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤二中，所述进行引物筛选包括：
提取Cmn DNA，以灭菌ddH2O进行10倍等梯度稀释，随机选取引物组合，分别以不同浓度的Cmn DNA为模板，进行荧光RAA检测，确定荧光RAA对Cmn最低检测浓度；以最低检测浓度DNA为模板，首先以上游引物1F、2F、3F、4F与下游引物1R、2R、3R、4R组合，进行荧光RAA检测，筛选出扩增效率最高的正向引物、反向引物和引物组合；其次将筛选出的正向引物、5F、6F、7F分别与筛选的反向引物、5R、6R、7R组合，探索扩增效率最高的引物组合；最后比较分析筛选出的引物组合，筛选出稳定性好、扩增效率高的引物组合。
7.如权利要求6所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，所述梯度浓度分别为26.1、2.6、2.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6ng/μL。
8.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤二中，所述体系建立包括：
反应体系：缓冲液ABuffer40.9μL，B Buffer 2.5μL，上游引物和下游引物各2.0μL(10mM)，荧光探针0.6μL(10mM)，DNA模板2.0μL；
扩增条件：39℃30s，共40个循环。
9.如权利要求2所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒构建方法，其特征在于，步骤三中，所述验证荧光RAA检测方法的特异性包括：
提取Cmm，Cmi，Pssy，Mt，Pss，Pan，Pag，Xo，Ba，Dz，Ecz的DNA，以11株参考菌株DNA为模板，不同浓度的Cmn DNA为阳性对照，灭菌ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA检测，验证荧光RAA检测方法的特异性；
步骤三中，所述模拟样品及真实样品检测效果验证包括：
1)利用灭菌ddH2O将1.2.1收集的Cmn菌体混匀，制备菌悬液；利用涂板法，测定菌悬液浓度为5.7×105cfu/mL；
2)筛选经玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法检测结果为阴性的进境饲用样本，磨成粉状分成4份，每份10g；
3)将制备好的菌悬液加入研磨样品中，混匀制备成阳性模拟样本；
4)采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取4个阳性模拟样本和24个真实玉米样本DNA，进行荧光RAA检测；同时，以玉米内州萎蔫病菌检疫鉴定方法复核验证。
10.一种利用如权利要求1所述玉米内州萎蔫病菌荧光重组酶介导等温扩增检测试剂盒在玉米内州萎蔫病菌检测中的用途。
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| CN106282319A (zh) * | 2015-05-19 | 2017-01-04 | 中检国研(北京)科技有限公司 | 玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测试剂盒及使用方法 |
| CN106687604A (zh) * | 2014-09-11 | 2017-05-17 | 阿格洛法士公司 | 用于对肉类、植物或植物部分进行病原体检测和病害治理的方法 |
-
2021
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