CN112662748B - 用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒 - Google Patents
用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于评估单细胞DNA测序文库质量的24对引物，利用这24对引物对中的八对或更多对能够准确评估单细胞DNA测序文库的基因组完整性和均一性，进而指导单细胞DNA测序。本发明还提供了利用这24对引物对中的八对或更多对来评估单细胞DNA测序文库质量的方法和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域；具体地说，本发明涉及单细胞DNA测序文库质量鉴定的引物对、方法和试剂盒。
背景技术
近几年来，随着细胞分离技术、单细胞扩增技术和测序技术的发展，单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，为基础研究向临床转化搭建了桥梁。单细胞测序包括单细胞DNA和RNA测序，分别针对单个细胞的DNA和RNA进行序列分析和比较，进而揭示基因组和转录组的变化。
单细胞DNA测序技术是指在单个细胞水平上对DNA进行扩增和测序的一项新技术，包括单细胞全基因组测序、单细胞全外显子测序和单细胞靶向基因测序等。传统的DNA测序方法通常使用数百万甚至更多细胞的混合DNA测序，如Sanger测序或Illumina测序，这些方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特异性被忽视。利用单细胞DNA的深度测序，可以广泛地研究细胞的功能，例如循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)，早期发育的胚胎细胞等。与典型的高通量测序实验一样，单细胞测序方案一般包括以下步骤：单细胞的分离和抓取、核酸的提取和扩增、测序文库的制备，高通量测序和生物信息学数据分析。与批量细胞DNA测序相比，进行单细胞DNA测序更具挑战性。传统的测序方法DNA起始量需要纳克或微克级，单个细胞的DNA量只有皮克级，样品制备过程中的任何损失、降解和污染对测序数据的质量产生显著的影响。此外，由于起始样本DNA量低，在单细胞测序文库制备过程中经常需要大量扩增，容易导致测序数据的覆盖不均匀、较多的信号噪音和量化不准确。因此，在单细胞DNA全基因组测序，尤其是单细胞全外显子捕获、目标基因靶向捕获测序前对文库进行全面的质量评估是非常有必要的。
传统测序文库质量评估的方法主要有：1、荧光定量法，该方法是基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。代表性的方法是Qubit荧光定量仪及配套试剂，该方法缺点是只能进行核酸定量，无法对文库质量进行评估；2、片段分析法，通过常规电泳或基于芯片的微流体技术对样本进行分离，根据电泳图谱或收集到的荧光信号对样本进行定量和片段分析，代表性的方法是Agilent 2100片段分析仪及配套试剂，该方法通过与已知片段大小和浓度的DNA Marker比较，进行样本的定量和分段分析，根据文库的片段分布判断文库质量；3、荧光定量PCR法，该方法采用文库接头序列引物或探针进行qPCR检测，检测的目标序列为文库接头，可以对测序DNA文库进行精确定量。这些方法共有的缺点是无法对测序文库的质量进行评估，如基因组完整性和均一性。单细胞DNA测序文库的特点是起始样本是一个细胞或少数细胞，测序前样本制备过程中需要经过大量扩增，可能会产生扩增的非特异性和偏好性，导致文库基因组完整性和均一性较差。传统的测序文库质量评估方法只能进行定量或片段大小分析，无法评估文库的基因组完整性和均一性，从而影响单细胞测序的质量，尤其是影响单细胞全外显子捕获测序、目标基因靶向测序的质量。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法和试剂盒，用于评估文库基因组完整性及均一性，从而评估单细胞文库是否适合全基因组测序，或全外显子捕获测序和目标基因靶向捕获测序。
在第一方面，本发明提供一种引物对的组合，所述引物对的组合包括下表所示24对引物对中的8对或更多对：
在优选的实施方式中，所述引物对的组合用于单细胞DNA测序文库质量鉴定。
在优选的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库质量鉴定是指评估单细胞测序文库基因组完整性及均一性。
在优选的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库是人单细胞DNA测序文库。
在具体的实施方式中，所述引物对的组合包括选自所述24对引物对中的12对以上引物对。
在具体的实施方式中，所述引物对的组合包括以下引物对：SCQ_1F、SCQ_1R、SCQ_2F、SCQ_2R、SCQ_3F、SCQ_3R、SCQ_5F、SCQ_5R、SCQ_7F、SCQ_7R、SCQ_8F、SCQ_8R、SCQ_9F、SCQ_9R、SCQ_11F、SCQ_11R、SCQ_12F、SCQ_12R、SCQ_13F、SCQ_13R、SCQ_20F、SCQ_20R、SCQ_XF、SCQ_XR。
在具体的实施方式中，所述引物对的组合包括所述24对引物对。
在第二方面，本发明提供一种用于单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒，所述试剂盒装有第一方面所述的引物对的组合；以及利用所述引物对的组合进行单细胞DNA测序文库质量鉴定的使用说明书。
在优选的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库质量鉴定是指评估单细胞测序文库基因组完整性及均一性。
在优选的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库是人单细胞DNA测序文库。
在优选的实施方式中，所述试剂盒还装有用于单细胞DNA测序文库质量鉴定的qPCR荧光染料反应液，ROX染料和水等必须试剂。
在第三方面，本发明提供一种进行单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：
1)利用第一方面中任一项所述的引物对的组合或第二方面所述的试剂盒对单细胞DNA测序文库、阳性对照和阴性对照进行荧光定量PCR；
2)利用步骤1)得到的荧光定量PCR结果评估单细胞DNA测序文库质量。
在具体的实施方式中，步骤2)包括：
根据引物的扩增CT值、融解曲线峰形，以及Tm值是否在阳性对照Tm值±0.5的范围内判断是否为扩增阳性；
根据荧光定量PCR扩增阳性率评估基因组完整性，其中阳性率＝有效扩增引物数/总引物数，阳性率越高，单细胞DNA文库基因组完整性越高；和
根据阳性扩增引物的CT值计算CV，CV值越小，文库均一性越好。
在优选的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库是人单细胞DNA测序文库。
在第三方面，本发明提供第一方面所述的引物对的组合在制备用于单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒或试剂中的用途。
在具体的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库质量鉴定是指评估单细胞测序文库基因组完整性及均一性。
在具体的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库是人单细胞DNA测序文库。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了单细胞DNA测序流程图；
图2显示了单细胞DNA文库质量评估流程图；
图3a-c显示了采用Agilent 2100对单细胞文库C190006、C190141和C190348的文库片段进行分析的结果；
图4是荧光定量PCR仪所执行程序的图示；
图5显示了单细胞DNA文库C190006、C190141和C190348，阳性对照，阴性对照的扩增曲线及溶解曲线。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，成功开发了一个适合于评估单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法。该方法采用了24对引物，这些引物分别分布在人类基因组22对常染色体和X/Y性染色体上的保守区域，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于荧光定量PCR扩增时特异性良好，扩增效率高，且扩增产物融解曲线峰形单一。通过对测序文库的荧光定量PCR检测，得出检测样本各引物的CT值和融解温度TM，计算荧光定量PCR阳性率和CT值的变异系数CV，从而能够正确评估单细胞DNA测序文库质量。在此基础上完成了本发明。
本发明的引物对
本发明了24对引物，这些引物分别分布在人类基因组22对常染色体和X/Y性染色体上的保守区域。这些引物特异性强并且具有相似的TM值，引物扩增区域不包含酶切位点TTAA序列。通过荧光定量PCR检测，分析样本各引物的扩增CT值和融解曲线，计算荧光定量PCR阳性率和CT值的变异系数CV，从而能够准确评估测序文库，特别是单细胞DNA测序文库的基因组完整性和均一性，进而指导单细胞DNA测序。在具体的实施方式中，所述单细胞DNA测序文库是人单细胞DNA测序文库。
本发明的引物的具体序列信息如下表所示：
基于本发明的教导，本领域技术人员可以利用上述24对引物对中的一对或多对来实现本发明的目的。
在具体的实施方式中，可以利用上述24对引物对中的8对以上；优选12对以上；最优选全部24对来评估测序文库，特别是单细胞DNA测序文库的质量。
基于本发明的教导，本领域技术人员可以在本发明公开的24对引物对中进行自主选择，但优选包括以下引物对：SCQ_1F、SCQ_1R、SCQ_2F、SCQ_2R、SCQ_3F、SCQ_3R、SCQ_5F、SCQ_5R、SCQ_7F、SCQ_7R、SCQ_8F、SCQ_8R、SCQ_9F、SCQ_9R、SCQ_11F、SCQ_11R、SCQ_12F、SCQ_12R、SCQ_13F、SCQ_13R、SCQ_20F、SCQ_20R、SCQ_XF、SCQ_XR。
单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒
在本发明的引物对的基础上，本发明进一步提供了一种单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒，包括上述引物和使用说明书。本领域技术人员知晓，本发明的单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒还任选包括qPCR荧光染料反应液、ROX染料和水等进行qPCR所必需的试剂。
进行qPCR的反应条件是本领域技术人员熟知的，本领域技术人员可以自主确定。但优选地，进行qPCR扩增条件为：步骤一：以2.74℃/s加热至95℃，并保持时间10分钟；步骤二：以2.74℃/s加热至95℃，并保持时间3秒；以2.12℃/s降至60℃，并保持时间30秒；进行40个循环，获得扩增曲线Ct值；步骤三：以2.74℃/s加热至95℃，并保持时间1秒；以2.12℃/s降至60℃，并保持时间20秒；以0.15℃/s加热至95℃，并保持时间1秒，获得融解曲线和Tm值。
单细胞DNA测序文库质量鉴定方法
在本发明的引物对和试剂盒的基础上，本发明进一步提供了一种进行单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法，所述方法包括利用本发明的引物对的组合或试剂盒对单细胞DNA测序文库、阳性对照和阴性对照进行荧光定量PCR；随后利用得到的荧光定量PCR结果评估单细胞DNA测序文库质量。
在具体的实施方式中，评估单细胞DNA测序文库质量包括根据引物的扩增CT值、融解曲线峰形，以及Tm值是否在阳性对照Tm值±0.5的范围内判断是否为扩增阳性；例如引物的扩增CT值＜30，融解曲线峰形单一，且Tm值＝阳性对照Tm值±0.5，即为扩增阳性；
根据荧光定量PCR扩增阳性率评估基因组完整性，阳性率＝有效扩增引物数/总引物数；阳性率越高，单细胞DNA文库基因组完整性越高；
均一性评估：根据阳性扩增引物的CT值计算CV，CV值越小，文库均一性越好；相反，CV值越大，文库均一性越差。
本发明的优点在于：
1.本发明提供的引物对特异性强并且具有相似的TM值，引物及扩增区域不包含酶切位点TTAA序列，可用于评估多种方法获得的单细胞DNA测序文库；
2.利用本发明的引物对能够准确评估测序文库的基因组完整性和均一性，进而指导单细胞DNA测序。
下面通过具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中所用的试剂和设备均属于市售可得的试剂和设备。
实施例一.单细胞DNA测序文库的制备
单细胞DNA测序文库的制备主要包括两个部分，单细胞全基因组扩增和测序文库制备。单细胞全基因组扩增包括MDA(REPLI-g Single Cell Kit,Qiagen公司)，DOP-PCR(
Single Cell Whole Genome Amplification Kit,Sigma公司)，MALBAC(
单细胞全基因组扩增试剂盒,亿康基因)等方法；测序文库制备主要包括DNA片段化、末端修复、连接测序接头和PCR扩增等步骤；也可将单细胞全基因组扩增和测序文库制备结合在一起(SMARTer PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kit，TAKARA公司)。本实施例包括但不限于以上方法获得的单细胞DNA测序文库。
1.单细胞的来源：来自胚胎、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和培养细胞系的1个或多个细胞。抓取的单细胞应该保存在包含5ul 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0的缓冲液的PCR管中，并-80℃冻存，使用前室温解冻；
2.阳性和阴性对照：阳性对照为100pg基因组DNA，阴性对照为无核酸的超纯水，对照样本应在5ul 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0缓冲液的PCR管中；
3.按照下表制备细胞裂解反应液；
4.将5ul细胞裂解反应液加入到步骤1、2的PCR管中，短暂离心，将反应混合液收集至PCR管底部；
5.将PCR管放入带有加热盖的热循环器中，并使用下列程序执行裂解反应；
6.裂解反应结束后，按照表制备单细胞预扩增反应液；
7.将10ul单细胞预扩增反应液加入到步骤5结束后的PCR反应管中，短暂离心，将反应混合液收集至PCR管底部；
8.将PCR管放入带有加热盖的热循环器中，并使用下列程序执行预扩增反应；
9.反应结束后使用Ampure Beads纯化扩增产物，纯化的磁珠比例为1:1，纯化后的样本用20μl 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0的缓冲液洗脱；
10.按照表制备单细胞测序文库扩增反应液，短暂离心，将反应混合液收集至PCR管底部；
11.将PCR管放入带有加热盖的热循环器中，并使用下列程序执行文库扩增反应；
12.反应结束后使用Ampure Beads纯化扩增文库，纯化的磁珠比例为1:1，纯化后的样本用50μl 10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0的缓冲液洗脱。
实施例二.单细胞DNA测序文库质量鉴定及全基因组测序
1.文库C190006、C190141和C190348为按照实施例一制备的单细胞DNA文库；
2.用Qubit荧光定量法对文库C190006、C190141和C190348进行定量，结果如下；
根据Qubit荧光定量结果，无法区分三个文库的质量差异。
3.用Agilent 2100对文库片段进行分析，单细胞文库C190006、C190141和C190348的片段分布为300-2000bp，平均大小为800-1000bp(如图3A、3B、3C所示)，根据片段分布无法区分三个文库质量差异；
4.对文库进行qPCR定量，评估单细胞测序文库基因组完整性及均一性；
5.将文库C190006、C190141和C190348稀释至2ng/ul用于配制反应液；将细胞系SKBR3基因组DNA稀释至2ng/ul，用于配制阳性对照反应液；使用无模板DNA的灭菌水作为阴性对照；
6.按照下表配制反应液，模板DNA分别为检测文库和阳性对照，每个反应重复2-3次；
7.引物为本发明中24对引物中的一对或者多对引物组合，为较好的评估文库质量，引物对应大于或等于8，或大于或等于12；本实施例中采用引物对SCQ_1、SCQ_2、SCQ_3、SCQ_5、SCQ_7、SCQ_8、SCQ_9、SCQ_11、SCQ_12、SCQ_13、SCQ_20、SCQ_X；
8.将qPCR管放入荧光定量PCR仪(QuantStudioTM5 Real-Time PCR System)中，并执行以下程序
9.单细胞DNA测序文库质量评估：
如图5所示，阳性对照扩增曲线和融解曲线为PC，阴性对照扩增曲线和融解曲线为NC，单细胞DNA测序文库检测样本扩增曲线和融解曲线为文库C190006、C190141和C190348；
结果的判断：引物的扩增CT值＜30，融解曲线峰形单一，且Tm值＝阳性对照Tm值±0.5，即为扩增阳性(图5所示)；
下表显示了本实施例采用的12对引物中的一对SCQ_3得的结果。
| 样本名称 | 引物 | CT | Tm | 结果判断 |
| PC 2ng gDNA | SCQ_3 | 25.0 | 82.2 | √ |
| NC | SCQ_3 | 32.7 | 74.2 | × |
| C190006 | SCQ_3 | 30.8 | 73.1 | × |
| C190141 | SCQ_3 | 24.8 | 82.2 | √ |
| C190348 | SCQ_3 | 25.2 | 82.0 | √ |
基因组完整性评估：根据荧光定量PCR扩增阳性率评估基因组完整性，阳性率＝有效扩增引物数/总引物数；阳性率越高，单细胞DNA文库基因组完整性越高。
均一性评估：根据qPCR各引物对CT值的变异系数(Coefficient of Variation，CV)来评估文库的均一性。CV值可以表示为标准差与平均数的比值(CV＝SD/mean)；CV值越小，文库均一性越好；相反，CV值越大，文库均一性越差。
单细胞DNA测序文库C190006的荧光定量PCR阳性率为16.67％，CV为0.12；C190141的荧光定量PCR阳性率为100％，CV为0.09；C190348的荧光定量PCR阳性率为58.33％，CV为0.10；
10.单细胞全基因组测序及数据分析。
将文库C190006、C190141和C190348使用Illumina Hiseq PE150进行测序，并对测序数据进行分析。
从测序数据分析可以看出，文库C190141的测序数据质量明显高于文库C190006和C190348的质量。传统测序文库质控方法主要是文库定量及片段大小分析，无法对单细胞DNA测序文库的基因组完整性和均一性进行分析，而本发明可以对单细胞DNA测序文库进行基因组完整性和均一性进行评估。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用24对引物的qPCR检测结果，评估单细胞DNA测序文库的基因组完整性和均一性，从而对单细胞DNA测序文库进行评估，指导单细胞DNA测序(包括单细胞全基因组测序、单细胞全外显子测序、单细胞靶向基因捕获测序等)。基于以上几个方面，上述实施例能够对单细胞DNA测序文库进行质量评估，可以避免质量差的文库继续测序，从而减少测序成本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 骏实生物科技（上海）有限公司
上海普恩海汇医学检验所有限公司
<120> 用于单细胞DNA测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒
<130> P2019-1657
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 27
gctgcttacc cattgctctc cata 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
atacctcgga cagcatagcc atct 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gagagttttc cagtggcgag gaga 24
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gtctgaagtt ggcaaagcga ggt 23
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
ggcagacaaa gtcagtgagg ttcc 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
tcggcaagtc tgcatagtcc atca 24
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
agctgaccga agcctctccc cg 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
cagcagcagg caccattctc gc 22
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
gggaaactac tggcaggaca caacc 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gaaatggctt tacctgtcag ccttc 25
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
ttgacagtgc caacttccgg aag 23
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
tcagctggaa accctccatc ccca 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
acagggacct tcagttggag ctga 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
gcccgtcggt ataaggatga tcta 24
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
gtcccaggta ccagatcaat gcccg 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
cgatgttgga gaagatgttg cactc 25
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
gtctgggatt tatggtctga tgaagc 26
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
tacgaatggg ctaccattac ctttg 25
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
agtcagcttc gttttaggcg taca 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
cctgatggtg ttggggaatc ctcc 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
tctgcagctg tcaaatgagg aatt 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
gggtaaaacg ttccctccaa agaa 24
Claims (4)
1.一种引物对的组合，所述引物对的组合是以下引物对：
SCQ_1F：CTGTGCCCTTGGAGAAGCTCAAGT；
SCQ_1R：TGCTAGAAGCACCAGAGCCACAAG；
SCQ_2F：CGGACATGACGGTGTTCAGCGGC；
SCQ_2R：GATCGTCCAGCTTCACCTCGCCG；
SCQ_3F：CGACAATAAGCCAGTGGAGCTCCA；
SCQ_3R：CGTTGTTTCCAGGTCACTGCCACT；
SCQ_5F：GTGAACGGCAGATCGTAGCCAGC；
SCQ_5R：CATTTACTTGCAGGGGCAACTCAA；
SCQ_7F：TACAGACTCCCCATCCCAAGACCC；
SCQ_7R：GCAGAGGCGTACAGGGATAGCACA；
SCQ_8F：GAAGGCCACTTTGCTGGTAGCACC；
SCQ_8R：TGGATAGTCCCATGCCCTTCTCTC；
SCQ_9F：ATTCAGAGGCCAGTCAACGACATG；
SCQ_9R：GCCCTGCCCACTTGTACAGTGAG；
SCQ_11F：AATACTCGCGCTACCTGCCAGCCC；
SCQ_11R：AACCTGCATCCGGACTTGGTGCTG；
SCQ_12F：AAGGCAGCAGCAAGCATTCCTGGG；
SCQ_12R：TTGGCTGCAACTGAAGGCTCCAGG；
SCQ_13F：TAGGGACCTGTTGCTGCCTTACAT；
SCQ_13R：CGTGCCTAGACGCTGACCATTCCC；
SCQ_20F：ACAGGGACCTTCAGTTGGAGCTGA；
SCQ_20R：GCCCGTCGGTATAAGGATGATCTA；
SCQ_XF：AGTCAGCTTCGTTTTAGGCGTACA；
SCQ_XR：CCTGATGGTGTTGGGGAATCCTCC。
2.一种用于人单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒，所述试剂盒装有权利要求1所述的引物对的组合；以及利用所述引物对的组合进行人单细胞DNA测序文库质量鉴定的使用说明书。
3.一种进行人单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法，所述方法包括以下步骤：
1) 利用权利要求1所述的引物对的组合或权利要求2所述的试剂盒对人单细胞DNA测序文库、阳性对照和阴性对照进行荧光定量PCR；
2) 利用步骤1)得到的荧光定量PCR结果评估人单细胞DNA测序文库质量；
步骤2)包括：
根据各引物对的扩增CT值、融解曲线峰形，以及Tm值是否在阳性对照Tm值±0.5的范围内判断是否为扩增阳性，引物的扩增CT值＜30，融解曲线峰形单一，且Tm值＝阳性对照Tm值±0.5，即为扩增阳性；
根据荧光定量PCR扩增阳性率评估基因组完整性，其中阳性率 = 有效扩增引物数/总引物数，阳性率越高，人单细胞DNA测序文库基因组完整性越高；和
根据阳性扩增各引物对的扩增CT值计算变异系数CV评估文库均一性，CV值表示为标准差与平均数的比值，CV值越小，文库均一性越好。
4.权利要求1所述的引物对的组合在制备用于人单细胞DNA测序文库质量鉴定的试剂盒或试剂中的用途；
所述人单细胞DNA测序文库质量鉴定是指评估单细胞DNA测序文库基因组完整性及均一性。
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| 二代测序平台进行核酸检测的新技术研究;陈科;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 基础科学辑》;20190615;全文 * |
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