CN109206523A - Tigit免疫粘附素、制备方法及用途 - Google Patents

Tigit免疫粘附素、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种TIGIT免疫粘附素、制备方法及应用，该TIGIT免疫粘附素为带有抗体IgG Fc的同源二聚体，其单体结构通式为Z1‑Z2‑Z3或Z1‑Z3。其中，Z1为TIGIT蛋白类似物，来源于天然TIGIT全长蛋白或片段；Z2为肽接头，具有10至25个氨基酸，氨基酸中至少50％是甘氨酸残基；Z3为人IgG抗体Fc区。本发明中的TIGIT免疫粘附素构建和表达过程简单，既可被构建为人TIGIT免疫粘附素，也可被构建为嵌合TIGIT免疫粘附素，通过实验证实两种类型的TIGIT免疫粘附素对免疫相关病症均具有良好的治疗作用，通过和其他抗免疫相关病症药物联用，能有效治疗免疫相关病症具备广阔的临床应用前景。

Description

TIGIT免疫粘附素、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种新型的TIGIT-Ig免疫粘附素其制备方法和用途，尤其是用于治疗免疫相关病症的用途。
背景技术
T细胞表面具有很多重要的膜分子，它们对于T细胞的活化、增殖和分化以及效应功能的发挥具有重要的作用。根据功能的不同，主要可以分为以下几类:(1)TCR-CD3复合物，使T细胞能够识别抗原提呈细胞上抗原肽-MHC分子复合物，并向细胞内传递活化信号；(2)CD4分子和CD8分子：分别辅助CD4+和CD8+T细胞的TCR识别抗原和参与T细胞活化信号的传导；(3)协同刺激分子：如CD28、CTLA-4、ICOS和PD-1等，为T细胞传递第二信号；(4)其他表面分子，主要包括与T细胞活化、增殖和分化相关的细胞因子受体，以及细胞间相互作用的黏附分子。
TIGIT蛋白(UniProtKB编号：Q495A1)是近年新发现的一种具有免疫抑制作用的协同刺激分子。2005年，Abbas等(Abbas A R,Baldwin D,MaY,et al.Immune response insilico(IRIS):immune-specific genes identified from a compendium ofmicroarrayexpression data[J].Genes&Immunity,2005,6(4):319-331.)为了寻找新的免疫共刺激或抑制分子，对活化的人类T细胞进行了测序，并对一些具有免疫调节样结构域的蛋白质分子进行了进一步的研究，结果在其中发现了一个在T细胞和NK上表达的新分子，该分子具有免疫球蛋白样结构域、跨膜区和免疫受体蛋白酪氨酸抑制模体(ITIM)，因此命名为TIGIT(Tcell immunoglobulin and ITIM domain)(Xin Y,Harden K,Gonzalez L C,et al.Thesurface protein TIGIT suppresses T cell activationby promoting the generationofmature immunoregulatory dendritic cells[J].Nature Immunology,2009,10(1):48-57.)。随后不久其他实验室运用不同方法也发现了该分子，分别命名为WUCAM(Boles K S,Vermi W,Facchetti F,et al.A novel molecular interaction for the adhesionoffollicular CD4T cells to follicular DC[J].European Journal ofImmunology,2010,39(3):695-703.)、Vstm3(Levin S D,Taft D W,Brandt C S,et al.Vstm3is amember ofthe CD28family and an important modulator ofT-cell function.[J].European Journal ofImmunology,2011,41(4):902-915.)或Vsig9(Stanietsky N,Mandelboim O.PairedNK cell receptors controlling NK cytotoxicity[J].FebsLetters,2010,584(24):4895-4900.)。
在现有技术中，TIGIT蛋白的可溶性片段在基础研究中被证实可以对DC等抗原递呈细胞有一定细胞水平的抗原递呈抑制作用(Xin Y,Harden K,Gonzalez L C,et al.Thesurface protein TIGIT suppresses T cell activationby promoting the generationofmature immunoregulatory dendritic cells[J].Nature Immunology,2009,10(1):48-57.)。但TIGIT蛋白的可溶性片段能否对免疫相关病症发挥治疗作用是未知的且需要进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于，依托上述研究背景，研究以TIGIT蛋白可溶性片段为基础的TIGIT免疫粘附素是否能够用于免疫相关疾病的治疗，并对TIGIT免疫粘附素的具体结构、制备方法和用途进行了描述，即提供了一种TIGIT免疫粘附素、其制备方法和用途。
本发明的第一方面，提供了一种TIGIT免疫粘附素，为带有抗体IgG Fc的同源二聚体，其单体结构通式为Z1-Z2-Z3或Z1-Z3。
其中，Z1为TIGIT蛋白类似物，来源于天然TIGIT全长蛋白或片段；Z2为肽接头，具有10至25个氨基酸，氨基酸中至少50％是甘氨酸残基；Z3为人IgG抗体Fc区。
当人IgG抗体Fc区不保留铰链区时，采用所述肽接头，所述TIGIT蛋白类似物的C末端残基直接融合至所述肽接头的N末端残基，并且所述肽接头的C末端残基直接融合至人IgG抗体Fc区的N末端残基；
当人IgG抗体Fc区保留部分或全部铰链区时，不采用所述肽接头，所述TIGIT蛋白类似物的C末端残基直接融合至人IgG抗体Fc区的N末端残基。
优选的，所述片段选自以下任一种情况：
A)所述片段为TIGIT天然蛋白的全长可溶性片段，该可溶性片段保留了TIGIT蛋白中具有结合其天然配体能力的结构域或部分TIGIT蛋白的胞外段，且缺乏部分或者全部的TIGIT蛋白跨膜段及胞内段；
B)所述片段为包含TIGIT天然蛋白的胞外段全长的片段；
C)所述片段为包含了TIGIT天然蛋白胞外段中保留其生物活性的片段；
D)所述片段为除去N端、C端或两者同时的一个或多个连续氨基酸残基后的TIGIT天然蛋白胞外段；
E)所述片段为TIGIT蛋白的突变体。
所述片段还包括TIGIT天然蛋白跨膜段的一个或多个连续氨基酸残基，或者包含TIGIT天然蛋白信号肽中的一个或多个连续氨基酸残基。
在优选的实施方式中，TIGIT蛋白类似物来源于人、小鼠或非人灵长类动物。该TIGIT蛋白类似物具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，或由在氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除、添加或取代的氨基酸序列组成。具体序列组成如下：
编码上述TIGIT蛋白类似物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示。本发明中，任何编码具有TIGIT蛋白活性的蛋白质的DNA都适合于本发明。这样的结构包括从组织或细胞mRNA中分离得到的，从根据以公布数据库中序列全基因合成的，或从其他cDNA文库中获得的。
在某些实施方式中，当保留抗体铰链区较多时，可以不使用肽接头，本发明优选不使用肽接头。
在某些实施方式中，在TIGIT蛋白与Fc区域之间也可以增加肽接头以增加柔性或特殊功能。在一些实施方式中，肽接头是包含氨基酸序列[GGGGX]n的多肽，X是谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(D)、或丝氨酸(S)，n为2-5。肽接头包含如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ IDNO.11所示的氨基酸序列，具体如下：
其中，肽接头1中X1是Q或E；X2是Q或E；X3是Q或E；X4是G、E、Q或不存在：X5是G或不存在：并且X6是G或不存在。
肽接头富含甘氨酸，以提供充分的构象柔性。优选地，肽接头为小于30个氨基酸长。在某些优选实施方案中，肽接头为10至25个氨基酸长，其中所述氨基酸的至少50％是甘氨酸残基。优选的肽接头包括序列(GGGGX15)n，其中X15是Q、E或S并且n＝2-5。更优选的肽接头具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列。在一些情况下，也可以使用其他氨基酸序列作为肽接头。
优选的，人IgG Fc区是来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区。IgG Fc区包含SEQID NO.12所示的氨基酸序列，并且进一步在SEQ ID NO.12氨基酸序列中的位置1处的C残基的N末端侧包含在野生型IgGl Fc序列中发现的一些或所有氨基酸。
人IgG重链Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO.12)如下：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVX1LX2PPKPKDTLMISRTPEVTCX3VX4DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYX5STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX6
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T：X5是N、D或Q：并且X6是K或不存在。
本发明术语“人IgG FC区域”具有该术语在免疫学领域中通常给定的含义。特别地，该术语是指通过从抗体移除两个抗原结合区(Fab片段)而获得的人IgG抗体片段。具体而言，FC区包括抗体的CH2和CH3恒定区结构域，并且也可包括一些或所有的铰链区。
免疫球蛋白中存在四种IgG子类(G1、G2、G3和G4)，其各自具有不同的结构和被称为效应物功能的生物学功能。这些效应物功能一般通过与Fc受体(FcγR)相互作用或者通过结合补体因子Clq来介导。结合至FcγR可导致抗体依赖性的细胞介导的细胞裂解，而结合至补体因子可导致补体介导的细胞裂解。IgG子类的Fc区的结构和性质是本领域中己知的。本发明的融合蛋白可含有来自任何IgG子类的Fc区，尽管Gl和G3比G2和G4抗体具有更高的受体结合和效应物功能活性，因此是优选的。
此外，本发明还涉及编码本发明的TIGIT免疫粘附素中的任一者的多核苷酸。编码上述TIGIT免疫粘附素的多核昔酸可以是RNA或DNA的形式，其包括cDNA和合成DNA，并且其可以是双链或单链的。编码本发明的蛋白的编码序列可由于遗传密码的冗余或简并性而变化。
编码本发明TIGIT免疫粘附素的多核苷酸可包括以下：仅蛋白的编码序列，蛋白的编码序列和额外编码序列(诸如前导或分泌序列或前蛋白序列)：蛋白的编码序列和非编码序列(诸如内含子或蛋白的编码序列的5’和/或3’端的非编码序列)。因此，术语“编码蛋白的多核苷酸”不仅涵盖可包括蛋白的编码序列的多核苷酸，而且涵盖包括额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。
在本发明的一个优选实施例中，TIGIT蛋白类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；编码该蛋白的多核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。在该优选实施例中，TIGIT免疫粘附素的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，编码该TIGIT免疫粘附素的核苷酸序列如SEQID NO:16所示。
在本发明的另一个优选实施方案中，TIGIT蛋白类似物的氨基酸序列与SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性；编码该蛋白的多核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％和最优选至少99％同一性。在该优选实施例中，所述TIGIT免疫粘附素的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码该TIGIT免疫粘附素的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明中的免疫粘附素可以抑制Th1，Th17，Th22和或其他分泌促炎因子的免疫细胞的促炎活性。所述的促炎因子包括但不限制于IL-1β，TNF-α，TGF-beta，IFN-γ，IF-17，IL-6，IL-23，IL-22，IL-21，和MMPs。TIGIT免疫粘附素还可以通过增加抗炎因子如IL-10的水平增强Treg细胞的免疫抑制作用。
因此，本发明的第二方面，提供了一种含有TIGIT免疫粘附素的药物组合物。该药物组合物除了包括TIGIT免疫粘附素，还包括医学上可接受的药物载体。
本发明的TIGIT免疫粘附素和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的TIGIT免疫粘附素氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。
对于本发明公开的上述TIGIT免疫粘附素的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含TIGIT免疫粘附素的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗炎症效果明显。具体来讲，对免疫相关病症的预防和/或治疗有效，可以作为抗免疫相关病症药物使用。
本发明中TIGIT免疫粘附素及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。
本发明的第三方面，提供了一种TIGIT免疫粘附素的用途，具体是在制备抗免疫相关病症药物中的用途。
优选的，该用途还指TIGIT免疫粘附素和其他抗肿瘤药物联合使用。
本发明所述的免疫相关病症包括克罗恩氏病、***性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、银屑病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、和或移植排斥等。这里不再一一列举。
本发明的第四方面，提供了一种TIGIT免疫粘附素的制备方法，包括如下步骤：
(A)全基因合成TIGIT蛋白类似物片段以及人IgG抗体Fc片段；
(B)将步骤(A)中获得TIGIT免疫粘附素片段和Fc段模板，采用overlap PCR技术将上述两个片段融合并装入表达载体中，同时加入接头肽，即获得编码TIGIT免疫粘附素的表达载体；
(C)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。
本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pGEM-T、pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4、pDHFR、pDR1之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***可用于本发明的融合蛋白的表达，COS、CHO、HEK293、NS0、sf9及sf21等均可适用于本发明。
可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a、Top10、BL21(DE3)、TG1之一。
本发明的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽自杆菌或荧光假单胞菌；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中己知的技术培养。
然而，昆虫和酵母或其他真菌细胞产生非人N聚糖，因此在此类细胞中产生的具有N连接糖基化的蛋白如果施用至患者则可引起免疫原性反应。此类细胞中的生产需要消除N-连接的糖基化位点和/或对所述细胞进行基因工程改造，以使用本领域中己知的技术来产生人N-聚糖。参见例如(Hamilton et al.,2003,Production ofcomplex humanglycoproteins in yeast,301:1244-1246)(2003年8月)。
在哺乳动物细胞中进行生产是优选的，并且选的哺乳动物宿主细胞是含谷氨酰胺合成酶(GS)表达***的CHOK1SV细胞系(参见美国专利号5,122,464)。可通过众所周知的方法将包含目标多核苷酸序列(例如，融合蛋白和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞内，所述方法可根据细胞宿主的类型而变化。例如，氧化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。
本发明中公开的TIGIT免疫粘附素的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达融合蛋白，分离或纯化所述的融合蛋白。
利用上述方法，可以将TIGIT免疫粘附素纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中己知的并且描述于例如(Wilchek and Bayer,1990,Methods in enzymology)(Scopes,2013,Proteinpurification:principles andpractice)。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供了一种TIGIT免疫粘附素、制备方法及其用途，该TIGIT免疫粘附素为带有抗体IgG Fc的同源二聚体，由TIGIT蛋白类似物、肽接头以及人IgG抗体Fc区组成，构建和表达过程简单，既可被构建为人TIGIT免疫粘附素，也可被构建为嵌合TIGIT免疫粘附素，并且通过实验证实两种类型的TIGIT免疫粘附素对免疫相关病症均具有良好的治疗作用，通过和其他抗免疫相关病症药物联用，能有效治疗免疫相关病症具备广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为TIGIT免疫粘附素的结构示意图；
图2为狼疮性肾炎小动物模型接受TIGIT免疫粘附素治疗后自身抗体的水平变化结果；
图3为狼疮性肾炎小动物模型接受TIGIT免疫粘附素治疗后的存活曲线；
图4为狼疮性肾炎小动物模型接受TIGIT免疫粘附素治疗后的蛋白尿发生率结果。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例1、TIGIT免疫粘附素的构建及表达
如图1所示，TIGIT免疫粘附素是一种带有抗体IgG Fc的同源二聚体，由TIGIT蛋白类似物以及人IgG抗体Fc区组成。具体构建和表达步骤如下：
(1)全基因合成人TIGIT蛋白胞外段(氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示)、鼠TIGIT蛋白胞外段(氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示)，分别得到人源和鼠源TIGIT蛋白类似物。全基因合成人免疫球蛋白IgG的Fc片段(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:13-14所示)。
(2)将上述步骤(1)中获得的TIGIT蛋白胞外段和获得的Fc片段为模板，利用overlap PCR技术将上述片段融合并装入表达载体中，分别构建获得人及嵌合TIGIT免疫粘附素表达载体(氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:15-18所示)。
(3)融合蛋白表达和纯化
于3.5cm组织培养皿中接种3×105个CHO-K1细胞，细胞培养至80％-85％融合时进行转染：取表达载体质粒20μg和20μL Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于800μL无血清DMEM培养基中，室温静置5分钟，将以上两种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3mL无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含500μg/mL G418和300μg/mL Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。
将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分别分离纯化人和鼠TIGIT免疫粘附素。将TIGIT免疫粘附素用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。
实施例2.Biacore分析
将人TIGIT免疫粘附素和嵌合TIGIT免疫粘附素分别包被在CM5M5芯片(GE公司)上，捕获被检测抗体后，用Biacore T100(GE Healthcare)检测各免疫粘附素的亲和力，具体检测亲和力数值见表1。
表1.Biacore分析结果
实施例3:TIGIT免疫粘附素对狼疮小鼠模型的治疗作用
狼疮性肾炎作为一种代表性免疫***疾病，发病率约为50/10万，在我国约占人口的0.7‰。90％以上狼疮性肾炎见于女性，主要为青、中年女性，一般认为30岁以下者肾脏受累率高，约有70％病人有不同程度的肾损害临床表现，以程度不等的蛋白尿、镜下血尿为多见，常伴有管型尿及肾功能损害，严重影响患者的正常生活。
狼疮小鼠模型多采用NZB雌鼠与NZW雄鼠杂交产生，杂交第一代(NZB×NZW)F1，能产生包括狼疮性肾炎在内的典型狼疮症状，是目前公认的研究狼疮性肾炎动物模型之一。模型的建立参考非专利文献Brinks et al.Circ Res(2010)107:1140-1149。然后将小鼠分组为人TIGIT免疫粘附素处理组、嵌合TIGIT免疫粘附素处理组和对照组，每组n＝10。
人TIGIT免疫粘附素和嵌合TIGIT免疫粘附素的注射剂量为:100μg每只/次，一周两次腹腔注射，连续注射十周。对照组注射对照IgG。
小鼠血清中的免疫粘附素浓度用ELISA的方法检测，检测时血清含量高于10μg/ml。
各处理组自身抗体水平、存活曲线以及蛋白尿发生率对比分别见图2～图4。由图2可知，前30周内三组小鼠体内的抗体水平相当，30周后，人TIGIT免疫粘附素处理组和嵌合TIGIT免疫粘附素处理组的抗体水平升幅不大，但对照组小鼠体内的抗体水平升幅却显著升高。
如图3所示，对照组小鼠在50周后生存率开始呈断崖式下滑，65周后小鼠的生存率已不足10％，而人TIGIT免疫粘附素处理组和嵌合TIGIT免疫粘附素处理组小鼠的生存率则从70周后才开始下滑，到85周时生存率依然在25％左右，说明无论是人TIGIT免疫粘附素处理组还是嵌合TIGIT免疫粘附素，均能显著提高小鼠的生存率。
如图4所示，对照组小鼠从15周开始出现蛋白尿情况，并且随着时间推移蛋白尿发生率逐渐增加，至40周时蛋白尿发生率为100％；而人TIGIT免疫粘附素处理组和嵌合TIGIT免疫粘附素处理组小鼠则从40周开始才开始出现蛋白尿情况，并且增幅远低于对照组小鼠，将两组进行比较，人TIGIT免疫粘附素处理组小鼠发生蛋白尿的几率更低。
综上，在狼疮小鼠模型中，无论人TIGIT免疫粘附素还是嵌合TIGIT免疫粘附素对于免疫***疾病均具有良好的治疗效果，有利于后续的临床试验的开展。
实施例4、短TIGIT免疫粘附素的构建、表达及Biacore分析
本实施例中，TIGIT免疫粘附素也是带有抗体IgG Fc的同源二聚体，但为短TIGIT免疫粘附素，由TIGIT蛋白类似物以及人IgG抗体Fc区组成，不含肽接头，其中，TIGIT蛋白类似物为天然TIGIT蛋白的短截片段。具体构建方法如下：
(1)全基因合成人TIGIT蛋白胞外段截断片段序列1和序列2(氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:3-6所示)，分别得到人源TIGIT蛋白短片段1和短片段2。全基因合成人免疫球蛋白IgG的Fc片段(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:13-14所示)。
(2)将上述步骤(1)中获得的TIGIT蛋白胞外段片段1、片段2和获得的Fc片段为模板，利用overlap PCR技术将上述片段融合并装入表达载体中，分别构建获得人短TIGIT免疫粘附素1和2的表达载体(氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:19-22所示)。
免疫粘附素表达纯化及Biacore分析的具体方法如实施例1和2，结果如下：
表2.Biacore分析结果
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 沣潮医药科技（上海）有限公司
<120> TIGIT免疫粘附素、制备方法及用途
<130> 权利要求书 说明书
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atgatgaccg gcaccatcga gaccaccggc aacatctccg ccgagaaggg cggctccatc 60
atcctgcagt gccacctgtc ctccaccacc gcccaggtga cccaggtgaa ctgggagcag 120
caggaccagc tgctggccat ctgcaacgcc gacctgggct ggcacatctc cccctccttc 180
aaggacaggg tggcccccgg ccccggcctg ggcctgaccc tgcagtccct gaccgtgaac 240
gacaccggcg agtacttctg catctaccac acctaccccg acggcaccta caccggcagg 300
atcttcctgg aggtgctgga gtcctccgtg gccgagcacg gcgccaggtt ccagatcccc 360
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg
115
<210> 4
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atgatgaccg gcaccatcga gaccaccggc aacatctccg ccgagaaggg cggctccatc 60
atcctgcagt gccacctgtc ctccaccacc gcccaggtga cccaggtgaa ctgggagcag 120
caggaccagc tgctggccat ctgcaacgcc gacctgggct ggcacatctc cccctccttc 180
aaggacaggg tggcccccgg ccccggcctg ggcctgaccc tgcagtccct gaccgtgaac 240
gacaccggcg agtacttctg catctaccac acctaccccg acggcaccta caccggcagg 300
atcttcctgg aggtgctgga gtcctccgtg gccgagcacg gcgccagg 348
<210> 5
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala
1 5 10 15
Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr
20 25 30
Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala
35 40 45
Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp
50 55 60
Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr
65 70 75 80
Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp
85 90 95
Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
100 105
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tccggcatga tgaccggcac catcgagacc accggcaaca tctccgccga gaagggcggc 60
tccatcatcc tgcagtgcca cctgtcctcc accaccgccc aggtgaccca ggtgaactgg 120
gagcagcagg accagctgct ggccatctgc aacgccgacc tgggctggca catctccccc 180
tccttcaagg acagggtggc ccccggcccc ggcctgggcc tgaccctgca gtccctgacc 240
gtgaacgaca ccggcgagta cttctgcatc taccacacct accccgacgg cacctacacc 300
ggcaggatct tcctggaggt gctggag 327
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Thr Ile Asp Thr Lys Arg Asn Ile Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ser Val
1 5 10 15
Ile Leu Gln Cys His Phe Ser Ser Asp Thr Ala Glu Val Thr Gln Val
20 25 30
Asp Trp Lys Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Tyr Ser Val Asp Leu
35 40 45
Gly Trp His Val Ala Ser Val Phe Ser Asp Arg Val Val Pro Gly Pro
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Thr Phe Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Gly Gly Ile Tyr Lys Gly Arg
85 90 95
Ile Phe Leu Lys Val Gln Glu Ser Ser Asp Asp Arg Asn Gly Leu Ala
100 105 110
Gln Phe Gln Thr Ala Pro Leu Gly
115 120
<210> 8
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
accatcgaca ccaagaggaa catctccgcc gaggagggcg gctccgtgat cctgcagtgc 60
cacttctcct ccgacaccgc cgaggtgacc caggtggact ggaagcagca ggaccagctg 120
ctggccatct actccgtgga cctgggctgg cacgtggcct ccgtgttctc cgacagggtg 180
gtgcccggcc cctccctggg cctgaccttc cagtccctga ccatgaacga caccggcgag 240
tacttctgca cctaccacac ctaccccggc ggcatctaca agggcaggat cttcctgaag 300
gtgcaggagt cctccgacga caggaacggc ctggcccagt tccagaccgc ccccctgggc 360
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gln Gly Gly
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Ile Glu Gly Arg Met Asp
1 5
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Xaa Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Xaa Val Xaa Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Xaa
225
<210> 13
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 14
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 15
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 16
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
atgatgaccg gcaccatcga gaccaccggc aacatctccg ccgagaaggg cggctccatc 60
atcctgcagt gccacctgtc ctccaccacc gcccaggtga cccaggtgaa ctgggagcag 120
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aaggacaggg tggcccccgg ccccggcctg ggcctgaccc tgcagtccct gaccgtgaac 240
gacaccggcg agtacttctg catctaccac acctaccccg acggcaccta caccggcagg 300
atcttcctgg aggtgctgga gtcctccgtg gccgagcacg gcgccaggtt ccagatcccc 360
gagcccaagt cctgcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 420
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 480
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 540
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 600
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 660
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 720
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 780
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 840
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 900
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 960
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1020
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1056
<210> 17
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Thr Ile Asp Thr Lys Arg Asn Ile Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ser Val
1 5 10 15
Ile Leu Gln Cys His Phe Ser Ser Asp Thr Ala Glu Val Thr Gln Val
20 25 30
Asp Trp Lys Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Tyr Ser Val Asp Leu
35 40 45
Gly Trp His Val Ala Ser Val Phe Ser Asp Arg Val Val Pro Gly Pro
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Thr Phe Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Gly Gly Ile Tyr Lys Gly Arg
85 90 95
Ile Phe Leu Lys Val Gln Glu Ser Ser Asp Asp Arg Asn Gly Leu Ala
100 105 110
Gln Phe Gln Thr Ala Pro Leu Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
115 120 125
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 18
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
accatcgaca ccaagaggaa catctccgcc gaggagggcg gctccgtgat cctgcagtgc 60
cacttctcct ccgacaccgc cgaggtgacc caggtggact ggaagcagca ggaccagctg 120
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gtgcccggcc cctccctggg cctgaccttc cagtccctga ccatgaacga caccggcgag 240
tacttctgca cctaccacac ctaccccggc ggcatctaca agggcaggat cttcctgaag 300
gtgcaggagt cctccgacga caggaacggc ctggcccagt tccagaccgc ccccctgggc 360
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acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 540
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 600
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 660
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atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 780
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 840
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 900
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 960
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1020
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1056
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<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
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Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
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245 250 255
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
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290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 20
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
atgatgaccg gcaccatcga gaccaccggc aacatctccg ccgagaaggg cggctccatc 60
atcctgcagt gccacctgtc ctccaccacc gcccaggtga cccaggtgaa ctgggagcag 120
caggaccagc tgctggccat ctgcaacgcc gacctgggct ggcacatctc cccctccttc 180
aaggacaggg tggcccccgg ccccggcctg ggcctgaccc tgcagtccct gaccgtgaac 240
gacaccggcg agtacttctg catctaccac acctaccccg acggcaccta caccggcagg 300
atcttcctgg aggtgctgga gtcctccgtg gccgagcacg gcgccaggga gcccaagtcc 360
tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccccg agctgctggg cggcccctcc 420
gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tctccaggac ccccgaggtg 480
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 540
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caactccacc 600
tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 660
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc 720
aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc cctccaggga cgagctgacc 780
aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctccga catcgccgtg 840
gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 900
tccgacggct ccttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 960
ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1020
tccctgtccc tgtcccccgg caag 1044
<210> 21
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala
1 5 10 15
Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr
20 25 30
Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala
35 40 45
Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp
50 55 60
Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr
65 70 75 80
Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp
85 90 95
Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Glu Pro Lys
100 105 110
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
130 135 140
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
145 150 155 160
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
165 170 175
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
180 185 190
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
195 200 205
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
210 215 220
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
225 230 235 240
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
245 250 255
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
260 265 270
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
275 280 285
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
290 295 300
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
305 310 315 320
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
325 330 335
Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 22
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
tccggcatga tgaccggcac catcgagacc accggcaaca tctccgccga gaagggcggc 60
tccatcatcc tgcagtgcca cctgtcctcc accaccgccc aggtgaccca ggtgaactgg 120
gagcagcagg accagctgct ggccatctgc aacgccgacc tgggctggca catctccccc 180
tccttcaagg acagggtggc ccccggcccc ggcctgggcc tgaccctgca gtccctgacc 240
gtgaacgaca ccggcgagta cttctgcatc taccacacct accccgacgg cacctacacc 300
ggcaggatct tcctggaggt gctggaggag cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc 360
cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc ggcccctccg tgttcctgtt cccccccaag 420
cccaaggaca ccctgatgat ctccaggacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg 480
tcccacgagg accccgaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 540
gccaagacca agcccaggga ggagcagtac aactccacct acagggtggt gtccgtgctg 600
accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 660
gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc tccaaggcca agggccagcc cagggagccc 720
caggtgtaca ccctgccccc ctccagggac gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc 780
tgcctggtga agggcttcta cccctccgac atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag 840
cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg 900
tactccaagc tgaccgtgga caagtccagg tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc 960
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc 1020
aag 1023

Claims (10)

1.一种TIGIT免疫粘附素，其特征在于，为带有抗体IgG Fc的同源二聚体，其单体结构通式为Z1-Z2-Z3或Z1-Z3，
Z1为TIGIT蛋白类似物，来源于天然TIGIT全长蛋白或片段，
Z2为肽接头，具有10至25个氨基酸，氨基酸中至少50％是甘氨酸残基，
Z3为人IgG抗体Fc区，
当人IgG抗体Fc区不保留铰链区时，采用所述肽接头，所述TIGIT蛋白类似物的C末端残基直接融合至所述肽接头的N末端残基，并且所述肽接头的C末端残基直接融合至人IgG抗体Fc区的N末端残基；
当人IgG抗体Fc区保留部分或全部铰链区时，不采用所述肽接头，所述TIGIT蛋白类似物的C末端残基直接融合至人IgG抗体Fc区的N末端残基。
2.根据权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素，其特征在于：
其中，所述片段选自以下任一种情况：
A)所述片段为TIGIT天然蛋白的全长可溶性片段，该可溶性片段保留了TIGIT蛋白中具有结合其天然配体能力的结构域或部分TIGIT蛋白的胞外段，且缺乏部分或者全部的TIGIT蛋白跨膜段及胞内段；
B)所述片段为包含TIGIT天然蛋白的胞外段全长的片段；
C)所述片段为包含了TIGIT天然蛋白胞外段中保留其生物活性的片段；
D)所述片段为除去N端、C端或两者同时的一个或多个连续氨基酸残基后的TIGIT天然蛋白胞外段；
E)所述片段为TIGIT蛋白的突变体。
3.根据权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素，其特征在于：
其中，所述TIGIT蛋白类似物来源于人、小鼠或非人灵长类动物，
所述TIGIT蛋白类似物具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，或由在氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除、添加或取代的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素，其特征在于：
其中，所述肽接头是包含氨基酸序列[GGGGX]n的多肽，X是谷氨酰胺、谷氨酸、或丝氨酸，n为2-5，
所述肽接头包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素，其特征在于：
其中，所述人IgG Fc区是来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区，
所述IgG FC区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，并且进一步在SEQ ID NO.12氨基酸序列中的位置1处的C残基的N末端侧包含在野生型IgGl Fc序列中发现的一些或所有氨基酸。
6.根据权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素，其特征在于：
其中，所述TIGIT免疫粘附素的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17所示，编码所述TIGIT免疫粘附素的核苷酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.18所示。
7.含有权利要求1～6任一项所述的TIGIT免疫粘附素的药物组合物，其特征在于，还包括医学上可接受的药物载体。
8.权利要求1～6任一项所述的TIGIT免疫粘附素在制备抗免疫相关病症药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的TIGIT免疫粘附素在制备抗免疫相关病症药物中的用途，其特征在于：
其中，所述TIGIT免疫粘附素和其他抗免疫相关病症药物联合使用，
所述免疫相关病症包括克罗恩氏病、***性红斑狼疮、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、银屑病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎或移植排斥。
10.权利要求1所述的TIGIT免疫粘附素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)全基因合成TIGIT蛋白类似物片段以及人IgG抗体Fc片段；
(B)将步骤(A)中获得TIGIT免疫粘附素片段和Fc段模板，采用overlap PCR技术将上述两个片段融合并装入表达载体中，同时加入接头肽，即获得编码TIGIT免疫粘附素的表达载体；
(C)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。
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