CN111235076B - 一种天神芽孢杆菌、其菌剂及在重金属修复领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于重金属土壤修复技术领域，具体涉及一种天神芽孢杆菌、其菌剂及在重金属修复领域的应用。本发明从重金属污染的土壤中，筛选得到一株天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46，所述菌株为解磷菌，应用于作物培养对植物生长无毒，并且具有一定的促进作用；该菌株对金属镉、铅具有良好的降解作用，并且对重金属离子修复的同时，不影响土壤的稳定性。目前关于天神芽孢杆菌的相关报道较少，本发明提供了一株具有良好解磷、重金属修复效果的菌株，应用于重金属土壤修复，提高作物生长情况具有良好的应用前景。

Description

一种天神芽孢杆菌、其菌剂及在重金属修复领域的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株天神芽孢杆菌(Bacillustianshenii)P46，其菌剂及其在土壤重金属修复领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
土壤是人类赖以生存的自然环境和农业生产的重要资源.世界面临的粮食、资源和环境问题与土壤密切相关。自20世纪20年代以来，由于工业的发展，金属的产量明显增加，因而由此产生的重金属环境污染问题也随之出现。在许多发展中和发达国家，都面临着土壤污染严重阻碍农业生产的问题。随着社会现代化和生产的发展，土壤污染问题日益严重，因而已引起人们的广泛关注。
在环境科学中常注意的重金属有汞、镉、镍、铬、矾、砷、硒、铁、锰、铜、锌、铅等。其中有相当一部分重金属是生物所必需的微量元素，另有一些重金属则表现为环境污染物，目前，研究较多的是镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)和汞(Hg)。在农业生产上，重金属污染不仅使土壤肥力下降，又致使生产出的农产品质量不符合生态学安全的要求，危害人畜健康，因而具有很大的危害性。
同时，土壤污染修复技术也飞速发展，尤其是生物修复技术的发展，为重金属污染修复提供了更为高效、绿色的手段。生物修复是一种环境友好型技术，它将科学技术与自然生命过程相结合，利用细菌、真菌、绿色植物等的生命活动，来修复受污染环境。其中，微生物在重金属污染土壤修复中具有成本低、能耗低、无二次污染、效率高等特点。同时部分微生物自身良好适应能力、细胞机制，也可以吸收多种类型重金属在缩短修复时间的同时，也可以达到良好的重金属土壤转化效果。同时微生物可以参与调控土壤中养分循环，提高土壤重金属转化速度。所以利用一些真菌、细菌、放线菌等修复重金属污染土壤具有很大的潜力。在众多种类的微生物中，硫酸盐还原菌和解磷菌以较高的土壤重金属耐受性和修复重金属的潜力而成为现今研究微生物修复土壤重金属的热点。
发明内容
本发明从重金属污染的土壤中筛选得到一株具有解磷及重金属修复功能的天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46。所述天神芽孢杆菌具有良好的解磷、促进植物生长及土壤中重金属修复能力，对土壤中的金属铅和镉具有显著的修复效果。
针对以上技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一株天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444。
天神芽孢杆菌于14年首次分离，并被认定为一个新的种。目前本领域内针对天神芽孢杆菌的研究相对空白，对其生物活性和是否具有益生功能尚不明确。本发明提供的所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46是一株具有良好解磷能力的菌株，能够帮助提升土壤肥力，促进植物的生长。另外，解磷菌还对于重金属具有良好的钝化能力，单独使用的情况下，对土壤中重金属镉的降解率达到60％以上，金属铅降解率达到80％以上。
第一方面所述的天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46具有SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。
所述菌株分离自电镀厂周围的污水中，其细菌形态满足芽孢杆菌特征，经基因组测序比对与已知菌株Bacillus tianshenii strain YIM M13235(98％)的同一性可达98％，认定为天神芽孢杆菌，定名为天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46。
所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46的形态学特征如下：
菌体特征：该菌种细胞大小为0.3μm～0.5μm×1.4μm～3.0μm，呈杆状，革兰氏阳性；芽孢椭圆形，大小为0.6μm～0.9μm×1.0μm～1.5μm，有运动性。
菌落特征：菌落呈圆形或不规则性，边缘不整齐，表面无皱褶、粗糙，污白色，无***。
所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46的生理生化特征如下：
能利用葡萄糖、木糖及***糖等，能水解糖蜜，具有解磷功能；在30℃下培养生长速率最高，在厌氧条件下不生长。
本发明第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46和/或菌的培养物。
所述菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
作为优选，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
本发明第三方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂在重金属土壤修复方面的应用。
本发明第四方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂由天神芽孢杆菌(Bacillustianshenii)P46与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30或其培养物组成；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。
以上一个或多个技术方案的有益效果如下：
1.天神芽孢杆菌作为一个新的属，相关研究几乎处于空白状态，上述研究结果为天神芽孢杆菌的发掘和应用提供了可供借鉴的经验。
2.所述天神芽孢杆菌具有多方面的益生作用，包括分解土壤中的磷元素为植物生长提供养分，促进植株的生长，以及对土壤中多种金属元素的钝化、修复效果，应用于污染农田修复具有良好的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例6中所述培养条件对P46培养的影响结果图；
其中，图1A为温度、pH值对活菌数量的影响折线图；
图1B为温度、pH值对芽孢数量的影响折线图；
图1C为转速、时间对活菌数量的影响折线图；
图1D为转速、时间对芽孢数量的影响折线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种天神芽孢杆菌、其菌剂及在重金属修复领域的应用。
本发明第一方面，提供一株天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444。
所述天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46具有SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。
优选的，所述天神芽孢杆菌菌粉制备方法如下：将所述天神芽孢杆菌(Bacillustianshenii)P46接种于斜面培养基进行培养；取培养好的斜面，在无菌条件下取菌株接种于种子液体培养基中，振荡培养获得一级种子液；对一级种子液进行扩大培养获得二级种子液；以0.8～1.2％的接种量取二级种子液接种于液体发酵培养基中，当芽孢率达到90％以上时，收集发酵液，加入轻质碳酸钙后喷雾干燥得到菌粉。
进一步优选的，所述斜面培养中，将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养24～30h。
进一步优选的，所述一级种子培养在37℃条件下，180rpm震荡培养18～24h。
进一步优选的，所述扩大培养以1％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，震荡培养12～14h，制得二级种子液。
进一步优选的，所述喷雾干燥的步骤中，向发酵液中加入0.67～1.00％(质量百分数)轻质碳酸钙。
进一步优选的，所述种子培养基配方如下：4.0％糖蜜，2.0％豆粕、0.7％K2HPO4、0.3％KH2PO4，0.15％(NH4)2SO4，0.05％柠檬酸钠，0.01％硫酸镁，余量为水，调pH至6.8，121℃条件下灭菌30min。
进一步优选的，所述固体斜面培养基为NB合成液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉。
进一步优选的，所述液体发酵培养基配方为：4.0％糖蜜，2.0％豆粕、0.7％K2HPO4、0.3％KH2PO4，0.15％(NH4)2SO4，0.05％柠檬酸钠，0.01％硫酸镁，余量为水，调pH至6.8。
本发明第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46和/或菌的培养物。
优选的，第二方面所述菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
作为优选，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
本发明第三方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂在重金属土壤修复方面的应用。
本发明第四方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂由天神芽孢杆菌(Bacillustianshenii)P46与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30或其培养物组成；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。
优选的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30具有SEQ ID NO:2所示的16SrDNA序列。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1菌种的筛选
1、材料与方法
1.1样品
电镀厂周边土壤及水样等11份样品材料。
1.2筛选培养基
菌株营养培养基：NB合成培养基，NB培养基的基础上加入1.5％的琼脂即为固体培养基。
解磷菌菌株的筛选培养基(NBRIP)：葡萄糖1.0％、Ca3(PO4)2 0.5％、MgCl20.5％、蛋白胨0.5％、琼脂粉2.0％，pH7.2～7.4，121℃，灭菌30min。
1.3样品初筛
解磷菌的初筛：从电镀厂取得的土样及水样中取样1克(1ml)，混合放入装有99ml无菌生理盐水的三角瓶中，恒温摇床30℃，180转/分，震荡培养2h。获取悬浮液后做连续稀释，取1ml做10-3-10-5稀释，取10-3-10-5稀释液各0.1ml加入到NBRIP培养基平板上进行稀释涂布分离单菌落，挑取有解磷圈的单菌落进行分离纯化并斜面保存于冰箱中备用。
1.4菌种复筛
解磷菌的复筛：将初筛得到的解磷菌分别接种到装有NBRIP液体培养基的250mL三角瓶内(装液量50mL)，转速180rpm，温度37℃，培养24h，观察培养基的颜色变化及活菌数并记录时间。
1.5仪器
恒温水浴锅；培养箱；光学显微镜。
2、结果
2.1初筛结果
如表1所示，本实施例从11个样品中，共分离了78个菌株，通过解磷透明圈直径比与选择培养扩增速度的筛选，共初步筛选了17株解磷菌。
表1初筛结果
Figure GDA0002673483300000061
Figure GDA0002673483300000071
2.2复筛结果
如表2所示，P30、P46、S3、S5菌株对镉的吸附效率最好。
表2复筛结果
Figure GDA0002673483300000072
注：1、—：表示测不到；2、P7：为从土壤中筛选的脱氟不动杆菌；3、P10：为从土壤中筛选的克雷伯氏杆菌；4、P30：为从污水中筛选出的枯草芽孢杆菌；5、P46：为从土壤中筛选的天神芽孢杆菌；6、P51：为从污水中筛选出的枯草芽孢杆菌。
上述17株解磷菌中，去除了病害菌及真菌后，筛选解磷效果达到50％以上的菌株进行摇瓶实验，其中镉去除效果较好的四株菌如表2所示，其中，P46菌株对镉去除效果最好。
实施例2菌种的鉴定及安全试验
1、材料与方法
1.1菌种
从电镀厂土壤及水样等样品中分离得到的微生物经初筛、复筛后，共筛选出4株重金属降解性能较高的菌株，编号分别是P30,P46,S3和S5。
1.2细菌的形态鉴定及分子鉴定
除特别说明外，一般形态及分子试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。
1.3安全试验
细菌的植物毒性检测是利用“珍珠”西红柿种子与“水晶”生菜种子进行的。将种子在2％浓度的单一菌液、混合菌液(1:1:1)以及蒸馏水(控制组)中浸泡10分钟。然后用蒸馏水冲洗，均匀放置于铺好湿滤纸的培养皿中，放入恒温培养箱，温度设置为24℃。3-4天后记录出芽率，10天后分别记录实验组与对照组烘干后幼苗根和茎的重量。通过观察种子发芽的延迟程度和幼苗的生长情况，判断植物毒性。
2、结果
2.1菌种的鉴定
经细菌的形态鉴定，属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。符合天神芽孢杆菌特征，初步认定为天神芽孢杆菌。
挑取单菌落接种至NB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物8f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海生工生物公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达98％：Bacillus tianshenii strain YIM M13235(98％)。
综合测序与形态鉴定结果，确定该菌株属于天神芽孢杆菌。
2.2安全试验
表3所筛选细菌对西红柿和生菜种子的发芽率及幼苗生长影响
Figure GDA0002673483300000081
由表3可知，P30、P46、两株菌对西红柿及生菜种子的发芽率均具有明显的促进作用，且对西红柿及生菜幼苗由一定的促生长作用。P30属于枯草芽孢杆菌，是一种公知具有植物促生作用的菌种，P46显示出与P30相当的促生效果。
实施例3各菌株对重金属镉、铅修复液体摇瓶试验
1、材料和方法
1.1菌种
P30、P46
1.2培养基
NB液体合成培养基，121℃，灭菌30min。
1.3重金属镉含量测定方法及仪器
测定方法：
(1)配制NB液体培养基，加入重金属镉(使培养基的重金属镉含量为5mg/L)灭菌备用。
(2)设置2个处理，分别接种对应菌株菌液1ml，2个处理分别为：
处理1：只接种P30；
处理2：只接种P46，同时加入3％纳米吸附粘土。以等量的无菌水替代接菌液作为实验空白。
(3)对接种后的摇瓶37℃，180rpm震荡培养3天。
(4)对震荡培养后的各处理进行离心(转速5000转)，取上清测定重金属镉含量。
仪器及测定标准：使用火焰原子吸收法测定，具体操作参考GB15618-1995。
2试验内容与结果
1)初始重金属镉的浓度为5mg/L
结论：
处理1的重金属镉实际浓度为1.9595mg/L，重金属实际降解率为60.81％；
处理2的重金属镉实际浓度为1.9755mg/L，重金属实际降解率为60.49％。
2)初始重金属铅的浓度为50mg/L
结果：
处理1的重金属铅实际浓度为8.1220mg/L，重金属实际降解率为83.76％；
处理2的重金属铅实际浓度为7.9500mg/L，重金属实际降解率为84.10％。
结论：
实施例1中通过横向对比证实了P46在同一批次筛选获得的解磷菌中具有优良的生存能力和修复镉的能力。本实施例中采用常规培养基进行摇瓶实验，实验条件更加贴近工业实际使用状况。由上述数据可以看出，菌株P46对于重金属铅的修复效率可达到83％以上，对镉的去除效果平均能够达到60％。
实施例四重金属修复盆栽试验
本实施例中，提供一种由天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30以活菌数量1:1混合而成的复合菌剂。
1、土壤重金属镉、铅含量测定方法：
土壤重金属总镉、总铅含量测定使用石墨炉原子吸收分光光度法，具体操作参考GB/T17141；
土壤重金属镉、铅不同形态含量的测定方法参考BCR连续提取法。
BCR连续提取法是利用国际标准中规定的不同提取剂对土壤Cd2+、Pb2+形态进行提取，并对提取液进行定量检测，通过对比BCR法提取土壤中的不同形态Cd2+、Pb2+含量，可简单分析微生物的修复效果和最终修复的稳定性，2、重金属修复盆栽试验方法
以接种解磷菌P30、P46于LB培养基中，以160rpm，37℃恒温培养2天后，将得到的细菌菌体团聚物制备成3.0-5.0×109CFU/mL细菌悬液。将不同浓度梯度的Cd污染土壤以200g/盆分装于各个花盆中，设置两组实验组，分别为未加菌组(CK组)，单独加复合菌液(P组，其中P46、P30的活菌数量比例为1:1)。CK组不加细菌，P组加入1mL复合菌液，向各组中加水至土壤含水率为60％-70％，然后将所有花盆中的土样以木铲搅拌均匀，保证加入的细菌在土壤中分布均匀，每组三个平行。待细菌加入土壤一个月后，测量土壤可交换态、可氧化态、可还原态及残渣态重金属镉、铅的含量。土壤重金属初始可交换态含量设置为2ml/kg、5ml/kg、10ml/kg、20ml/kg、50ml/kg。
3、试验内容与结果
表4盆栽试验一月后取样4种价态重金属镉含量测定结果
Figure GDA0002673483300000101
Figure GDA0002673483300000111
表5盆栽试验一月后取样4种价态重金属铅含量测定结果
Figure GDA0002673483300000112
结论：
通过表4和表5的数据可以看出，所述解磷菌P30和P46组成的复合菌剂对于不同浓度的铅和镉均能够实现良好的修复作用，修复效率平均可达98％以上。
实施例5重金属修复菌剂稳定性试验
针对实施例4中修复后的四组土壤样品(50mg/kg CK、50mg/kg P)均以2g为一组分成若干组份加入50mL聚乙烯离心管中。为了研究不同环境条件对已改良土壤成分的影响，进一步探讨微生物修复土壤重金属污染对不同条件的稳定性。第一组用以判断pH对修复稳定性的影响，具体步骤为：以NaOH和HCl调节不同pH 3-9的酸碱溶液40mL加入管中，以150rpm，室温摇18±2h后，4000g离心15min，测量土壤上清液中的Cd2+含量。第二组用以判断不同金属阳离子对修复稳定性的影响，具体步骤为：以分析纯NaNO3，KNO3，Ca(NO3)2药品溶于去离子水中制成0.01mol/L的Na+，K+和Ca2+金属阳离子盐溶液40mL加入瓶中，以150rpm，摇18±2h后，4000g离心15min，测量土壤上清液中的Cd2+含量。
表7 PH对修复后土壤稳定性的影响
Figure GDA0002673483300000121
表8重金属阳离子对修复后土壤稳定性的影响
Figure GDA0002673483300000122
表7结果说明，土壤酸碱性会一定程度上改变已形成的稳定性Cd形态，尤其在H+大量存在时，CdS或Cd2(PO4)3等生成产物可能会被氧化或分解，导致微生物修复结果的稳定性下降，二次释放回环境中。在碱性环境中，微生物修复产物仍能保持稳定，不易被洗脱出释放至环境中。而P组相对CK组表现出降低活性的钝化效果。
从对比三种金属阳离子对土壤稳定性的结果来看，Ca2+溶液能够提取的Cd2+含量最多，这可能是由于Ca2+与Cd2+拥有相同的化合价，在进行离子交换时，可能发生晶格交换，配位络合等将Cd2+从稳定态向可交换态活化的现象，而P组相对CK组均表现出降低活性的钝化效果。
土壤酸碱及金属阳离子均可导致微生物修复结果的稳定性下降，但对稳定性的影响不大，在实际应用中可忽略不计。
实施例6培养基及培养条件的优化
将P46菌株置于不同温度下摇床培养48h，在10～40℃环境中的菌株能够生长，且30～40℃环境下的菌株生长最快；置于不同初始pH值环境下摇床培养48h，在pH值范围为3.5～8.5的环境中菌株能够生长，且在pH值为6.5～7.5的环境中生长最快。置于37℃、pH值为6.8的条件下摇床培养，转速分别设置120rpm、150rpm、180rpm，于第12、24、36、48、60取培养液计数。天神芽孢杆菌P46最佳培养条件为：pH：6.8；温度为37℃，搅拌速度180r/min，培养时间48h。
表9天神芽孢杆菌P46在不同组分的营养培养基上的活菌数
Figure GDA0002673483300000131
表注：
1、甘蔗糖蜜4.0％；豆粕2.0％；KH2PO4 0.3％；(NH)2SO4 0.15％；柠檬酸钠0.05％；MgSO4·7H2O 0.01％，MnSO40.05％；余量为水；pH 7.0-7.2。
2、玉米粉6.0％；豆粕3.5％；硫酸铵0.3％；碳酸氢钠0.6％；碳酸钙0.1％；pH＝7.0。
根据活菌数与芽孢数综合分析，最终确定培养基成分为：玉米粉6.0％；豆粕3.5％；硫酸铵0.3％；碳酸氢钠0.6％；碳酸钙0.1％；其余为水；pH＝7.0。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110> 山东碧蓝生物科技有限公司
<120> 一种天神芽孢杆菌、其菌剂及在重金属修复领域的应用
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 天神芽孢杆菌 (Bacillus tianshenli strain) P46 16S rDNA
<400> 1
acctggcggc gtgctataca tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa 60
gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc 120
gggaaaccgg ggctaatacc ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg 180
gcttcggctg tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240
tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420
aagaacaagt gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 540
ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600
ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg 720
taactgacac tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaatttgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat 1260
aaaaccgttc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc 1440
ctaagggtga caaaatgg 1458
<210> 2
<211> 1456
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis strain)P30 16S rDNA
<400> 2
gcctggcggg gtgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120
aaaccggggc taataccgga tgcttgattg aaccgcatgg ttcaattata aaaggtggct 180
tttagctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240
accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360
cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagggaa 420
gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600
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ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
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aggtgaacag agaggg 1456

Claims (17)

1.一株天神芽孢杆菌(Bacillus tianshenii)P46，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19444。
2.天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，含有权利要求1所述的天神芽孢杆菌P46，其制备方法如下：将所述天神芽孢杆菌P46接种于斜面培养基进行培养；取培养好的斜面，在无菌条件下取菌株接种于种子液体培养基中，振荡培养获得一级种子液；对一级种子液进行扩大培养获得二级种子液；以0.8～1.2％的接种量取二级种子液接种于液体发酵培养基中，当芽孢率达到90％以上时，收集发酵液，加入轻质碳酸钙后喷雾干燥得到菌粉。
3.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述斜面培养中，将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养24～30h。
4.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述一级种子液为在37℃条件下，180rpm震荡培养18～24h获得。
5.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述扩大培养以体积比为1％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，震荡培养12～14h，制得二级种子液。
6.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述喷雾干燥的步骤中，向发酵液中加入质量百分数为0.67～1.00％轻质碳酸钙。
7.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述种子培养基配方如下：4.0％甘蔗糖蜜，2.0％豆粕、0.7％K2HPO4、0.3％KH2PO4，0.15％(NH4)2SO4，0.05％柠檬酸钠，0.01％硫酸镁，余量为水，调pH至6.8，121℃条件下灭菌30min。
8.如权利要求3所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述固体斜面培养基为在NB合成液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉制备而成。
9.如权利要求2所述天神芽孢杆菌P46的菌粉，其特征在于，所述液体发酵培养基配方为：玉米粉6.0％；豆粕3.5％；硫酸铵0.3％；碳酸氢钠0.6％；碳酸钙0.1％；其余为水；pH＝7.0。
10.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的天神芽孢杆菌P46或权利要求2-9任一项所述天神芽孢杆菌P46的菌粉。
11.如权利要求10所述的一种菌剂，其特征在于，所述菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂。
12.如权利要求11所述的一种菌剂，其特征在于，所述菌剂剂型为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
13.如权利要求11所述的一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
14.权利要求1所述天神芽孢杆菌P46在重金属土壤修复方面的应用，所述重金属为铅、镉。
15.权利要求2-9任一项所述天神芽孢杆菌P46的菌粉在重金属土壤修复方面的应用，所述重金属为铅、镉。
16.权利要求10-13任一项所述菌剂在重金属土壤修复方面的应用，所述重金属为铅、镉。
17.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由权利要求1所述天神芽孢杆菌P46与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P30组成；所述枯草芽孢杆菌P30，已于2020年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC NO.19443。
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Denomination of invention: Bacillus cereus, its bacterial agent and its application in the field of heavy metal remediation

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Denomination of invention: Bacillus cereus, its agent and its application in heavy metal remediation

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Pledgor: SHANDONG GREENBLUE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

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