CN112608904A - 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的之一是提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let‑7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。本发明使用敲降或敲除一个microRNA—let‑7b的表达而不引入任何外源基因，由成纤维胞成功诱导出神经干细胞，可在短时间内扩增产生能够足够移植所需的细胞量，并且是遗传稳定的，能分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可扩增超过20代以上的神经干细胞，移植给老鼠也未见诱导肿瘤形成。

Description

一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用。
背景技术
干细胞技术的发展为许多神经***疾病治疗带来了希望，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病等，神经损伤性疾病如脊髓损伤，还有肌萎缩性脊髓侧索硬化症、自闭症等。研究表明，使用胚胎干细胞分化形成的神经元治疗阿尔茨海默症、帕金森、脊髓损伤等疾病有一定作用，但胚胎干细胞的来源存在伦理争议，还有致瘤性和免疫排斥作用限制了其应用。
由体细胞重编程形成的诱导多能干细胞(iPSCs)，可以解决免疫原性，但面临潜在致瘤性，定向分化效率低等问题。神经干细胞(NSCs)是指一类具有自我复制和自我更新能力，且能高度增殖和进行多向分化的细胞，在研究神经***发育、分化以及治疗神经***疾病中具有重要的作用。因此，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(induced neuralstem cells，iNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。
一些研究学者利用几个转录因子进行组合重编程鼠的成纤维细胞诱导生成稳定可扩增的神经干细胞。这些研究对于重编程干细胞形成神经干细胞的策略是可以借鉴的，Thier等利用传统的多能干细胞重编程因子(sox2、oct4等)在最初的重编程过程中限制了OCT4的表达，产生的神经干细胞聚集的神经克隆球能够无限扩增至50代而不改变分子性能，同时这些神经干细胞也能够表达神经细胞特定的表面标志如Nestin和Olig2等。Han等同样用了转录因子的组合(Brn4/Pou3f4,Sox2,Klf4,c-Myc,和E47/Tcf3)直接重编程鼠的成纤维细胞诱导生成神经干细胞，产生的神经干细胞注射到免疫小鼠脑内没有产生畸胎瘤，并且这种细胞具有脑源性神经细胞的分子学特征、分化性能和自我更新的能力。此外体内分化中能够产生神经元体系，而且只有一小部分移植细胞维持神经祖细胞的性能。裴端卿等使用非整合质粒载体携带Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367电转入人尿液中提取的活细胞，诱导形成神经干细胞，电转后12天可见神经干细胞克隆出现，但是不能自然分化为少突胶质细胞。总体上，从体细胞转染转录因子诱导神经干细胞，需要较长时间的培养，才能形成神经干细胞克隆，诱导效率也较低。
由此可见，现有技术中采用外源基因进行重编程神经干细胞诱导的成功率较低，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变；此外，诱导得到的神经干细胞体外扩增代数少，体细胞重编程的周期长、重编程效率低，数量上无法满足临床需求，而不适用于脑中风损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，数量能够满足临床需求。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，并将获得的神经干细胞应用于植被预防和治疗神经***疾病的药物组合物。
本发明要解决的技术问题主要在于克服现有技术中重编程体细胞转化效率较低、神经干细胞克隆形成效率低和体细胞转分化的周期长等缺陷，从而提供一种可以利用自身体细胞快速重编程、转分化效率高、转分化时间短的神经干细胞的诱导方法。
与此同时，由于现有的转分化重编程方法涉及到外源基因的介入，具有很大的临床安全隐患。因此，本领域迫切需要一种新的不需要外源基因介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞将为神经干细胞的方法。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；
所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let-7基因的shRNA、siRNA或CRISPR基因编辑载体以及相关microRNA抑制剂。
所述的let-7基因，包括let-7家族所有的单个成员，优选使用let-7b基因。
细胞治疗是利用分离、分化和扩增来的健康细胞移植给患者来代***中受损的细胞和组织，从而进行治疗的方法。神经***遗传性疾病、退行性疾病和损伤性疾病，在患者的体内损失大量的神经细胞，如能补充上足够的神经细胞，则可修复相应的神经损伤。而目前所采取的药物和手术治疗只能延缓疾病恶化而不能彻底治愈。由于神经细胞无法像造血干细胞那样进行捐献，其来源受到极大的限制，没有移植细胞可供治疗用。
神经细胞现实的来源主要有从流产胎儿分离的方法，由于受到伦理限制和免疫排斥问题，无法在临床上大规模使用。
另一个来源是从胚胎干细胞或诱导多能干细胞尽心分化来获取，存在分化时间长，分化效率低，以及形成潜在肿瘤的可能，以及免疫原性的问题，而在临床研究中受到限制。
一个较好来源是直接重编程体细胞来形成神经干细胞，可以快速高效的获取自体神经干细胞，避免免疫排斥和效率低等问题，但由于引入外源基因，这个方法获得的细胞实际上难以用作细胞治疗剂。
因此，我们另辟蹊径，不同于在体细胞中过表达神经干细胞相关转录因子以诱导神经干细胞生成的“加法”策略，我们提出“减法”策略，即通过在体细胞中中敲降一个microRNA—let-7来诱导生成神经干细胞，该方法更为简便、安全、易操作，完全解决上述难题。
本发明的发明人做出艰苦的努力，使用敲降一个microRNA—let-7b的表达而不引入任何外源基因，由成纤维胞成功诱导出神经干细胞，结果是，可在短时间内扩增产生能够足够移植所需的细胞量，并且是遗传稳定的，能分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可扩增超过20代以上的神经干细胞，移植给老鼠也未见诱导肿瘤形成。
已经经过实验证明可行，实验经过不下几十次，结果均类似，人和鼠成纤维细胞在转染抑制let-7b的慢病毒载体后，在神经干细胞诱导液的作用下，都能在3-5天获得大量神经干细胞，转染率非常高，神经干细胞克隆形成率远高于现有方法，获得的神经干细胞被免疫荧光和实时定量PCR验证，具有神经干细胞的表面标志和分子标志。通过分化实验，证明具有分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。移植小鼠脑内，证明可在脑内存活、分化，并证明无肿瘤形成。
进一步，所述的let-7b基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，具体为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU；
编码所述的shRNA的DNA序列如SEQ.ID.NO.2所示，具体为AACCACACAACCTACTACCTCA。
进一步，所述的基因敲降载体或基因敲除载体慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或质粒载体所构建形成的shRNA、RNAi、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。
进一步，所述的体细胞为成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞、上皮细胞、表皮细胞或毛囊细胞。
再进一步，所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞、人***成纤维细胞、人眼睑成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。
进一步，所述的基因敲降载体或基因敲除载体的转染为：在神经干细胞诱导液的培养下，重编程体细胞为神经干细胞。此过程为本发明的重要发明点，核心包括特殊的神经干细胞诱导液与特殊的重编程诱导方法。
再进一步，所述的神经干细胞诱导液为含有细胞培养添加剂、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、维生素C、丙戊酸和聚凝胺的DMEM/F12培养基；
所述的细胞培养添加剂为B27细胞培养添加剂和/或N2细胞培养添加剂。
所述的DMEM/F12培养基优选为含10wt％胎牛血清的高糖DMEM/F12。
其中，B27细胞培养添加剂的有效浓度为0.1wt％-10wt％，较佳地：0.2wt％-8wt％，更佳：0.9wt％-5wt％。
其中，N2细胞培养添加剂的有效浓度为0.1wt％-10wt％，较佳地：0.2wt％-7wt％，更佳：0.5wt％-4wt％。
其中，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的有效浓度为10-20ng/mL。
其中，表皮生长因子EGF的有效浓度为10-20ng/mL。
其中，维生素C的有效浓度为1-300μg/mL,较佳地：2-260μg/mL，更佳：5-200μg/mL。
其中，丙戊酸(VPA)的有效浓度为0.001-1mg/mL，较佳地：0.003-0.2mg/mL，更佳：0.005-0.05mg/mL。
其中，聚凝胺(ploybrene)的有效浓度为10-20ng/mL。
所述的神经干细胞诱导液还可包括青链霉素和L-谷氨酰胺作为可选成分。
再进一步，重编程过程在D型多聚赖氨酸(PDL)、层粘连蛋白(Laminin)、明胶中的一种或数种的组合包被的盖玻片上进行。
进一步，所述的神经干细胞的扩增培养为：在神经干细胞培养液中进行培养2天以上，优选为2-5天。
常见的普通神经干细胞培养液均可用于本发明，神经干细胞培养液的成分对本发明不构成限制。
再进一步，所述的神经干细胞培养液为含有B27细胞培养添加剂和/或N2细胞培养添加剂、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF的DMEM/F12培养基或者DMEM/F12培养基与neurobasal培养基的混合物。
具体地，神经干细胞培养液可采用如下培养基：
DMEM/F12:neurobasal(质量比1:1),1wt％N2,1wt％B27,1wt％GlutaMAX；需添加的细胞因子为：bFGF和EGF。其中，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的有效浓度优选为10-20ng/mL，表皮生长因子EGF的有效浓度优选为10-20ng/mL。
或者可采用如下培养基：DMEM/F12，2wt％B27/1wt％N2，10ng/mL bFGF，10ng/mLEGF，1wt％L-谷氨酰胺，0.4wt％青链霉素。
本发明的目的之二是提供一种神经干细胞，其通过上述方法获得。
进一步，所述神经干细胞表达多能基因包括Nestin、sox2、pax6等。
本发明的目的之三是提供上述神经干细胞在制备治疗神经细胞病变疾病的药物或制剂中的应用，所述的神经细胞病变疾病为神经退行性疾病，损伤性疾病或基因突变疾病；以及继发外伤、缺血、溢血等导致的神经***病变。
再进一步，所述的神经细胞病变疾病为阿尔兹海默病、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化、亨廷顿舞蹈病、脊髓损伤、脑中风、脑卒中或自闭症。
本发明的有益效果如下：
1.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，首次利用基因敲降的方式将体细胞重编程为神经干细胞，细胞重编程得到的神经干细胞，体外扩增代数超过20代以上，在体外可以快速扩增。
2.本发明提供的重编程神经干细胞的方法，诱导分化时间短、重编程效率高。
3.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，可以在没有外源基因导入的情况下获得神经干细胞，避免基因组的突变或整合，有利于临床应用。
附图说明
图1为具体实施方式中扩增获得的人薄片成纤维细胞的光镜图；
图2为具体实施方式中神经干细胞的重编程过程中转染48h时的细胞，左侧为诱导48小时的神经球光镜图，右侧为荧光照片图；
图3为具体实施方式中神经干细胞的重编程过程中转染72h时的细胞，左侧为诱导72小时的神经球光镜图，右侧为荧光照片图；
图4为具体实施方式中获得的神经干细胞表达Nestin，Sox2，Pax6蛋白的激光共聚焦显微镜照片；
图5为具体实施方式中诱导神经干细胞分化出MAP2、Tuj阳性的神经元的细胞免疫化学染色照片；
图6为具体实施方式中诱导神经干细胞能分化出Vimentin和GFAP阳性的星型胶质细胞的细胞免疫化学染色照片；
图7为具体实施方式中诱导神经干细胞能分化出MBP和Oligo2阳性的少突胶质细胞的细胞免疫化学染色照片；
图8为具体实施方式中神经干细胞移植小鼠后脑片的细胞免疫化学染色照片。
图2-8的原图均为彩图，如有需要，可后续提供原图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
步骤一：分离培养人***成纤维细胞
(1)取手术刚切下来的新鲜***组织用PBS漂洗3次，去除血渍；
(2)用镊子和剪刀去除附带的皮下脂肪组织、被膜***及坏死组织，PBS漂洗3次，剪成约1mm3的小块；
(3)将组织转移入离心管中，加入少许胰酶，37℃培养箱中孵育30min；
(4)1000rpm离心5min，弃上清，加入1mmg/ml四型胶原酶，37℃培养箱中孵育30min；
(5)加入hPFF培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，再加入新鲜的hPFF培养基重悬，转移入25cm2培养瓶内，37℃培养箱静置培养；
(6)3d后半量换液，之后视情况换液；
(7)大约5d时有游离细胞爬出，7-8d时细胞成束，约2w时细胞铺满整个培养瓶底；
(8)PBS清洗，胰蛋白酶消化，培养液终止消化，1000rpm/min离心5min，新鲜培养液重悬传代。
步骤二：扩增人***成纤维细胞
原代hPFF生长达80-90％时，吸弃培养基，PBS清洗一次，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化传代，显微镜下观察细胞形态的变化，当细胞回缩变圆、细胞卷边时加入培养基终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，按1:3-1:4传代，继续培养。培养获得的人***成纤维细胞见图1。
步骤三：神经干细胞的重编程(转染)
(1)将人***成纤维细胞1.5万个细胞铺在1％明胶包被的盖玻片上，放入12孔板进行培养。
(2)每孔加神经干细胞诱导液和Let-7b shRNA载体(慢病毒载体)后轻轻摇晃培养板混匀，放置37℃的CO2培养箱(CO2浓度5％)，此时为转染0d；
(3)转染24h时补加诱导液，此时为转染1d，已有部分克隆出现；
(4)转染48h时再次补加诱导液，此时为转染2d，这时大部分细胞可形成克隆，见图2；
(5)转染72h时，基本上大部分细胞都形成克隆，且逐渐增大，见图3，将病毒液吸弃，加嘌呤霉素杀死未转染上的细胞。
神经干细胞诱导液的成分如下：
DMEM/F12培养基，添加：B27(2wt％)、bFGF(10ng/mL)、EGF(10ng/mL)、VC 20(20μg/mL)、VPA(10μg/mL)、polybrene(10ng/mL)、青链霉素(0.4wt％)、L-谷氨酰胺(1wt％)。
步骤四：神经干细胞的扩增培养
细胞由神经干细胞诱导液换成神经干细胞培养液，进行扩增培养，每两天换一次液。
神经干细胞培养液如下：
基础培养基为：DMEM/F12:neurobasal(质量比1:1)，1wt％N2,1wt％B27,1wt％GlutaMAX；需添加的细胞因子：碱性成纤维细胞生长因子bFGF20ng/mL和表皮生长因子EGF20ng/mL。
步骤五：神经干细胞鉴定，分化以及体内移植分化验证。
1.鉴定
(1)将诱导3天和扩增培养2天的神经球取出，放到玻片上，加极少量的培养液以及胎牛血清，或提前用明胶包被玻片，放入37℃的CO2培养箱过夜，使神经球贴壁；
(2)神经球贴壁后用PBS洗两遍，加入后立即吸出，尽量避免晃动；
(3)加4％多聚甲醛室温下固定细胞形态15min；
(4)将液体吸弃，PBS洗三遍，每次5min；
(5)加0.2％Triton-100打孔，室温避光10min；
(6)将液体吸弃，PBS洗三遍，每次5min；
(7)山羊血清封闭液封闭，37℃，45min；
(8)吸出一半山羊血清封闭液，加入一抗(Nestin，Sox2,Pax6等)孵育过夜，4℃，注意保湿；
(9)从4℃冰箱中取出培养板，恢复至室温；
(10)将液体吸弃，PBS洗三遍，每次5min；
(11)加入二抗孵育，37℃，注意保湿；
(12)将液体吸弃，PBS洗三遍，每次5min；
(13)加入Hochest染细胞核，室温8min；
(14)将液体吸弃，PBS洗三遍，每次5min；
(15)抗荧光衰弱封片剂封片，激光共聚焦显微镜拍照，所见干细胞表达Nestin，Sox2，Pax6蛋白，如图4所示。
2.分化
2.1神经元诱导分化：
将神经干细胞种在24孔用纤连蛋白和黏连蛋白混合包被的细胞爬片上，加入分化培养液(Neurobasal Medium+2％B27+500μM dbcAMP+10μM SB43152+10ng/ml BDNF+10ng/ml NT-3+1μM Ken+青链霉素混合液+1％L-谷氨酰胺)，每两天换一次液。继续培养4周后进行细胞免疫化学染色。其中一抗Tuj和MAP2。如图5所示，诱导神经干细胞能分化出MAP2、Tuj阳性的神经元。
2.2星形胶质细胞分化
将神经干细胞种在24孔用纤连蛋白和黏连蛋白混合包被的细胞爬片上，加入分化培养液DMEM/F12+10％胎牛血清+1％DOX+3μM Y-27632+3μM CHIR99021+1％L-谷氨酰胺+1％青链霉素混合液)，每两天换一次液。继续培养4周后进行细胞免疫化学染色。其中一抗Vimentin和GFAP。如图6所示，诱导神经干细胞能分化出Vimentin和GFAP阳性的星型胶质细胞。
2.3少突胶质细胞分化
将神经干细胞种在24孔用纤连蛋白和黏连蛋白混合包被的细胞爬片上，加入分化培养液(DMEM/F12+10％胎牛血清+1％DOX+3μM Y-27632+3μM CHIR99021+10ng/ml PDGF+1％L-谷氨酰胺+1％青链霉素混合液)，每两天换一次液。继续培养4周后进行细胞免疫化学染色。其中一抗MBP和Oligo2。如图7所示，诱导神经干细胞能分化出MBP和Oligo2阳性的少突胶质细胞。
3.体内移植
将诱导3天和扩增培养2天约2x105的神经干细胞用适量PBS洗两遍，加0.25％胰酶37℃消化成单个细胞悬液，PBS清洗后，用10μL的微量进样针吸取2μL。将麻醉过的3-4w C57小鼠固定在脑立体定位仪上并固定微量进样针，用剪刀减掉脑部皮毛，手术刀划开脑部皮肤，暴露小鼠头部，双氧水擦拭，将微量进样针调整到小鼠脑部前囟，以其为零点，调整好坐标(x：-0.22cm y：-0.26cm z：-0.14cm)，缓慢进针，进针3min，注射3min，停针3min，拔针3min；将伤口处缝合后涂抹碘伏消毒，放入鼠笼中用链霉素消毒3天，继续喂养。3周之后，小鼠在冰上麻醉或者戊巴比妥钠麻醉，脑片制备用于后续染色分析。如图8所示，可见MAP2、GFAP、MBP等阳性细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 滨州医学院
<120> 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用
<141> 2020-12-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaccacacaa cctactacct ca 22

Claims (10)

1.一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法，其特征在于，包括：体细胞的分离、提取和扩增；基因敲降载体或基因敲除载体的转染；神经干细胞的扩增培养；
所述的基因敲降载体或基因敲除载体包括阻断let-7基因的shRNA、siRNA、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的let-7基因为let-7b，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；编码所述的shRNA的DNA序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的基因敲降载体或基因敲除载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或质粒载体所构建形成的shRNA、RNAi、CRISPR基因编辑载体或相关microRNA抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的体细胞为成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞、上皮细胞、表皮细胞或毛囊细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞、人***成纤维细胞、人眼睑成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的基因敲降载体或基因敲除载体的转染为：在神经干细胞诱导液的培养下，重编程体细胞为神经干细胞；
重编程过程在D型多聚赖氨酸、层粘连蛋白、明胶中的一种或数种的组合包被的盖玻片上进行；
所述的神经干细胞诱导液为含有细胞培养添加剂、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、维生素C、丙戊酸和聚凝胺的DMEM/F12培养基；
所述的细胞培养添加剂为B27细胞培养添加剂和/或N2细胞培养添加剂。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的神经干细胞的扩增培养为在神经干细胞培养液中进行培养2天以上。
8.一种神经干细胞，通过如权利要求1-7任一项所述的方法获得。
9.一种如权利要求8所述的神经干细胞在制备治疗神经细胞病变疾病的药物或制剂中的应用，其特征在于，所述的神经细胞病变疾病为神经退行性疾病，损伤性疾病，基因突变疾病或继发外伤、缺血、溢血导致的神经***病变。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的神经细胞病变疾病为阿尔兹海默病、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化、亨廷顿舞蹈病、脊髓损伤、脑中风、脑卒中或自闭症。
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