CN112608306B

CN112608306B - 皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮a的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112608306B
Application number: CN202011524948.9A
Authority: CN
Inventors: 曹彦刚; 曾梦楠; 冯卫生; 郑晓珂; 齐曼; 阚玉璇
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112608306A

Abstract

本发明涉及皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法及其应用，可有效解决快速从皂角刺中提取黄酮类化合物牡荆素，实现制备抗脓毒症急性肾损伤药物中的应用问题，皂角刺用丙酮提取，减压浓缩，蒸馏水混悬，再依次石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，乙酸乙酯萃取部位的浸膏经硅胶柱色谱初步分离，再经硅胶柱色谱进一步分离，采用半制备液相进行纯化，收集洗脱液，减压浓缩、干燥，得到4''‑(6‑羟基‑2,6‑二甲基‑2,7‑二烯辛酰基)‑牡荆素，本发明分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，纯度高，所得提取物对脂多糖诱导的肾损伤具有较好的保护作用，有效用于制备治疗脓毒症或者其它感染因素引起的肾损伤的药物。

Description

皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法及其应用。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒症常见并发症，是脓毒症患者病死率升高的独立危险因素，其严重程度与脓毒症的高病死率显著相关。随着我国人口老龄化的加剧、侵入性医疗手段和免疫抑制剂的应用，脓毒症急性肾损伤的发病率呈逐年升高趋势。有研究表明，住院脓毒症患者中急性肾损伤发病率为68.4％，院内死亡率高达30.2％。脓毒症患者易并生急性肾损伤，而急性肾损伤又加重了脓毒症患者的病情。脓毒症合并急性肾损伤患者预后更差，病死率约为脓毒症无急性肾损伤患者的2倍。幸存者也有患慢性肾病甚至终末期肾病的风险，从而给家庭和社会带来沉重的负担。脓毒症引起的急性肾损伤已经成为危害我国居民健康越来越重要的疾病之一，由此带来的经济负担和对社会发展的不良影响日益突显。如何预防和治疗脓毒症并发症急性肾损伤，成为非常严峻的医学问题。

中草药在细胞保护方面的应用历史悠久，从中草药中寻找具有肾细胞保护的活性物质，研制特异性强、毒副作用小的新型药物具有重要的社会效益和经济效益。

皂角刺为皂荚属皂荚(Gleditsia sinensis Lam.)的干燥棘刺，又称皂刺，皂针，天丁等，具有消肿托毒、排脓、杀虫等功效。皂角刺广泛分布于我国河南、河北、江苏等省区，在日本、韩国也有广泛分布，全年均可采收。化学成分研究表明皂角刺主要含有黄酮类，酚酸类和萜类等成分，黄酮类化合物为皂角刺中主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等活性。但至今未见有从皂角刺中提取黄酮类化合物用于制备抗脓毒症急性肾损伤药物的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法及其应用，可有效解决快速从皂角刺中提取黄酮类化合物皂角新酮A，实现制备抗脓毒症急性肾损伤药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A，分子结构式为：

其制备方法包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8-10倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2-3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏(皂角刺粗提取物)；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以mL计，以下同，如浓缩物为1g时，蒸馏水为3-5mL；

(2)初步分离，方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为25:1、12:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为20mL/min，每200mL为1个流份，每个梯度洗脱250min，收集初步分离的二氯甲烷-甲醇体积比为12:1洗脱流份；

(3)再次分离，将初步分离的二氯甲烷-甲醇体积比为12:1洗脱流份再经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为20:1、10:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为10mL/min，每50mL为1个流份，每个梯度洗脱120min，收集得再次分离的二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份；

(4)纯化，将再次分离的二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为39:61的甲醇-水进行洗脱，流速为3mL/min，洗脱30min，收集洗脱液，45℃减压浓缩、干燥，得到皂角新酮A(化合物1)。

本发明采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用硅胶柱色谱法结合制备液相分离纯化，建立了皂角刺中一个痕量的黄酮类化合物皂角新酮A的快速制备方法。该方法分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，得到的目标成分纯度高，所得提取物对脂多糖诱导的肾损伤具有较好的保护作用，有效用于制备治疗脓毒症或者其它感染因素引起的肾损伤的药物，开拓了皂角刺的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。

附图说明

图1为本发明化合物皂角新酮A的分子结构图。

图2为本发明化合物皂角新酮A对小鼠肾血浆炎症因子的影响图，其中A、B、C、D分别为按照TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-17检测试剂盒，采用ELISA法检测血浆中炎症因子的表达图。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，一种皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺5.12kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积4倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏(92.7g皂角刺粗提取物)；

(2)初步分离，方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏用过100-200目筛的硅胶100g拌样，上含有过100-200目筛的硅胶1000g的硅胶柱，经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为25:1、12:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为20mL/min，每200mL为1个流份，每个梯度洗脱250min，收集初步分离的二氯甲烷-甲醇体积比为12:1洗脱流份；

(4)纯化，将再次分离的二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为39:61的甲醇-水进行洗脱，流速为3mL/min，洗脱30min，收集洗脱液，45℃减压浓缩、干燥，得皂角新酮A(化合物1)。

实施例2

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺4.57kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量10倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积3倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏(83.5g皂角刺粗提取物)；

(2)初步分离，方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏用过100-200目筛的硅胶90g拌样，上含有过100-200目筛的硅胶900g的硅胶柱，经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为25:1、12:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为20mL/min，每200mL为1个流份，每个梯度洗脱250min，收集初步分离的二氯甲烷-甲醇体积比为12:1洗脱流份；

实施例3

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺5.76kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量9倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏(95.8g皂角刺粗提取物)；

实施例4

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺4.82kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏(87.6g皂角刺粗提取物)；

一、化合物结构鉴定(以实施例1为例)：

上述化合物经过核磁共振光谱(¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定了其化学结构：

化合物1：黄色粉末，易溶于甲醇。

–12.1(c 0.02,CH₃OH),经HR ESI MS测定得到其准分子离子峰[M+H]⁺m/z:599.2120(C₃₁H₃₅O₁₂计算值为599.2123)。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)中，δ4.81和4.74处出现2个一氢宽单峰，提示这2个氢为末端双键上的两个氢信号；δ8.07(2H,d,J＝8.8Hz,H-2',6')和6.98(2H,d,J＝8.8Hz,H-3',5')为一个1,4-二取代苯环上的氢信号；高场区δ3～4之间有六个氢信号峰，根据δ4.79(1H，d，J＝9.9Hz，H-1”)，猜测存在一个糖结构，δ4.79是糖的端基氢信号；δ1.82(3H，s，9”'-CH₃)，1.18(3H，s，10”'-CH₃)是两个甲基的氢信号。

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)中共出现31个碳信号，δ182.3为羰基碳信号，综合HSQC和HMBC可以知道δ182.3(C-4)，164.0(C-2)，162.8(C-7)，161.5(C-4')，160.8(C-5)，156.1(C-9)，129.0(C-2',6')，121.7(C-1')，116.2(C-3',5')，104.4(C-10)，104.3(C-8)，102.6(C-3)，98.4(C-6)，是黄酮结构片段C₆-C₃-C₆，结合糖上的6个碳信号，δ79.7(C-5”)，75.8(C-3”)，73.8(C-1”)，71.9(C-4”)，71.4(C-2”)，61.4(C-6”)，以上信号与牡荆素基本一致。此外，碳谱中还有10个碳信号，观察化学位移发现，这些信号为6-羟基-2,6-二甲基-2,7-二烯辛酰基的信号。

HMBC谱中，H-4”(δ5.03)与C-1”'有远程相关，提示6-羟基-2,6-二甲基-2,7-二烯辛酰基连在C-4”上。综合以上分析，可得出化合物的结构，为4”-(6-羟基-2,6-二甲基-2,7-二烯辛酰基)-牡荆素，文献检索发现为一新化合物，命名为皂角新酮A。

表1皂角新酮A的核磁数据

a NMR spectroscopic data were recorded in CD₃OD at 500MHz(¹H NMR)and125MHz(¹³CNMR)

上述化合物属于皂角刺中具有肾细胞保护活性的黄酮类化合物皂角新酮A。

实施例2-4的化合物粉末经过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(同实施例1中的化合物的结构鉴定)，分子结构相同，均为皂角刺中具有肾细胞保护活性的黄酮类化合物皂角新酮A。

二、活性实验

本发明方法提取分离的皂角新酮A(化合物1)经实验，可有效抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK 52e)的凋亡，体内实验结果表明，皂角新酮A可有效缓解LPS对小鼠肾脏造成的损伤，可用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，并经实验得到了充分证明，有关实验资料如下：

1、皂角新酮A(化合物1)对脂多糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK 52e细胞)的保护作用实验：

用DMEM培养基将细胞复苏、传代，取对数期的细胞，以培养基将细胞分散，使成为密度为2×10⁴cell·mL^-1的单细胞悬液，并以每孔0.2mL接种于96孔板中，培养24h后，将细胞分为对照组、模型组及不同用药组，正常组加入等量培养基，模型组加入浓度为1mg·mL^-1的LPS培养基溶液(终浓度为1μg·mL^-1)，不同用药组加入浓度为0.1,1,10,50,100μM的待测化合物和浓度为1μg·mL^-1的脂多糖。培养24h后每孔加入MTT溶液(5mg·mL^-1)20μl，37℃继续培养4小时，小心吸净培养基，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔的吸光度值(A)，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 18.0软件处理得到半数有效浓度(EC₅₀)，重复测试3次，取平均值为最终结果。

通过检测皂角新酮A对LPS诱导的NRK 52e细胞凋亡的影响，EC₅₀值分别为3.0μM，经反复实验均取得了相同或相近似的结果。

2、皂角新酮A(化合物1)抗LPS所致小鼠急性肾功能损伤实验：

(1)实验分组及给药

取32只Balb/c小鼠，适应性喂养后，随机分为对照组、模型组、阳性组、治疗组。模型组、阳性组、治疗组腹腔注射LPS(5mg/kg)造模，对照组腹腔注射等体积的生理盐水，造模2h后，阳性组灌胃给予Trolox(25mg/kg)，治疗组灌胃给予化合物1(20mg/kg)，对照组和模型组给予等体机的生理盐水，连续给药3天，每天两次。末次给药3天后处死动物，收集肾脏组织和血液用于进一步分析。

(2)肾脏组织苏木精-伊红(HE)染色

小鼠肾组织用4％的多聚甲醛浸泡24h，随后用石蜡包埋，切片，厚度约5μm。切片后进行HE染色，并在光学显微镜下观察肾组织形态学改变。与正常组相比，模型组小鼠肾小管上皮细胞出现肿胀、空泡变性，而阳性组、治疗组与模型组相比上述症状明显减轻。

(3)ELISA法检测血浆中炎症因子的表达实验

按照TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-17检测试剂盒说明书完成以下步骤：①标准品的稀释与加样；②加样；③温育；④配液；⑤洗涤；⑥加酶；⑦温育、洗涤；⑧显色；⑨终止；⑩测定并计算。实验结果如图2所示，模型组血浆中TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-17水平显著高于对照组，阳性组与对照组血浆中TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-17水平显著低于模型组。

以上表明，本发明采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用硅胶柱色谱法结合制备液相分离纯化，建立了皂角刺中一个痕量的黄酮类化合物皂角新酮A的快速制备方法。本发明制备出的皂角新酮A可以有效抑制LPS诱导的肾脏细胞凋亡，有效用于制备治疗脓毒症或其它感染因素引起的肾损伤的药物，开辟了皂角刺用于肾细胞保护作用药物的新用途，是治疗肾损伤的药物上的创新，开辟了皂角刺的药用新途径和商业价值，有显著的经济和社会效益。

Claims

1.一种皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A，该皂角新酮A为4”-(6-羟基-2,6-二甲基-2,7-二烯辛酰基)-牡荆素，分子结构式为：

2.权利要求1所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8-10倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2-3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以mL计，以下同，如浓缩物为1g时，蒸馏水为3-5mL；

(4)纯化，将再次分离的二氯甲烷-甲醇体积比为10:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为39:61的甲醇-水进行洗脱，流速为3mL/min，洗脱30min，收集洗脱液，45℃减压浓缩、干燥，得皂角新酮A。

3.根据权利要求2所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺5.12kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积4倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏；

4.根据权利要求2所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺4.57kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量10倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积3倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏；

5.根据权利要求2所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺5.76kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量9倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次3min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏；

6.根据权利要求2所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备粗提取物，方法是，将皂角刺4.82kg粉碎，过40目筛，每次用皂角刺重量8倍的体积浓度为50％的丙酮提取3次，每次2min，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1.2g/mL的浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，再依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏；

7.权利要求1所述的皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮A在制备抗脓毒症急性肾损伤药物中的应用。