CN112575122A - 一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重pcr引物组及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用，所述的多重PCR引物组是由用于检测DAdV‑2的引物和用于检测DuCV的引物组成。采用双重PCR引物组快速检测DAdV‑2和DuCV的双重PCR方法，实现了在同一个反应体系中同时扩增两种病毒，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染。该方法对DAdV‑2和DuCV的检测与鉴别、疫病监测及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。

Description

一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物 组及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域。具体涉及一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用。

背景技术

鸭2型腺病毒(Duck adenovirus 2，DAdV-2)属腺病毒科禽腺病毒属，为线状双链DNA病毒。该病主要发生在20～30日龄鸭，患病鸭主要表现为精神萎靡、沉郁和消瘦，排浅黄白色的粪便。病理变化为肝脏肿大并有白色针尖状坏死点灶，肾脏及脾脏肿大充血，胰腺有白色点状坏死。该病1977年首次在法国的番鸭中流行，2014年奥地利科学家Ana Marek通过高通量测序技术获得该病毒全序列。2015年由陈峰等应用宏基因组学分离、鉴定出国内首株鸭2型腺病毒。目前该病已广泛流行于广东、福建、浙江等水禽养殖密集地区，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

鸭圆环病毒(Duckcircovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属新成员，DuCV常呈潜伏感染，并入侵鸭的免疫***，导致鸭机体的免疫功能下降，对多种条件性病原抵抗性减弱，使其更易遭受其他致病因素的侵袭。而一旦发生混合感染(如鸭流感病毒、鸭腺病毒、鸭大肠杆菌等)，感染鸭机体的死亡率就会大大提升。同时，DuCV还会导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状，所以圆环病毒作为一种重要的病原微生物，对我国养殖业的危害不容忽视。

上述两种病原均为DNA病毒，临床引起症状具有一定的相似性，易发生混合感染，极大的增加临鉴别诊断的难度。而常规的诊断方法，如动物实验、免疫学和病毒分离培养，在临床诊断中存在诊断时间长、敏感性低以及操作繁琐等缺点，在临床中不易于快速诊断上述两种疾病。因此，急需建立一种快速、准确、灵敏的检测方法来诊断和监控上述两种病原，确保养鸭业的健康发展。

PCR是实验室常用检测方法之一，其具有快速、灵敏、成本低、操作简单等优点；该方法不仅能进行快速确定病毒种类，还能检测病毒的早期感染和潜伏感染。但是检测时如果使用扩增单种病毒的引物对待测样品进行鉴别，则可能需要准备多份样品扩增多次才能确定感染的病毒类型，不仅在实际操作中需要增加检测次数，另外还会引起交叉感染。双重PCR是在单一PCR基础上建立起来，其优点在于通过一次PCR的反应，可以同时检测并鉴别两种病原，在临床中具有重要的应用价值。目前国内外尚未报道可同时检测鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒的双重PCR检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法与应用。该引物组解决了单一PCR操作繁琐、交叉污染风险高的问题，能够对鸭群中鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒进行鉴别诊断，对鸭群中鸭圆环病毒和鸭2型腺病毒流行病学调查及防控提供了可靠的检测手段，具有重要的临床应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的

一种用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组，所述的双重PCR引物组由用于检测DAdV-2的引物和用于检测DuCV的引物组成，

用于检测DAdV-2的引物的核苷酸序列为：

上游引物F1：5’-CGATGGAACGACAGTAAA-3’

下游引物R1：5’-AAACGAAAAAGCAAGAGC-3’

用于检测DuCV的引物的核苷酸序列为：

上游引物F2：5’-GTGGTGGGACGGTTACTCGG-3’

下游引物R2：5’-TTTATTGGGAACGGGAGGGT-3’

上述的引物组在制备检测DAdV-2和DuCV的试剂中的应用。

一种含有上述的双重PCR引物组的试剂盒。

采用上述的双重PCR引物组同时检测DAdV-2和DuCV的方法，该方法包括以下步骤：

(1)采用常用方法合成用于检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组；

(2)提取待检测样品的总DNA，以提取的总DNA为模板，采用步骤(1)合成的双重PCR引物组进行PCR扩增反应；

(3)分析PCR扩增产物，进行结果判定。

进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：上游引物F1、下游引物R1以及上游引物F2、下游引物R2各0.5μL，各引物的终浓度为0.4pmol/μL；2×Taq Master Mix酶12.5μL；DNA模板各1μL；灭菌后ddH₂O补足至25μL；所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；94℃90s，94℃20s，54℃30s，72℃20s，30个循环，最后一个循环72℃延伸5min。

进一步地，步骤(3)所述分析PCR扩增产物具体为对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类；样品中有DAdV-2时，扩增产物中会出现598bp左右的条带；样品中有DuCV时，扩增产物中会出现297bp左右的条带；样品中含有DAdV-2和DuCV混合感染时，扩增产物中会出现598bp和297bp左右两条条带。

与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果

本发明提供了一种能够快速检测DAdV-2和DuCV两种病毒的双重PCR引物组，前期通过对DAdV-2和DuCV两种病毒全基因组分析，依据其保守基因区设计了上述两对引物，引物组退火温度相近，扩增目的片段大小接近，两对引物之间无相互干扰，才使得后续组成引物组使用；该引物组在实际操作中，仅对DAdV-2和DuCV两种病毒基因组进行扩增，而不引起非特异性的反应，引物组特异性强；

本发明的快速检测DAdV-2和DuCV两种病毒的双重PCR方法可以对同一份样品获取的DNA为模板，进行PCR扩增；并根据扩增产物的大小，通过琼脂糖凝胶电泳判断待检样品感染病毒种类，实现在同一个反应体系中同时扩增两种病毒；

本发明检测方法在实际操作中简便，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染，节约检测时间和试剂消耗。由于建立的检测方法针对的病毒保守区基因扩增，其针对性强，灵敏度高，最少核酸检出量达到pg级。在临床检测中能够达到简便、经济、快捷和准确的检验要求；

通过本发明建立的双重PCR方法，实现在同一反应管中同时对两种病原体的鉴别检测，对动物源性产品中DAdV-2和DuCV的检测与鉴别、疫病监测及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1为鸭2型腺病毒不同退火温度结果图；

M：Marker 2000；泳道1：51.9℃；泳道2：53.8℃；泳道3：56.1℃；泳道4：58.0℃；泳道5：59.2℃；

图2为鸭腺圆环病毒不同退火温度结果图；

M：Marker 2000；泳道1：50.5℃；泳道2：53.1℃；泳道3：54.9℃；泳道4：56.4℃；泳道5：57.4℃；

图3DAdV-2和DuCV双重PCR不同引物浓度条件下的检测结果图；

M：Marker 2000；泳道1：引物浓度20pmol/μL；泳道2：引物浓度10pmol/μL；泳道3：引物浓度5pmol/μL；泳道4：引物浓度1pmol/μL；泳道5：引物浓度0.5pmol/μL；

图4为DAdV-2和DuCV双重PCR与单一PCR结果比较图；M：Marker 2000；泳道1：DAdV-2和DuCV双重PCR电泳结果；泳道2：DAdV-2单一PCR电泳结果；泳道3：DuCV单一PCR电泳结果；

图5为DAdV-2和DuCV双重PCR引物特异性电泳结果图；

M：Marker 2000；泳道1：DAdV-2和DuCV病毒混合核酸；泳道2：DAdV-2病毒核酸；泳道3：DuCV病毒核酸；泳道4：鸭坦布苏病毒核酸；泳道5：鸭病毒性肝炎Ⅰ型核酸；泳道6：鸭大肠杆菌核酸；泳道7：鸭疫里氏杆菌核酸；泳道8：鸭源禽多杀性巴氏杆菌核酸；泳道9：鸭呼肠孤病毒核酸；泳道10：鸭瘟病毒核酸；泳道11：鸭细小病毒核酸；泳道12：阴性对照；

图6为DAdV-2和DuCV双重PCR敏感性试验结果图；

M：Marker 2000；泳道1-5：DAdV-2和DuCV混合核酸10^-1～10^-5稀释度核酸电泳结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

以下实施例中所用样品具体如下：试验用阳性病料、菌毒株及临床样品

试验用阳性病料：含有鸭圆环病毒的阳性病料由商丘美兰生物工程有限公司鉴定和保存。

试验用菌毒株：鸭2型腺病毒、鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎Ⅰ型、鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭细小病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌均由商丘美兰生物工程有限公司鉴定和保存。临床样品均来自2019～2020年不同省份送检疑似病料，共计83份。

实施例1

用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组的建立：

(1)引物设计与合成

根据GenBank上已报道的DAdV-2和DuCV的全基因组序列，对不同毒株基因组的比对和分析，筛选其较为保守的核酸片段，应用Primer5.0引物设计软件设计了两对针对上述两种病毒的特异性引物，并通过NCBI(https://www.ncbi.nih.gov/)对两对引物进行在线分析。最终筛选出两对引物，如表1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。两对引物能够特异性的扩增出598bp(DAdV-2)和297bp(DuCV)的特异性片段。

表1双重PCR引物组信息序列

(2)待测样品核酸的提取

待测样品核酸的提取：选取疑似发病动物无菌采集其内脏组织(心脏、肝脏和脾脏)约5g，在超净操作台用手术剪刀将上述病料组织剪碎，用PBS按照5:1(W/V)进行稀释后，放置-70℃反复冻融三次，上述待测样品及对照菌毒株按照病毒基因组提取试剂盒(TIANamp Virus DNA/RNA Kit)进行核酸的提取，提取后核酸置-70℃保存备用。

反转录反应条件：50℃保温30min，70℃保温5min；得到的cDNA保存于-20℃，用于PCR扩增。反转录PCR体系，如表2所示。

表2反转录PCR体系

(3)单一PCR扩增及扩增序列验证

取-70℃条件下保存的DAdV-2和DuCV的DNA为模板，利用实施例1中设计的2对特异性引物分别进行单一PCR扩增。单一PCR反应体系按照试剂盒的25uL扩增体系进行扩增，如表3。反应条件为94℃90s，94℃20s，50～60℃30s，72℃20s，30个循环，最后一个循环72℃延伸5min。PCR产物经2.0％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。试验结果如图1、图2所示，将上述PCR产物经纯化试剂盒纯化目的基因，由生工生物工程(上海)有限公司测序。测序结果经NCBI(https://www.ncbi.nih.gov/)在线比对，为DAdV-2和DuCV病毒。

表3 PCR反应体系

(4)双重PCR引物组的建立

双重PCR反应体系及反应条件优化：在反应条件不变的条件下(94℃90s，94℃20s，54℃30s，72℃20s，30个循环，最后一个循环72℃延伸5min)，将相同浓度的DAdV-2和DuCV提取的DNA混合后作为双重PCR模板，对双重PCR反应条件进行优化。

引物浓度筛选：所用反应体系为2×Taq Master Mix 12.5μl，两对上、下游引物各0.5μl，DNA模板各1μl，ddH₂O补足25μl；选取20pmol/μL、10pmol/μL、5pmol/μL、1pmol/μL、0.5pmol/μL共计5个不同的引物浓度梯度进行PCR扩增，进行引物浓度筛选，结果如图3所示(目的条带的大小和亮度，可以作为判断引物浓度扩增结果的指标；不同的引物浓度均可以特异性扩增出目的条带，但随着引物浓度的降低，引物与模板基因结合的概率也相对降低，目的条带的亮度逐渐减弱，目的条带逐渐变小；但在引物浓度为0.5pmol/μL较低浓度下，仍能够扩增出目的基因)。

反应体系体积的筛选：在引物浓度为10pmol/μL条件下，分别选择12.5μL、25μL和50μL的反应体系进行扩增。考虑经济性和操作简便性，最终选择的双重PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μl，两对上、下游引物各0.5μl(10pmol/μL)，cDNA模板各1μl，ddH₂O补足至25μL。

利用上述优化的条件对DAdV-2和DuCV进行双重PCR扩增，电泳结果显示，双重PCR可同时扩增出DAdV-2598bp和DuCV297bp特异性目的条带，与单一PCR结果一致，如图4所示。

实施例2

双重PCR引物组特异性试验：

利用建立的双重PCR方法对DAdV-2和DuCV混合DNA模板及鸭病毒性肝炎Ⅰ型、鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒的单一cDNA模板，鸭2型腺病毒、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌的单一DNA模板及ddH₂O进行扩增，扩增结果显示，如图5所示，只有DAdV-2和DuCV的混合DNA模板和DAdV-2、DuCV的单一DNA模板扩增出与目的片段大小相符的条带。对扩增出的DuCV病毒的PCR扩增产物进行基因测序，并对扩增产物序列与参考引物序列进行生物信息学软件分析，两者核苷酸同源性达到96％以上，分析结果证实PCR扩增产物为DuCV病毒。

实施例3

双重PCR引物组敏感性试验：

利用分光光度计分别测定DAdV-2和DuCV的DNA浓度分别为67ng、52ng，用灭菌双蒸水对其10倍比梯度稀释。然后取10^-1～10^-5稀释度进行检测，将各稀释度DNA作为模板进行PCR扩增，检测最小检出量，结果如图6所示。

如图6，两种病毒DNA混合物扩增结果表明，该方法对DAdV-2和DuCV的DNA最小检出量分别为0.67pg和5.2pg。

实施例4

临床应用

利用本发明建立的双重PCR引物组进行如下样品的PCR检测，样品包括商丘美兰生物工程有限公司于2019～2020年采集的83份疑似病死鸭内脏作为临床检测样品，结果如表4所示。

将检测结果与单一PCR检测结果进行比较分析，检测结果显示本发明双重PCR检测试剂盒对临床病料检测结果与单一PCR检测结果的吻合率达到100％。对扩增出DAdV-2的阳性产物进行基因测序，并与参考引物序列进行生物信息学软件分析，两者核苷酸同源性达到98％以上，分析结果证实PCR扩增产物为DAdV-2病毒。

表4临床样品检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 商丘美兰生物工程有限公司

<120> 一种用于快速检测鸭2型腺病毒和鸭圆环病毒的双重PCR引物组及其检测方法

与应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于鸭病毒检测

<400> 1

cgatggaacg acagtaaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于鸭病毒检测

<400> 2

aaacgaaaaa gcaagagc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于鸭病毒检测

<400> 3

gtggtgggac ggttactcgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于鸭病毒检测

<400> 4

tttattggga acgggagggt 20

Claims (6)

1.一种用于快速检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组，其特征在于，所述的双重PCR引物组由用于检测DAdV-2的引物和用于检测DuCV的引物组成，

用于检测DAdV-2的引物的核苷酸序列为：

上游引物F1：5’-CGATGGAACGACAGTAAA-3’

下游引物R1：5’-AAACGAAAAAGCAAGAGC-3’

用于检测DuCV的引物的核苷酸序列为：

上游引物F2：5’-GTGGTGGGACGGTTACTCGG-3’

下游引物R2：5’-TTTATTGGGAACGGGAGGGT-3’。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测DAdV-2和DuCV的试剂中的应用。

3.一种含有权利要求1所述的双重PCR引物组的试剂盒。

4.采用权利要求1所述的双重PCR引物组同时检测DAdV-2和DuCV的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)合成用于检测DAdV-2和DuCV的双重PCR引物组；

(2)提取待检测样品的总DNA，以提取的总DNA为模板，采用步骤(1)合成的双重PCR引物组进行PCR扩增反应；

(3)分析PCR扩增产物，进行结果判定。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：上游引物F1、下游引物R1以及上游引物F2、下游引物R2各0.5μL，各引物的终浓度为0.4pmol/μL；2×Taq Master Mix酶12.5μL；DNA模板各1μL；灭菌后ddH₂O补足至25μL；所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；94℃90s，94℃20s，54℃30s，72℃20s，30个循环，最后一个循环72℃延伸5min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述分析PCR扩增产物具体为对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类；样品中有DAdV-2时，扩增产物中会出现598bp的条带；样品中有DuCV时，扩增产物中会出现297bp的条带；样品中含有DAdV-2和DuCV混合感染时，扩增产物中会出现598bp和297bp两条条带。

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