CN111719020A - 一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针。本发明提出一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒，试剂盒中含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有用于检测牛轮状病毒的引物和探针，引物包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。本发明的试剂盒具有高敏感性、高特异性的技术优势。

Description

一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是造成儿童和幼畜腹泻的主要病原之一，对自然界中各种哺乳动物和鸟类都会造成很大影响。牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)又称犊牛腹泻病毒(Calf diarrhea virus)，属于呼肠孤病毒科(Reoviridea)轮状病毒属(Rotavirus)。牛轮状病毒主要感染1月龄以内的犊牛，其中1周龄以内犊牛最为易感，主要症状包括食欲废绝、精神萎顿、水样腹泻、甚至死亡，其严重程度可以分为无症状感染、温和的自限性腹泻及严重脱水和电解质失衡的重度腹泻，犊牛感染该病毒后的发病率可高达90％～100％，犊牛感染病毒后，容易继发引起细菌感染，促使犊牛的死亡率升高，同时也会严重影响犊牛的生长发育进而影响生产性能，此外轮状病毒也可以感染人、绵羊、仔猪、犬、猫、鸡、马、兔、恒河猴和鼠等动物。

犊牛腹泻是造成养牛业损失的重要原因之一，给牛肉和奶制品生产也造成了直接和间接经济损失。引起犊牛腹泻有很多的病原，包括病毒如BRV、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒等，细菌如沙门氏菌、大肠杆菌等，以及寄生虫。其中，BRV感染的发病率和死亡率均较高，并且容易继发其他病原体的感染，这些病原体导致犊牛腹泻的临床症状高度相似。除此之外，随着养牛业的发展，大规模和集约化的饲养增加了牛与牛之间的身体接触。这往往会导致两种或两种以上病原体的混合感染，从而加速传染病的传播，因此实验室检测显得尤为重要。

目前轮状病毒的主要诊断方法包括分离鉴定、血清中和试验、ELISA技术、PCR、实时荧光定量PCR技术等。病毒分离鉴定是经典技术方法，不过该方法操作繁琐，诊断花费时间较长；血清中和试验和ELISA技术操作简单、特异性较强、应用广泛，不过该方法检测时有严格的要求，因为误差而有可能会引起阳性率下降；传统的PCR技术是1985年研发出来的，不过传统的PCR技术无法对模板DNA定量，并且最后结果是通过电泳辅助才能判读，操作时间相对长，并且会出现假阳性；1993年Higuchi等人发明了实时荧光定量PCR技术，是将荧光物质与传统PCR技术结合起来，让扩增产物发出荧光。该技术综合了光谱技术、传统的PCR技术和计算机技术，其灵敏度高，特异性强，并且可以监测PCR扩增的所有过程，还能对样品准确定量。但已有的PCR扩增技术尚存在敏感性、特异性不足的缺陷。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一发明目的在于提供一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒。

本发明的第二发明目的在于提供一种检测牛轮状病毒的引物和探针。

为了完成上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提出一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测牛轮状病毒的引物和探针，所述引物包括由SEQ IDNO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。

可选的，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

可选的，所述荧光基团选自HEX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1。

可选的，所述引物和所述探针的浓度分别为：上游引物为350～450nmol/L，下游引物为350～450nmol/L，探针为250～350nmol/L；

所述引物和所述探针的浓度分别为：上游引物为400nmol/L，下游引物为400nmol/L，探针为350nmol/L。

可选的，所述核酸扩增试剂中还含有2×Reaction Buffer、DNA聚合酶和RTEnzyme Mix。

可选的，所述试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品中含有重组质粒，所述重组质粒包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

可选的，所述试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有重组质粒，所述重组质粒包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本发明还提出一种用于检测牛轮状病毒的引物和探针，所述引物包括由SEQ IDNO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。

可选的，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，优选的，所述荧光基团选自HEX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1。

本发明还提出一种包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的重组质粒。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明的试剂盒具有高敏感性、高特异性的技术优势。

附图说明

图1为pMD19T-BRV PCR电泳图，M为500bp DNA Marker，1为阴性对照，2-4为pMD19T-BRV PCR产物；

图2为定量RT-PCR扩增结果图，1为阳性质粒，2为总RNA，3为阴性对照；

图3为定量RT-PCR引物浓度优化结果，1-5分别为300nmol/L、350nmol/L、400nmol/L、450nmol/L和500nmol/L，6为阴性对照；

图4为定量RT-PCR探针浓度优化结果，1-5分别为150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L和350nmol/L，6为阴性对照；

图5为定量RT-PCR标准曲线扩增曲线，1-6为1×10⁸copies/μL～1×10³copies/μL，7为阴性对照；

图6为定量RT-PCR标准曲线；

图7为定量RT-PCR敏感性检测结果，1-9为1×10¹～1×10⁹copies/μL，10为阴性对照；

图8为普通RT-PCR敏感性检测结果，M为DL 500DNA Marker，1-9为1×10¹～1×10⁹copies/μL质粒模板扩增条带，10为阴性对照；

图9为特异性检测结果，1为RNA；2为阳性质粒；3为分别为阴性对照和其他病毒核酸；

图10为重复性检测结果，1为1×10 ⁶copies/μ、2为1×10⁵copies/μL，3为1×10⁴copies/μL，4为阴性对照；

图11为临床样品普通RT-PCR检测结果，M为500bp DNA Ladder，1-13为临床样品扩增产物，14-15为阳性对照，16为阴性对照；

图12为临床样品普通RT-PCR检测结果，M为500bp DNA Ladder，17-33为临床样品扩增产物，34-35为阳性对照，36为阴性对照；

图13为定量RT-PCR的临床样品检测结果，1为阳性对照，2为阴性对照和30份临床牛腹泻样品；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本发明的范围。

具体实施方式

下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明实施例参考GenBank上发表的BRV Sun9分离株(AB-374146.1)、KJ9-1分离株(HM-988974.1)、KJ19-2分离株(MF-940662)、KV0418分离株(EU873011.1)、KV0426分离株(EU873012.1)和M-1分离株(HM235508.1)的VP6全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取VP6基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BRV-F1,BRV-R1和BRV-P，探针5'端的荧光报告集团为HEX，BHQ1为3'端的荧光淬灭集团。

具体的，引物和探针序列如表1所示。

表1

可选的，引物和所探针的浓度分别为：上游引物为350～450nmol/L，下游引物为350～450nmol/L，探针为250～350nmol/L。

优选的，引物和探针的浓度分别为：上游引物为350～400nmol/L，下游引物为350～400nmol/L，探针为300～350nmol/L

进一步优选的，引物和探针的浓度分别为：上游引物为400nmol/L，下游引物为400nmol/L，探针为350nmol/L。

可选的，核酸扩增试剂中还含有2×Reaction Buffer、DNA聚合酶和RT EnzymeMix。

可选的，试剂盒中含有用于定量的参考品，参考品中含有重组质粒，重组质粒包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。参考品为一组含有不同浓度的重组质粒的试剂，具体浓度分别为：1×10⁸copies、1×10⁷copies、1×10⁶copies、1×10⁵copies、1×10⁴copies、1×10³copies。

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具体为：

gaattgaatctgcagtttgtgaatcagtgctcgccgacgcaagtgaaacaatgctagcaaatgtgacatctgttagacaagaatacgcgataccagttggacccgtttttccaccaggtatgaattggactgatttgatcactaactattcaccatctagagaggttaacttgcagcgtgtatttacagtggcttccattagaagca

可选的，试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为工艺用水，阳性对照中含有重组质粒，重组质粒包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本发明实施例还提出一种用于检测牛轮状病毒的引物和探针，引物包括由SEQ IDNO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自HEX，荧光淬灭基团选自BHQ1。

本发明实施例还提出一种包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的重组质粒。

本发明实施例和实验例中所用到的试剂有：

Access Quick^TMRT-PCR System试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司；One Step qRT-PCR Kit购于东洋纺公司；6×Loading Buffer、500bpDNA ladder和PremixEx Taq购于TaKaRa公司；回收琼脂糖凝胶的试剂盒购于Axygen公司；质粒小提试剂盒、RNase-Free ddH₂O和RNAsimple Total RNA Kit购于北京天根(TIANGEN)生化科技有限公司。

实施例1试剂盒

一种检测试剂盒，其组成如表2所示：

表2

本发明实施例试剂盒的使用方法为：

1、样本处理：

进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取RNA)，阴性对照与标本同时处理。提取完的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存。

2、扩增试剂准备：

从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，模板PCR反应液体系1人份均按如下配制：10μL 2×Reaction Buffer+0.5μL DNA Polymerase+0.5μL RT Enzyme Mix+1.0μL上下游引物(10μmol/L)+0.5μL探针+5.5μL RNase-Free ddH₂O，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管19μl的量，分装于各PCR管内。

参考品PCR反应液体系1人份配制与模板PCR反应液体系1人份配制相同。

3、加样：

取出试剂盒中对照品、两组参考品以及样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别加至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为20μl。盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后，将其移至检测扩增区。

4、PCR扩增：

PCR扩增的条件具体如表3所示：

表3

5、检测：

(1)基线的确定：选择荧光曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。

(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。

(3)计算机自动处理和分析数据。

实施例2牛轮状病毒TaqMan定量RT-PCR标准品的制备

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组质粒pMD19T-BRV。主要参考GenBank上发表的BRV Sun9分离株(AB-374146.1)、KJ9-1分离株(HM-988974.1)、KJ19-2分离株(MF-940662)、KV0418分离株(EU873011.1)、KV0426分离株(EU873012.1)和M-1分离株(HM235508.1)的VP6全基因序列，合成一段全长207bp的BRV VP6基因序列，具体如SEQ IDNO:4所示，并将该序列连接到pMD^TM19-T Vector克隆载体上，获得重组质粒pMD19T-BRV。

1、常规PCR产物的重组质粒pMD19T-BRV鉴定

已合成的质粒DNA pMD19T-BRV作为模板，用上下游特异性引物进行PCR扩增。如图1，获得大小约为207bp的条带，说明牛轮状病毒的目的基因片段与克隆载体pMD^TM19-TVector已连接成功。

反应体系：12.5μL 2×Taq PCR Master Mix、9.5μL RNase-Free ddH₂O、上下游引物和Mix均为1.0μL。

反应程序：95℃预变性5min、95℃变性20s、54℃退火30s、72℃延伸30s和72℃终延伸10min，35个循环。

2、BRV重组质粒DNA拷贝数的计算及稀释

测定重组质粒pMD19T-BRV的浓度，并通过计算公式：质粒拷贝数(copies/μL)＝6.02×(重组质粒浓度ng/μL×10^-9)×10²³/(660×重组质粒碱基数)计算质粒拷贝数。制备阳性标准品时使用三蒸水对重组质粒pMD19T-BRV进行10倍梯度稀释。

BRV阳性质粒浓度为72.15ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为2.27×10¹⁰copies/μL。把该质粒DNA稀释成1×10⁹～1×10¹copies/μL九个梯度制备成标准阳性模板。

实施例3定量RT-PCR反应体系及参数优化

BRV定量RT-PCR反应参数如表3所示，BRV定量RT-PCR 20μL反应体系如表4所示：

表4

使用CFX96 Real-time PCR仪扩增BRV阳性质粒样品和BRV总RNA，如图2所示，有良好的扩增效果。

2.2.4.2引物浓度优化

模板为BRV的标准阳性重组质粒DNA，分别吸取上下游引物各0.6μL(浓度300nmol/L)、0.7μL(浓度350nmol/L)、0.8μL(浓度400nmol/L)、0.9μL(浓度450nmol/L)、1μL(浓度500nmol/L)来进行BRV引物浓度的优化。反应参数与体系，参考表3和表4。

实验结果如图3所示。从图3中可看出，Ct值最小，扩增曲线良好的引物浓度是400nmol/L。因此本发明实施例的最佳引物浓度选400nmol/L。

2.2.4.3探针浓度优化

模板为BRV的标准阳性重组质粒DNA，引物浓度取2.2.4.2中优化好的浓度，探针各加0.3μL(浓度150nmol/L)、0.4μL(浓度200nmol/L)、0.5μL(浓度250nmol/L)、0.6μL(浓度300nmol/L)、0.7μL(浓度350nmol/L)来进行BRV探针浓度的优化，反应参数与体系，参考表3和表4。

实验结果如图4所示。从图4中可看出，Ct值最小，扩增曲线良好的探针浓度是350nmol/L。因此本发明实施例的最佳探针浓度选350nmol/L。

2.2.4.4荧光定量RT-PCR标准曲线的建立

模板为1×10³copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁷copies/μL和1×10⁸copies/μL共6个标准阳性质粒，使用引物和探针最佳浓度进行反应，建立检测BRV定量RT-PCR的标准曲线。如图5所示。

从图6中得出的标准曲线回归方程为y＝-3.488x+46.176，相关系数达0.995。

实施例4荧光定量RT-PCR的敏感性试验

模板为1×10¹copies/μL、1×10²copies/μL、1×10³copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁷copies/μL、1×10⁸copies/μL、和1×10⁹copies/μL共9个标准阳性质粒，阴性对照为ddH₂O。进行常规PCR和定量RT-PCR，从而得出常规PCR和定量RT-PCR检测方法能够检出的最低浓度。得到的实验结果如图7(定量RT-PCR)和图8(常规RT-PCR)所示。

根据图7和图8可知，本发明实施例建立的BRV定量RT-PCR最低能检出浓度为1×10¹copies/μL的质粒，而常规RT-PCR最低能检出浓度为1×10³copies/μL的质粒，两者相差100倍。

实施例5荧光定量RT-PCR的特异性试验

为了确定该方法的特异性，分别提取牛病毒性腹泻病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒的核酸作为模板，阳性对照为1×10⁶copies/μL的标准阳性质粒和BRV总RNA，阴性对照为ddH₂O进行定量RT-PCR。

应用建立的定量RT-PCR方法对牛病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、沙门菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛呼吸道合胞体病毒核酸进行检测。实验结果如图9所示。

从图9可看出，除了模板为BRV的阳性质粒和RNA产生了扩增曲线，其他病毒的核酸未产生扩增曲线。

实施例6荧光定量RT-PCR的重复性试验

选用三个不同浓度的标准品，即1×10⁴copies/μL、1×10⁵copies/μL和1×10⁶copies/μL，分别作三次组内和组间重复检测，对实验数据进行分析，验证本试验所建立的定量RT-PCR方法的稳定性。

模板为1×10 ⁴copies/μL-1×10⁶copies/μL 3个不同浓度的阳性质粒，进行定量RT-PCR。实验结果如图11所示。

从图10可看出，同一模板Ct值差异不大，扩增曲线也大致相同；同一模版不同拷贝数的组内重复变异系数均小于2％，表明本发明实施例的方法的重复性和稳定性良好。

实施例7定量RT-PCR方法的应用

用普通RT-PCR方法和本试验所建立的牛轮状病毒定量RT-PCR检测方法，对30份牛粪便拭子核酸样品进行检测。

首先对采集的样品进行核酸提取，先后用普通RT-PCR和定量RT-PCR方法进行检测。利用这两种方法检测从内蒙古某发病牛场采集的30份犊牛腹泻病例的粪便样品，普通RT-PCR检出10份BRV阳性病料(图11、图12)，而定量RT-PCR方法检出23份BRV阳性病料(图13)，这23份阳性病料经测序鉴定方法验证均为阳性。具体如表5所示。证明本发明实施例的定量RT-PCR方法的敏感性高于普通RT-PCR方法。

表5

样品编号	Cq	浓度(copies/μl)	判定结果
				1	36.38	1×10<sup>2.8</sup>	阳性
2	33.71	1×10<sup>3.6</sup>	阳性
				3	32.61	1×10<sup>2.7</sup>	阳性
4	37.94	1×10<sup>2.4</sup>	阳性
				5	28.3	1×10<sup>5.1</sup>	阳性
6	40.16	1×10<sup>1.7</sup>	阳性
				7	32.08	1×10<sup>4</sup>	阳性
8	36.16	1×10<sup>2.9</sup>	阳性
				9	35.31	1×10<sup>3</sup>	阳性
10	36.38	1×10<sup>2.8</sup>	阳性
				11	38.17	1×10<sup>2.3</sup>	阳性
12	37.23	1×10<sup>2.6</sup>	阳性
				13	34.34	1×10<sup>3.4</sup>	阳性
14	33.94	1×10<sup>3.5</sup>	阳性
				15	34.58	1×10<sup>3.3</sup>	阳性
16	37.67	1×10<sup>2.4</sup>	阳性
				17	34.97	1×10<sup>3.2</sup>	阳性
18	32.08	1×10<sup>4</sup>	阳性
				19	34.76	1×10<sup>3.3</sup>	阳性
20	34.37	1×10<sup>3.4</sup>	阳性
				21	35.02	1×10<sup>3.2</sup>	阳性
22	40.05	1×10<sup>1.8</sup>	阳性
				23	37.43	1×10<sup>2.5</sup>	阳性

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒及引物和探针

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattgaatc tgcagtttgt gaatc 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcttctaat ggaagccact gt 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagaatacg cgataccagt tggacc 26

<210> 4

<211> 207

<212> DNA

<213> 牛轮状病毒(Bovine rotavirus)

<400> 4

gaattgaatc tgcagtttgt gaatcagtgc tcgccgacgc aagtgaaaca atgctagcaa 60

atgtgacatc tgttagacaa gaatacgcga taccagttgg acccgttttt ccaccaggta 120

tgaattggac tgatttgatc actaactatt caccatctag agaggttaac ttgcagcgtg 180

tatttacagt ggcttccatt agaagca 207

Claims (10)

1.一种用于检测牛轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测牛轮状病毒的引物和探针，所述引物包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自HEX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和所述探针的浓度分别为：上游引物为350～450nmol/L，下游引物为350～450nmol/L，探针为250～350nmol/L；

所述引物和所述探针的浓度优选为：上游引物为400nmol/L，下游引物为400nmol/L，探针为350nmol/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还含有2×Reaction Buffer、DNA聚合酶和RT Enzyme Mix。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品中含有重组质粒，所述重组质粒包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有重组质粒，所述重组质粒包含由SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。

8.一种用于检测牛轮状病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述探针包括由SEQ ID NO:3所示的探针。

9.根据权利要求8所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，优选的，所述荧光基团选自HEX，所述荧光淬灭基团选自BHQ1。

10.一种包含由SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的重组质粒。

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