CN112574928B - 一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用，属于农用制剂技术领域。本发明所述寒地秸秆腐解菌剂包括低温菌群和常温菌群；所述低温菌群包括细胞数含量为20～28％的植物乳杆菌、17～25％的乳酸乳球菌乳酸亚种、14～22％的乳球菌、11～22％的球形节杆菌和9～18％的红球菌；所述常温菌群为木质纤维素分解菌群。本发明提供的产品能在低温条件下启动发酵，促进秸秆在低温条件下分解，提高耕地内秸秆原位分解效率，解决我国寒冷地区水稻田夏季秸秆腐解剧烈引起的死苗和减产难题。
Description
技术领域
本发明属于农用制剂技术领域，具体涉及一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用。
背景技术
秸秆是世界上产量最大的可再生资源。据不完全统计，全世界每年的秸秆产量为850亿吨，仅我国作物秸秆产量每年就达8.5亿吨。秸秆中的木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素、灰分等物质结合在一起，这使纤维素难于被水解，因此被比喻成“混凝土”。东北粮食主产区秸秆量巨大，随着耕地产投比边际效应急剧下降，退化的黑土亟待培肥，急需秸秆还田腐解菌剂提高低温条件下秸秆分解效率。
东北地区年均3～6℃，低温条件下大量废弃秸秆腐解缓慢，随意堆砌又占用耕地，不仅浪费宝贵资源还危害农村生态环境。粮食产区内大量剩余秸秆，若未处理直接还田或采用现有菌剂腐解还田会出现夏季高温期秸秆腐解剧烈产生热量和气体集中释放引发的烧苗和减产问题，以及分解不彻底的秸秆影响本茬和下茬作物生长的难题。虽然东北地区年平均温度3～6℃，但每年春末和夏季，即6～9月份温度迅速上升，尤其7～8月份日均最低温18～21℃，日均最高温27～31℃，月平均温度20～29℃，耕地中分解秸秆的微生物随着温度升高而逐渐活跃，微生物剧烈地腐解秸秆产生的生物热和气体集中释放破坏作物根系，导致根部组织破坏或松动、植株变黄出现烧苗、死苗，这种烧苗现象在水稻田尤为突出，严重时引起水稻减产20～40％。农民为了避免减产，每年7～8月份需将水田中的水排出再将水放回，反复操作2～3次，增加人力、物力等投入。
当前低温分解秸秆菌已有发明专利，如：申请号CN201610224388.2的发明公开了一种用于秸秆低温发酵的复合微生物菌剂，包括绿色木霉菌，黑曲霉，枯草芽孢杆菌，乳酸球菌，乳酸片球菌和环状芽胞杆菌。该菌剂在低温4～15℃条件下，12天左右可将秸秆腐解变黑，秸秆基本腐熟。但该菌剂适用范围是将秸秆收集制作堆肥，并不适用于耕地中的秸秆原位腐解还田，在北方寒冷地区的农田实验结果表明，CN201610224388.2的发明用于耕地中原位腐解秸秆的效果不够理想。
申请号CN201811581735.2的发明公开了一种耐低温降解纤维素复合菌剂，包括约氏黄杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌，耐低温纤维素降解菌剂中总有效活菌数为3×109CFU/g以上，该菌剂在8～16℃条件下，45天降解率为50％。尽管该菌剂适用范围是原位腐解还田菌剂，但该菌剂施用量为4.5kg/亩，通常在东北地区低温纤维素分解菌剂用量为0.5～1kg/亩，而CN201811581735.2菌剂用量是常规菌剂用量的4.5～9倍。该菌剂在实际使用中，消耗的运输、喷施等人力和经济成本较高。
发明内容
鉴于背景技术中存在的寒区或低温条件下秸秆转化效率低，现有菌剂原位还田的腐解缓慢，在夏季高温秸秆集中分解时期出现秸秆分解剧烈引发烧根、烧苗、减产等影响作物生长的系列问题，本发明提供了一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用。本发明提供的寒地秸秆腐解菌剂能在低温条件下，快速启动发酵，促进秸秆在低温条件下分解转化，避免春末和夏季高温时期，秸秆分解剧烈产生的生物热或气体集中释放导致伤苗和减产问题。
本发明提供了一种寒地秸秆腐解菌剂，包括低温菌群和常温菌群；所述低温菌群包括细胞数含量为20～28％的植物乳杆菌、17～25％的乳酸乳球菌乳酸亚种、14～22％的乳球菌、11～22％的球形节杆菌和9～18％的红球菌；所述常温菌群为木质纤维素分解菌群。
优选的，所述低温菌群制成冻干粉或包埋于微胶囊。
优选的，所述冻干粉或所述微胶囊载体包括低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂；所述低温菌保护剂包括脱脂乳粉、a-吡喃葡萄糖、NaCl、甘油、乳糖、聚乙二醇和海藻糖中的一种或多种；所述低温菌抗氧化剂包括维生素E、生育酚、半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸钠、特丁基对苯二酚、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠中的一种或多种；所述低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂的质量比为3～20:1；所述低温菌群菌体的质量为低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂质量之和的6～8倍。
优选的，所述微胶囊载体还包括基体材料和凝固剂；所述基体材料包括海藻酸钠和/或壳聚糖；所述凝固剂包括CaCl2。
优选的，所述常温菌群包括细胞数含量为20～27％的米曲霉、17～24％的草酸青霉、14～21％的绿色木霉、3～9％的斜卧青霉、11～18％的枯草芽孢杆菌、8～15％的解纤维梭菌、5～12％的蜡状芽孢杆菌、3～5％的酿酒酵母和3～5％的季也蒙毕赤酵母。
优选的，将所述常温菌群与常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂混合，制得常温菌群菌粉；所述常温菌保护剂包括甘油、聚乙二醇、蛋白胨、吐温、海藻糖、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰中的一种或多种；所述常温菌抗氧化剂包括香菇碎屑、白蘑菇碎屑、白屈菜碎屑、废茶叶粉末、丹参粉末、甘草碎屑、丁香碎屑、乌附子粉末、没食子酸粉末和过氧化物歧化酶SOD中的一种或多种；所述常温菌保护剂与常温菌抗氧化剂的质量比为1:(1～10)；所述常温菌群菌体的质量为常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂质量之和的6～7倍。
优选的，所述低温菌群和常温菌群的细胞数含量比例为1:(3～6)。
本发明提供了上述寒地秸秆腐解菌剂的制作方法，包括菌群培养的步骤，所述菌群培养包括低温菌群培养和常温菌群培养；所述低温菌群培养用培养基包括碳源5～25g/L，K2HPO40.8～1.2g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，蛋白胨2～10g/L、牛肉膏2～10g/L、酵母粉1～5g/L、MgSO4·7H2O 0.08～0.12g/L、乙酸钠1.8～2.2g/L、柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/L、MnSO4·H2O 0.04～0.06g/L和Tween 800.8～1.2mL/L；所述碳源包括葡萄糖和/或蔗糖；所述常温菌群培养用培养基包括(NH4)2SO41.2～1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L，KH2PO41.8～2.2g/L，CaCO31.8～2.2g/L，蛋白胨2.2～2.8g/L，FeSO4·7H2O 4～6mg/L，MnSO41.2～2mg/L，ZnCl21.4～2mg/L，CoCl21.4～2mg/L和秸秆6～10g/L。
本发明提供了上述寒地秸秆腐解菌剂在秸秆腐解中的应用。
优选的，所述应用包括：将寒地秸秆腐解菌剂用于秸秆原位还田，所述寒地秸秆腐解菌剂的施用量为0.5～1.2kg/亩。
有益效果：本发明提供了一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用。所述低温腐解菌剂包括1个低温菌群和1个常温木质纤维素分解菌群，其中低温菌群能够在1～4℃生长繁殖，最适合生长温度为10℃～15℃。低温菌群在低温条件下生长、繁殖、代谢过程中产生的生物热能为常温菌群的生长提供了适宜的温度环境，常温菌群即木质纤维素分解菌群在生长繁殖过程中将木质纤维素代谢与转化。
在优选的方案中，本发明采用冻干粉或微胶囊载体包埋低温菌群，减少存储过程中室温或高温对低温菌群细胞膜中脂类、蛋白质分子的损伤，保护了菌体活性，提高低温菌在常温条件下的菌剂存活率和保持酶活性。微胶囊处理能使低温菌群较长时间的保持活性，进而使同批次生产的低温菌群使用寿命与常温菌群相匹配。本发明制得的产品能长时间保持菌株存活率、菌群组成多样性、菌种健康状态及分解秸秆的性能。
本发明将上述寒地秸秆腐解菌剂应用于秸秆腐解(尤其是水田原位腐解还田培肥耕地)，在寒冷地区4～5月份菌剂启动耕地中秸秆腐解反应，秸秆分解产生气体和热量随时释放，能有效缓解或减少7～9月份秸秆集中剧烈地分解产生热量和气体对苗根部和植株的伤害。
本发明提供的寒地秸秆腐解菌剂等技术，能将秸秆不移出耕地即可原位分解为腐殖质回还土壤有效促进农牧有机废弃物循环，避免将秸秆运出耕地集中建堆生产有机肥后，再将有机肥运回耕地等环节，极大降低秸秆制作有机肥过程中运输、建堆、运回农田所消耗人力、能源动力等费用，为改善寒区耕地退化、秸秆综合利用等问题提供技术保障，有利于促进农业生态***的可持续发展。
生物保藏信息说明
本发明具体实施方式中带保藏编号的微生物均可从相应保藏单位购买获得。所涉及的保藏机构及地址如下：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，地址为北京市海淀区中关村南大街12号；中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。
附图说明
图1为本发明实施例3所述实验的水稻秸秆减重分析情况图；
图2为本发明实施例4所述实验的土壤腐殖质含量变化情况图；
图3为本发明实施例5所述实验的耕地有机质变化图；
图4为本发明实施例6所述实验的纤维素酶含量变化情况图；
图5为本发明实施例7所述实验的内切性纤维素酶活情况图；
图6为本发明实施例7所述实验的秸秆剩余量情况图；
图7为本发明实施例8所述4种处理方式低温菌群的存活率情况图。
具体实施方式
本发明提供了一种寒地秸秆腐解菌剂，包括低温菌群和常温菌群。
本发明所述低温菌群包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳球菌(Lactococcus lactis)、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)和红球菌(Rhodococcus sp.)。所述植物乳杆菌的细胞数含量为20～28％，优选为24～26％，更优选为25％；所述乳酸乳球菌乳酸亚种的细胞数含量为17～25％，优选为21～23％，更优选为22％；所述乳球菌的细胞数含量为14～22％，优选为18～20％，更优选为19％；所述球形节杆菌的细胞数含量为11～22％，优选为18～20％，更优选为19％；所述红球菌的细胞数含量为9～18％，优选为14～16％，更优选为15％。除特别限定外，本发明对上述各菌种的来源不作要求，常规市售渠道获得均可。在本发明优选的实施例中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC-1.12974；所述乳酸乳球菌乳酸亚种的保藏编号为：CGMCC-1.2030；所述乳球菌的保藏编号为：CGMCC-1.15072；所述球形节杆菌的保藏编号为CICC-23557；所述红球菌的保藏编号为CICC-20603。
本发明对上述低温菌群的来源和制作方法不作特别限定，本领域常规方法获得上述低温菌群即可。在本发明备选的一种方案中：分别购买得到上述各菌的独立菌剂，然后按细胞数比例混合，得到上述低温菌群。在本发明备选的另一种方案中：将上述各菌种在改良低温菌培养基中低温培养，获得上述低温菌群。本发明优选将5种菌按优选比例混合后进行长期低温驯化处理，所述驯化处理是指：从20℃开始培养各菌的混合菌群，定期检测微生物的生物量OD，待菌群的生物量OD上升至1.6所需时间稳定一致后，将培养温度下降3℃再继续培养，直至温度降低至4℃培养时，检测微生物的生物量OD，待OD上升至1.6所需时间稳定一致时，获得低温菌群，且低温菌群需在4℃培养。北方地区4～5月份温度约5～22℃，4℃培养有助于低温菌群保持低温环境下生长与繁殖的活力。所述低温菌培养时间优选为3～15d，更优选为6～8d。
在本发明所述低温菌群培养中，所述低温菌群培养用培养基包括：碳源5～25g/L，K2HPO40.8～1.2g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，蛋白胨2～10g/L、牛肉膏2～10g/L、酵母粉1～5g/L、MgSO4·7H2O 0.08～0.12g/L、乙酸钠1.8～2.2g/L、柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/L、MnSO4·H2O 0.04～0.06g/L、Tween 800.8～1.2mL/L；优选地，包括：碳源10～20g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，蛋白胨4～8g/L、牛肉膏4～8g/L、酵母粉2～4g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、Tween 801.0mL/L。所述碳源优选包括葡萄糖和/或蔗糖。本发明对上述各组分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。所述低温菌群培养后优选通过离心的方式获得低温菌体；所述离心的转速优选为4000rpm；离心的时间优选为5min。
本发明低温菌群培养后获得低温菌体，优选将所述低温菌体与低温菌保护材料混合，得到低温菌混合料。在本发明中，所述低温菌保护材料包括低温菌保护剂和低温菌抗氧化剂。所述低温菌保护剂优选包括脱脂乳粉、a-吡喃葡萄糖、NaCl、甘油、乳糖、聚乙二醇和海藻糖中的一种或多种，更优选为脱脂乳粉或甘油；所述低温菌抗氧化剂优选包括维生素E、生育酚、半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸钠、特丁基对苯二酚、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠中的一种或多种，更优选为维生素E或抗坏血酸钠。所述低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂的质量比优选为3～20:1，更优选为4～10:1，更优选为5:1。所述低温菌体的质量优选为低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂质量之和的6～8倍，更优选为7倍。
得到低温菌混合料后，本发明优选将所述低温菌混合料制成微胶囊剂或冻干粉。本发明对所述微胶囊剂或冻干粉的制备方法不作特别限定，本领域常规方法均可。
本发明所述常温菌群为木质纤维素分解菌群，优选包括米曲霉(Aspergillusoryzae)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。所述米曲霉的细胞数含量优选为20～27％，更优选为21～24％，更优选为22％；所述草酸青霉的细胞数含量优选为17～24％，更优选为18～21％，更优选为19％；所述绿色木霉的细胞数含量优选为14～21％，更优选为15～18％，更优选为16％；所述斜卧青霉的细胞数含量优选为3～9％，更优选为4～7％，更优选为5％；所述枯草芽孢杆菌的细胞数含量优选为11～18％，更优选为12～15％，更优选为13％；所述解纤维梭菌的细胞数含量优选为8～15％，更优选为9～12％，更优选为10％；所述蜡状芽孢杆菌的细胞数含量优选为5～12％，更优选为6～8％，更优选为7％；所述酿酒酵母的细胞数含量优选为3～5％，更优选为4％；所述季也蒙毕赤酵母的细胞数含量优选为3～5％，更优选为4％。除特别限定外，本发明对上述各菌种的来源不作要求，常规市售渠道获得均可。在本发明优选的实施例中，所述米曲霉的保藏编号为CGMCC-3.7203；所述草酸青霉的保藏编号为：CGMCC-3.15651；所述绿色木霉的保藏编号为：CGMCC-3.3744；所述斜卧青霉的保藏编号为CGMCC-3.3195；所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC-1.15792；所述解纤维梭菌的保藏编号为ACCC-00528；所述蜡状芽孢杆菌的保藏编号为：CICC-10042；所述酿酒酵母的保藏编号为CICC-1012；所述季也蒙毕赤酵母的保藏编号为CICC-1951。
本发明对上述常温菌群的制作方法不作特别限定，本领域常规方法获得上述常温菌群均可发挥相应作用。在本发明备选的一种方案中：分别购买得到上述各菌的独立菌剂，然后按细胞数比例混合，得到上述常温菌群。在本发明备选的另一种方案中：通过常温菌群培养的方式，获得上述常温菌群。
在本发明所述常温菌群培养中，所述常温菌群培养用培养基包括：(NH4)2SO41.2～1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L，KH2PO41.8～2.2g/L，CaCO31.8～2.2g/L，蛋白胨2.2～2.8g/L，FeSO4·7H2O 4～6mg/L，MnSO41.2～2mg/L，ZnCl21.4～2mg/L，CoCl21.4～2mg/L，秸秆6～10g/L；优选的，包括：(NH4)2SO41.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCO32.0g/L，蛋白胨2.5g/L，FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，CoCl21.7 mg/L，秸秆8g/L。本发明优选将上述常温菌群培养用培养基的pH调至7.2。本发明对上述各组分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述常温菌群培养的温度优选为20～30℃，更优选为21～29℃，更优选为25～28℃；所述常温菌群培养的时间优选为10～20d，更优选为14～15d。所述常温菌群培养后优选通过离心的方式获得常温菌体；所述离心的转速优选为4000rpm；离心的时间优选为5min。
本发明常温菌群培养后获得常温菌体，优选将所述常温菌体与常温菌保护材料混合，得到常温菌混合料。在本发明中，所述常温菌保护材料包括常温菌保护剂和常温菌抗氧化剂。所述常温菌保护剂优选包括甘油、聚乙二醇、吐温、海藻糖、蛋白胨、无水乙酸钠、磷酸氢二钾和硫酸镁和硫酸锰中的一种或多种，更优选为甘油；所述常温菌抗氧化剂优选包括香菇碎屑、白蘑菇碎屑、白屈菜碎屑、废茶叶粉末、丹参粉末、甘草碎屑、丁香碎屑、乌附子粉末、没食子酸和过氧化物歧化酶SOD中的一种或多种，更优选为香菇碎屑；所述常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂的质量比优选为1:(1～10)，更优选为1:(2～5)，更优选为1:3；所述常温菌体的质量优选为常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂质量之和的6～7倍。
得到常温菌混合料后，本发明优选将所述常温菌混合料真空喷雾干燥，获得常温菌粉。在本发明中，喷雾干燥进风口温度优选为80～105℃，更优选为90℃。
在本发明所述寒地秸秆腐解菌剂中，低温菌群和常温菌群的细胞数含量比例优选为1:(3～6)，更优选为1:4。当低温菌群制成含有低温菌保护材料的微胶囊，常温菌群制成含有常温菌保护材料的常温菌粉时，所述微胶囊与所述常温菌粉的质量比优选为1～2:4～8。
本发明提供了上述寒地秸秆腐解菌剂的制作方法：分别制得低温菌群和常温菌群，得到本发明所述寒地秸秆腐解菌剂。在本发明中，所述低温菌群和常温菌群的制作方法参见上文所述内容。
本发明提供了上述寒地秸秆腐解菌剂在秸秆腐解中的应用。优选的，所述应用包括：将寒地秸秆腐解菌剂用于秸秆原位还田。在本发明中，所述原位还田优选为水田原位还田。在使用前，本发明优选对所述寒地秸秆腐解菌剂进行预培养。所述预培养用培养基中优选含有0.08～0.14kg/L的尿素和0.04～0.08kg/L的红糖(或白糖)；所述预培养的时间优选为1～2d。在使用时，本发明优选将所述寒地秸秆腐解菌剂喷洒在秸秆表面，然后翻埋秸秆到耕地中；所述翻埋的深度优选为10～20cm，更优选为15～18cm；所述土壤的含水量优选为55～65％。在本发明中，所述寒地秸秆腐解菌剂的施用量优选为0.5～1.2kg/亩，更优选为1kg/亩。施用本发明提供的寒地秸秆腐解菌剂后，不需要再施用底肥，可省去施用底肥的费用。
本发明所述寒地主要指我国年平均温度4～6℃寒冷地区。本发明所述寒地秸秆腐解菌剂适宜降解秸秆的自然温度优选为4～32℃，更优选为10～30℃，最优选为15～28℃。寒地秸秆腐解菌剂在过高或过低温度下分解秸秆能力会减弱。本发明提供的秸秆腐解菌剂适用于我国北方寒冷地区，在我国中原和南方也具有一定的普适性。施用本发明的寒地秸秆腐解菌剂进行秸秆还田，比未进行秸秆还田的处理，减施原化肥用量20-30％。
在更具体的实施方式中，将本发明提供的寒地秸秆腐解菌剂应用于我国黑龙江省泰来县宁姜乡、黑龙江省建三江地区秸秆全量500-600kg/亩原位腐解还田，未出现减产和死苗现象。因我国北方3～5月份温度较低，尤其是4～5月份日均最低温3～11℃，日均最高温15～22℃，平均温度9～21℃。而9～21℃在本发明的寒地秸秆腐解菌剂生长与繁殖的温度范围内，本菌剂能在4～5月份启动田间秸秆腐解反应，秸秆在4～5月份分解产生气体和热量随时释放，缓解或减少7～9月份集中剧烈地分解秸秆产生热量和气体对苗根部和植株的伤害。前期结果表明：本菌剂原位腐解还田的实验田中未出现一例死苗、烧苗现象，且作物产量有小幅度增产。
下面结合实施例对本发明提供的一种寒地秸秆腐解菌剂及制作方法和应用进行详细的说明。实施例中对照试验所涉及的4个市售秸秆分解菌剂来源分别如下：CK1：北京德瑞丰农业科技有限责任公司(土卫一号)；CK2：黑龙江禾煦丰生态科技有限公司(微18秸秆腐熟剂)；CK3：黑龙江省达丰科技开发有限责任公司(秸秆粪便发酵酵素：酵素3号)；CK4：鑫台农农业科技发展有限公司(鑫台农三合一秸秆腐熟营养剂)。需要注意，以下实施例仅用作对本发明技术构思的解释说明，不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种寒地秸秆腐解菌剂，其组成为：低温菌群微胶囊和常温木质纤维素分解菌群的菌粉。
(1)低温菌群微胶囊的制作：
①配制改良低温菌培养基：配制得到含有葡萄糖15g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0g/L，蛋白胨6g/L、牛肉膏6g/L、酵母粉3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、Tween 801mL/L的改良低温菌培养基。用500mL的蓝盖瓶分装，每瓶装350mL。4℃冰箱内放置备用。
②菌群培养：将植物乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳球菌、球形节杆菌和红球菌接种至改良低温菌培养基中。4℃培养8d，测定各菌种细胞数的百分比含量如下：植物乳杆菌25％、乳酸乳球菌乳酸亚种22％、乳球菌19％、球形节杆菌19％、红球菌15％。4000rpm离心5min获得低温菌群菌体。
③低温菌群菌体中添加保护材料，得到低温菌混合料：以脱脂乳粉为保护剂，以维生素E作为抗氧化剂，低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂、低温菌群菌体的质量比为＝5:1:42。
④微胶囊制备：将100g低温菌混合料与50mL质量体积浓度(g/mL)为2％的海藻酸钠溶液混合均匀，滴入50mL质量体积浓度(g/mL)为2.5％CaCl2溶液中，搅拌生成凝胶珠，固化定型45min。添加到50mL质量体积浓度(g/mL)为0.3％的壳聚糖溶液中，搅拌覆膜45min，制成微胶囊。
(2)常温木质纤维素分解菌群的菌粉制剂的制作：
①配制秸秆分解培养基：配制得到含有(NH4)2SO41.4 g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCO32.0 g/L，蛋白胨2.5g/L，FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，CoCl21.7 mg/L，秸秆8g/L的秸秆分解培养基。pH调至7.2。用500mL的三角瓶分装，每瓶装300mL。20～25℃室温放置备用。
②常温木质纤维素分解菌群培养：将米曲霉、草酸青霉、绿色木霉、斜卧青霉、枯草芽孢杆菌、解纤维梭菌、蜡状芽孢杆菌、酿酒酵母和季也蒙毕赤酵母接种至秸秆分解培养基中。20～25℃培养15d，测定各菌种细胞数的百分比含量如下：米曲霉22％、草酸青霉19％、绿色木霉16％、斜卧青霉5％、枯草芽孢杆菌13％、解纤维梭菌10％、蜡状芽孢杆菌7％、酿酒酵母4％和季也蒙毕赤酵母4％。4000rpm离心5min获得常温菌群菌体。
③常温菌群菌体中添加保护材料：以甘油为保护剂，以香菇碎屑为抗氧化剂，常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂、常温菌群菌体的质量比为1:3:28。
④菌粉制备：将含保护材料的常温菌群菌体低温喷雾干燥，得到菌粉。进风口温度为90℃，获得常温木质纤维素分解菌菌粉。
(3)分别制作得到低温菌群微胶囊与常温木质纤维素分解菌群的菌粉，配合使用。使用时，低温菌群微胶囊与常温木质纤维素分解菌群的菌粉的质量比为2：1。
实施例2
一种寒地秸秆腐解菌剂，其组成为：低温菌群冻干粉和常温木质纤维素分解菌群的菌粉。
(1)低温菌群冻干粉的制作：
①配制改良低温菌培养基：配制得到含有葡萄糖15g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0g/L，蛋白胨6g/L、牛肉膏6g/L、酵母粉3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、Tween 801mL/L的改良低温菌培养基。用500mL的蓝盖瓶分装，每瓶装350mL。4℃冰箱内放置备用。
②菌群培养：将植物乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳球菌、球形节杆菌和红球菌接种至改良低温菌培养基中。4℃培养8d，测定各菌种细胞数的百分比含量如下：植物乳杆菌25％、乳酸乳球菌乳酸亚种22％、乳球菌19％、球形节杆菌19％、红球菌15％。4000rpm离心5min获得低温菌群菌体。
③低温菌群菌体中添加保护材料：以甘油为保护剂，以抗坏血酸钠作为抗氧化剂，低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂、低温菌群菌体的质量比为＝5:1:42。
④低温菌群冻干粉制备：添加保护材料的菌体在-40℃预冷12个小时，用冷冻干燥机冷冻干燥16小时，获得低温菌群冻干粉。
(2)常温木质纤维素分解菌群的菌粉制剂的制作。(同实施例1)
(3)分别制作得到低温菌群冻干粉与常温木质纤维素分解菌群的菌粉，配合使用。使用时，低温菌群冻干粉与常温木质纤维素分解菌群的菌粉的质量比为1：4。
实施例3
将实施例1制得的本菌剂作为实验组，与4种市售的秸秆分解菌剂CK1、CK2、CK3、CK4同时接种在以水稻秸秆为唯一碳源培养基上，28℃发酵15天，测定水稻秸秆的减重能力。不同处理下，水稻秸秆减重的分析情况如图1所示。由图1可以看出：本菌剂、CK1、CK2、CK3、CK4处理下的秸秆减重分别为0.72g、0.67g、0.63g、0.58g、0.54g，减重率分别为44.2％、41.10％、38.65％、35.58％、33.12％。说明本菌剂在相同条件下的秸秆转化能力比实验所用的4种市售菌剂能力强。
实施例4
将实施例1制得的本菌剂作为实验组，本菌剂与4种市售的秸秆分解菌剂CK1、CK2、CK3、CK4设置室内模拟田间实验：在43*33*15cm规格方盒内放10斤土、秸秆25g、自来水6L、尿素1g，将秸秆上平铺2cm厚土避免上浮，分别将50mL的本菌剂、CK1、CK2、CK3、CK4均匀喷洒到方盒内，2020年1月1日起放置在10～20℃控温大棚，每2周喷洒相同质量自来水增加水分。分别在实验当天、6个月、9个月测定土壤腐殖质含量，分析9个月之内各菌剂在不受环境、天气等外界干扰的情况下本菌剂对秸秆的转化能力。不同处理下，分解秸秆6个月、9个月土壤腐殖质含量变化情况见图2：本菌剂、CK1、CK2、CK3、CK4的腐殖质6个月分别为29.26g/kg、27.33g/kg、22.23g/kg、19.32g/kg、19.56g/kg，9个月分别为41.56g/kg、38.90g/kg、36.49g/kg、36.36g/kg、36.33g/kg，相比于4种市售菌剂，本菌剂对秸秆转化秸秆产生腐殖质能力更强。
实施例5
将实施例2制得的本菌剂作为实验组，本菌剂与4种市售的秸秆分解菌剂CK1、CK2、CK3、CK4分别在泰来县宁姜乡勤俭村(隶属第一积温带年活动积温2600-2700℃，年均气温5.0℃，无霜期135天)进行水稻田腐解秸秆实验，每个稻田池为标准667m2的一亩方池，两稻田池间设土墙约20cm高、20cm宽的隔离，且每稻田池间隔一个非试验的稻田池，池与池间土墙间隔，不进行水和土的交流，一共设10亩地，每处理2重复。全量还田秸秆量为500kg秸秆/667m2、秸秆粉碎至7cm左右，每种菌剂均按照各自说明书规定的最佳使用量和使用方法，于4月初均匀喷洒秸秆和耕地上，秸秆平铺、均匀、不聚堆；通过深耕翻地将秸秆埋入15～18cm深耕地中，减施原化肥总量的30％，分别测定还田前、还田后2个月、3个月、5个月测定耕地有机质变化。
不同处理下，原位还田2个月、3个月、5个月土壤有机质含量变化见图3。由图3可以看出：本菌剂喷施的耕地中有机质含量相较4组对照耕地中含量更高。本菌剂还田前耕地中有机质平均含量为29.16g/kg，5个实验地块秸秆还田2个月、3个月、5个月后平均有机质分别为32.68g/kg、30.64g/kg、29.49g/kg，而施用本菌剂秸秆还田2个月、3个月、5个月有机质对应为34.70g/kg、32.50g/kg、31.51g/kg，显著高于平均值。结合图3耕地有机质含量对比，也说明本菌剂转化秸秆能力相较更强。
实施例6
将实施例2制得的本菌剂作为实验组，本菌剂与4种市售的秸秆分解菌剂CK1、CK2、CK3、CK4分别在泰来县宁姜乡勤俭村实施秸秆原位还田，还田后2个月、5个月测定土壤中纤维素酶活性。纤维素酶是一类能够将木质纤维素转化为葡萄糖的复合酶系的总称，纤维素酶活性大小能客观体现转化木质纤维素的能力强弱，是菌剂转化木质纤维素能力的一个重要评定指标。
不同处理下，原位还田2个月、5个月的纤维素酶含量变化情况见图4。由图4可见：5组菌剂喷施的耕地中纤维素酶第2个月分别为1.63mg/g、1.49mg/g、1.55mg/g、1.39mg/g、1.35mg/g，第5个月分别为1.53mg/g、1.37mg/g、1.43mg/g、1.38mg/g、1.37mg/g，4个对照第2个月与第5个月平均值分别为1.49mg/g、1.41mg/g，而本菌剂处理的耕地第2个月与第5个月分别为1.64mg/g、1.53mg/g，显著高于4个对照菌剂的平均值，说明本菌剂能够在黑龙江低温寒冷地区分解秸秆有较好的效率。
实施例7
配制改良低温菌培养基：配制得到含有蔗糖25g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，蛋白胨6g/L、牛肉膏6g/L、酵母粉3g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、Tween 80 1mL/L的改良低温菌培养基。用500mL的蓝盖瓶分装，每瓶装350mL。4℃冰箱内放置备用。配制秸秆分解培养基(L)：(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O0.3 g，KH2PO42.0 g，CaCO32.0 g，蛋白胨2.5g，FeSO4·7H2O 5.0mg，MnSO41.6 mg，ZnCl21.7mg，CoCl21.7mg，pH调至中性，秸秆10g/L。用500mL培养瓶，每瓶装300mL，高温高压灭菌。将培养7d的20mL常温木质纤维素分解菌群+6mL低温菌群转接到新鲜的培养基中，作为本菌剂；接种20mL常温木质纤维素分解菌群+6mL无菌新鲜培养基，作为常温菌；接种20mL低温菌+6mL无菌新鲜培养基，作为低温菌，每处理3瓶，18～20℃静止培养，分别在第1、3、5、8、14d取样，测定纤维素内切酶活性、水稻秸秆减重等指标，验证本菌剂、常温菌群、低温菌群分别对秸秆的转化差异。结果见图5、图6。
由图5可见，本菌剂、常温菌群、低温菌群在14天最高纤维素内切酶的活性分别为62.15U/mL、56.31U/mL、3.97U/mL；第1、3、5、8、14d本菌剂与常温菌群的内切酶酶活变化趋势始终相同，只是本菌剂比常温菌群的内切酶活性始终稍高；但14天之内，低温菌的纤维素内切酶活性活始终较低，当低温菌与常温菌组合后却有促进或提升常温菌纤维素酶活性的能力。
由图6可见，对比14天本菌剂、常温菌群、低温菌群转化秸秆剩余量可见，低温菌群处理的秸秆几乎没变化，而常温菌与本菌剂都有较好的分解秸秆的能力，尽管本菌剂是常温菌群与低温菌群两菌群组合，但组合后的本菌剂分解秸秆的能力并不是2个菌群分解能力简单叠加，虽然低温菌群分解秸秆类大分子有机质能力差，但能转化秸秆代谢中间产物，如二糖、酸类、醇类、脂类等物质，从而减少或消除秸秆分解产物引起的代谢产物的阻遏或抑制，促进秸秆的分解。
实施例8
4种不同处理方式对产品活性的影响
将实施例7制得的低温菌群4000rpm离心5min，制备成50％含菌量的菌悬液，菌悬液用平板涂布法计算菌落数，菌悬液中添加质量比7：1的保护材料(脱脂粉：抗坏血酸钠＝5：1)，制备成含保护材料的低温菌。
处理1：将含保护材料的低温菌添加载体(玉米面、米糠＝5：1)，低温菌与载体质量比为2：1，作为普通保护处理菌剂；
处理2：将含保护材料的低温菌与体积比2％海藻酸钠用无菌注射器逐滴挤压入2.5％氯化钙溶液中制成海藻酸钠微胶囊；
处理3：将含保护材料的低温菌与2％海藻酸钠与2％壳聚糖1：2混合用无菌注射器逐滴挤压入2.5％氯化钙溶液中制成海藻酸钠+壳聚糖微胶囊；
处理4：菌悬液用冷冻干燥技术制成冻干粉。
同时将上述4种方式处理的成品在室温(20-25℃)相同条件下放置6个月，分别在1、2、4、5、6个月取样测定低温菌存活率，结果如图7所示：4种处理(普通保护、海藻酸钠、海藻酸钠+壳聚糖、冻干粉)对低温菌群存活率影响较大，对比4种处理所对应的曲线可见菌剂存活率由低到高依次为：普通保护<海藻酸钠<海藻酸钠+壳聚糖<冻干粉，储存6个月后存活率分别为27.6％、59.8％、67.8％、85.1％，结果说明冷冻干燥制成冻干粉存储方式更有利于低温菌群室温下保藏使用，有更多的微生物存活有利于保持菌种的最佳活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种寒地秸秆腐解菌剂，其特征在于，包括低温菌群和常温菌群；所述低温菌群包括细胞数含量为25％的植物乳杆菌、22％的乳酸乳球菌乳酸亚种、19％的乳球菌、19％的球形节杆菌和15％的红球菌；所述常温菌群为木质纤维素分解菌群；
所述低温菌群制成冻干粉或包埋于微胶囊载体；
所述冻干粉或所述微胶囊载体包括低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂；所述低温菌保护剂包括脱脂乳粉、a-吡喃葡萄糖、NaCl、甘油、乳糖、聚乙二醇和海藻糖中的一种或多种；所述低温菌抗氧化剂包括维生素E、生育酚、半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸钠、特丁基对苯二酚、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠中的一种或多种；所述低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂的质量比为5:1；
所述低温菌群菌体的质量为低温菌保护剂、低温菌抗氧化剂质量之和的6倍；
所述微胶囊载体还包括基体材料和凝固剂；所述基体材料包括海藻酸钠和/或壳聚糖；所述凝固剂包括CaCl2；
所述常温菌群包括细胞数含量为22％的米曲霉、19％的草酸青霉、16％的绿色木霉、5％的斜卧青霉、13％的枯草芽孢杆菌、10％的解纤维梭菌、7％的蜡状芽孢杆菌、4％的酿酒酵母和4％的季也蒙毕赤酵母；
将所述常温菌群与常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂混合，制得常温菌群菌粉；所述常温菌保护剂包括甘油、聚乙二醇、蛋白胨、吐温、海藻糖、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰中的一种或多种；所述常温菌抗氧化剂包括香菇碎屑、白蘑菇碎屑、白屈菜碎屑、废茶叶粉末、丹参粉末、甘草碎屑、丁香碎屑、乌附子粉末、没食子酸粉末和过氧化物歧化酶SOD中的一种或多种；所述常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂的质量比为1:3；所述常温菌群菌体的质量为常温菌保护剂、常温菌抗氧化剂质量之和的7倍；
所述低温菌群和常温菌群的细胞数含量比例为1:(3～6)。
2.权利要求1所述寒地秸秆腐解菌剂的制作方法，其特征在于，包括菌群培养的步骤，所述菌群培养包括低温菌群培养和常温菌群培养；所述低温菌群培养用培养基包括碳源5～25g/L，K2HPO40.8～1.2g/L，KH2PO40.8～1.2g/L，蛋白胨2～10g/L、牛肉膏2～10g/L、酵母粉1～5g/L、MgSO4 ·7H2O0.08～0.12g/L、乙酸钠1.8～2.2g/L、柠檬酸氢二铵1.8～2.2g/L、MnSO4·H2O0.04～0.06g/L和Tween80 0.8～1.2mL/L；所述碳源包括葡萄糖和/或蔗糖；所述常温菌群培养用培养基包括(NH4)2SO41.2～1.6g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.4g/L，KH2PO4 1.8～2.2g/L，CaCO31.8～2.2g/L，蛋白胨2.2～2.8g/L，FeSO4·7H2O4～6mg/L，MnSO41.2～2mg/L，ZnCl21.4～2mg/L，CoCl21.4～2mg/L和秸秆6～10g/L。
3.权利要求1所述寒地秸秆腐解菌剂、权利要求2所述制作方法制作得到的寒地秸秆腐解菌剂在秸秆腐解中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将寒地秸秆腐解菌剂用于秸秆原位还田，所述寒地秸秆腐解菌剂的施用量为0.5～1.2kg/亩。
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