CN103087973A - 一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法。采集年平均气温在-0.6～8℃的高寒地区的富含纤维素的自然物样品，先进行纤维素降解菌系的富集培养，然后经过限制性继代培养初筛、低温梯度诱导驯化和纤维素酶活复筛，再进行低温多代限制性碳源继代培养驯化，得到秸秆低温降解复合菌系。通过本发明方法筛选和驯化出低温下高效降解玉米秸秆的复合菌系，对促进北方地区秸秆资源的还田利用意义重大。

Description

一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法

技术领域

本发明属于农业(微生物)技术领域，具体涉及一种作物秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化技术。

背景技术

作物秸秆是丰富的自然资源，我国是农业大国，每年产秸秆6亿吨以上，其中只有一小部分被利用。秸秆原位还田是提升土壤有机质、合理利用资源、解决环境污染的有效手段，但秸秆进入土壤后，腐解缓慢，对耕作与农艺操作产生诸多不利影响，限制了其推广。特别是在我国北方，由于冬季时间长，气温偏低，作物秸秆降解慢、腐解效果差已成为限制秸秆还田利用的瓶颈。利用微生物技术处理秸秆是提高秸秆利用率的有效途径，前人有大量的研究，并筛选驯化出在28-50℃下降解秸秆的单菌株，而在低温(20～15℃)条件下具有高效降解能力的菌系还未见报道。通过建立规范而有效的筛选和驯化秸秆低温降解菌系的方法，为筛选出低温条件下具有较高降解效率的作物秸秆降解菌系提供技术支撑，促进秸秆的快速腐解，对于促进我国北方地区秸秆资源充分利用、农田地力培肥和农业可持续发展具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种作物秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，特别是针对我国北方地区播种面积最大的作物——玉米，筛选其秸秆降解菌系对促进北方地区秸秆资源的还田利用意义重大。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，包括以下步骤：

1)富集培养：采集年平均气温在-0.6℃～8℃的高寒地区的富含纤维素的自然物样品，对样品进行纤维素降解菌系的富集培养，获得富集培养物；

2)初筛：将富集培养物接种到滤纸条培养基中，以28℃为初始培养温度，培养多代后选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高，pH接近中性(pH6.5～7.5)的培养物，按每转接一次培养温度降低1-2℃的梯度进行继代培养，至培养温度降低至15℃～20℃的某一温度时，在该温度下连续继代培养，至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养，挑选出纤维素降解能力保持较好的菌系；

3)复筛：对初筛菌系进行CMC酶相对活性和纤维素酶活的检测，选出酶活性高的复合菌系；

4)驯化：将复筛得到的复合菌系在15℃～20℃的某一温度下，以秸秆和滤纸分别为唯一碳源进行交替继代培养，转接培养到多代次以后，选择秸秆分解能力强，培养物pH近中性(pH6.5～7.5)的菌系，为低温降解菌系。

上述方法中，步骤1)可采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然作物秸秆粉摇床培养等方法富集培养，选择滤纸溃烂程度高、滤纸断裂时间短、降解秸秆效果好的样品。

步骤1)中所述富含纤维素的自然物样品包括但不限于：年平均气温在-0.6℃～8℃的高寒地区的腐烂秸秆、腐烂落叶、朽木、烂草、动物粪便、堆肥、锯末、食用菌栽培下脚料、麦田土、树林土、多年秸秆还田土壤、菜园土、草原土等材料。

优选的，上述步骤2)从初始培养温度28℃开始，培养4代，选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高、pH接近中性(pH6.5～7.5)的培养物继续传代，每传一代降低1-2℃的梯度进行培养，直至培养温度降低至15～20℃的某一温度，在该温度条件下连续培养，直至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养。

上述步骤3)将初筛的菌系接到纤维素刚果红培养基上，在15～20℃的某一温度下培养，通过刚果红水解圈和菌落大小计算CMC酶相对活性，同时在该温度下将初筛菌系于液体发酵培养基中培养后并检测过滤液的纤维素酶活，选出酶活性高的复合菌系。其中所述纤维素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和C1酶活，综合CMC酶相对活性、Cx酶活、FPA酶活和C1酶活四项指标。

上述步骤4)是进行多代限制性碳源继代培养驯化，将复筛得到的菌系以秸秆和滤纸分别为唯一碳源进行交替培养驯化，培养温度优选为15℃，转接培养到4～6代以后，选择分解能力强，pH近中性(pH6.5～7.5)的菌系。

本发明中所述作物秸秆尤其指玉米秸秆，培养基中作为碳源的玉米秸秆通过下述方法得到：将成熟收获后的玉米秸秆晾干后剪成小块，再烘干，灭菌备用。

本发明的优点及有益效果是：本发明针对北方地区冬季时间长，气温偏低，作物秸秆降解慢、腐解效果差这些限制因素，从年平均气温-0.6℃～-8℃的高寒地区富含纤维素的锯末、烂草、羊粪、草原土等作为菌源采集菌种，通过限制性继代培养和低温梯度诱导驯化方法，高效构建低温玉米秸秆降解复合菌系。筛选出的低温秸秆降解菌系能够在低温(15℃)条件下高效降解玉米秸秆。需要说明的是，本发明方法并不是针对某种特定微生物的筛选方法，而是筛选和驯化能够在低温下降解秸秆的复合菌系。在高寒地区富含纤维素的自然物中普遍存在纤维素降解菌，本领域技术人员通过本发明的方法能够筛选和驯化出合适的复合菌系，以用于天然作物秸秆的微生物降解处理。

附图说明

图1显示了实施例1的驯化系在液体发酵情况下的玉米秸秆降解率。

图2A显示了将实施例1得到的菌系接种到秸秆上，15℃条件下培养3-4d的各菌系生长情况。

图2B显示了将实施例1得到的菌系接种到秸秆上，15℃培养15d后各菌系降解秸秆的效果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详述，但实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。

实施例1低温降解玉米秸秆的复合菌系筛选

试验于2011-2012年在内蒙古农业大学萨拉齐试验基地微生物实验室进行。

1.材料及菌种来源

采集年平均气温-0.6-8℃的高寒地区的富含纤维素的锯末、烂草、腐烂秸秆、牛羊鸡鸭鸽兔粪、草甸土、森林土、木菇、多年秸秆还田土壤等100份材料。

2.富集培养

本试验采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然玉米秸秆粉摇床富集培养。

滤纸平铺法：将采集的材料混合富集静止培养，腐烂玉米秸秆、腐烂麦秆、腐烂水稻秆、腐烂落叶、朽木、牛羊兔鸡鸭鸽子粪、堆肥、腐烂纸盒、锯末、食用菌栽培下脚料、腐烂柳树木质部等16种材料各50g与5种土壤(麦田土、树林土、多年玉米秸秆还田土壤、菜园土、草原土)各500g分别混合均匀，得到16×5共80个混合样品，每个样品加入10％g/mL的硫酸铵100ml；取适量混合样品在灭菌的培养皿内平铺成约0.5mm厚薄层，上面覆盖一层灭菌滤纸，置入28+1℃培养15d，富集培养4代。每天观察平皿内滤纸变化情况，传代时从滤纸溃烂处吸取具有明显滤纸崩解效果的培养液部分转接到相同成分新鲜培养基中富集培养。根据滤纸的溃烂程度，定性判定样品的纤维素降解能力。筛选出滤纸溃烂程度高的10份样品。

滤纸崩解法：采集的样品单独富集静止培养，采集的100份材料分别取5.0g接种到盛有150mL滤纸条培养基(或灭菌蒸馏水)的500mL三角瓶中，28℃恒温震荡培养30min混匀，并将上清液做10^-1-10^-9稀释，各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的滤纸条培养基(奥梅梁斯基培养基)里，28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的33份材料。

天然玉米秸秆粉摇床培养：称取菌种来源样品5g加入以天然玉米秸秆粉为唯一碳源的100mL玉米秸秆粉培养基(将奥梅梁斯基培养基中滤纸用玉米秸秆粉替代中，28℃恒温震荡培养15d吸取5mL培养液转入新的玉米秸秆粉富集培养基，富集培养4代。筛选出玉米秸秆粉降解程度高的9份材料。

经过上述的富集培养后，从100份材料中共筛选出了45份材料。

3.低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化

采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系。初始培养温度为28℃，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃，直至培养温度降低至15℃，目测生长情况，通过滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，边传代边挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在15℃温度条件下连续培养6代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。

经过初步的低温驯化，结果在15℃条件下，编号为1、4、6、8、11、12、15、16、17、20的菌系生长良好，说明其能够在低温条件正常生长。因此选择以上10个低温降解菌系进行复筛。实验结果例于表1。

表115℃培养条件下纤维素分解菌生长情况

4.低温降解纤维素复合菌系的复筛

将初筛的菌液接入纤维素刚果红培养基((NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄.7H₂O0.5g，KH₂PO₄1g，NaCl0.5g，CMC-Na20g，刚果红0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH值)，15℃培养15d，观察菌落生长情况，并分别计算CMC酶相对活性。

通过刚果红水解透明圈直径和菌落直径计算CMC酶相对活性：

CMC酶相对活性A＝透明圈直径/菌落直径

初筛菌液分别接入液体发酵培养基(奥梅梁斯基培养基中的滤纸用玉米秸秆替换)中，15℃振荡培养(转速180r/min)，4d后过滤得酶液，测定酶液各项酶活性，包括Cx、FPA和C1酶活(酶活测定方法参见文献：朱雨生，木霉纤维素酶的诱导形成及其调节IV.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析，《植物生理学报》，1978，4(2)，143-151)。以每分钟产生1μmol葡萄糖或木糖的酶量定义为1个酶活单位(U))。

采用刚果红水解圈、纤维素酶活力为指标复筛低温纤维素分解菌系。测试结果见表2和表3。

表2初筛复合菌系纤维素(CMC)相对酶活

表3初筛复合菌系纤维素酶活测定结果

注：*大小写字母代表差异显著性，小写字母表示0.05水平上差异显著，大写字母表示0.01水平上差异显著，各菌系间如果标注的字母有相同的记为不显著，字母不同表明差异显著。

经过复筛后，从初筛得到的10个培养物中筛选出了7种培养物能够降解纤维素产生水解圈，其中8号菌系CMC相对酶活最大，为11.93；其次是1号菌系，CMC相对酶活为7.77；1号和8号菌系Cx和FPA酶活较其他菌系高，C1酶活性最低。

5.驯化低温玉米秸秆降解复合菌系

将复筛得到的菌系以玉米秸秆和滤纸为碳源进行交替培养驯化，多代限制性碳源继代培养：以滤纸为唯一碳源的培养基(奥梅梁斯基培养基)和以玉米秸秆为唯一碳源的培养基交替培养各三次，培养温度15℃，滤纸培养基每次培养8天，玉米秸秆培养基每次培养15天。转接培养到6次以后，测定驯化系的pH值及秸秆降解率，选择秸秆分解能力强，pH近中性的菌系。

实验结果表明，各复合菌系液体经过10d发酵驯化后，8号和17号菌系15℃条件下的玉米秸秆降解率较高，分别为22.48％和25.41％。发酵驯化15d、20d、25d、30d、35d时，玉米秸秆降解率1号和8号菌系的较高，分别为27.92％和29.19％、32.29％和35.72％、34.55％和37.94％、44.34％和41.85％、48.55％和44.81％。实验结果例于图1。

实施例2驯化复合菌系玉米秸秆降解效果测定

1.驯化复合菌系在玉米秸秆固体培养基上的生长状况及对玉米秸秆降解的效果

按5％(体积比)的接种量，将复合菌系的液体培养液接种到玉米秸秆上，20℃条件下培养驯化系，第2天观察到玉米秸秆上长出1-2mm菌丝；第3天菌丝已基本盖满上部；第5天菌丝依然生长旺盛；第7天菌丝生长缓慢；第10天菌丝有自溶现象，大部分停止生长。15℃培养，其中1、8、11、16号菌系第2天观察到玉米秸秆上长出1-2mm菌丝；第4天菌丝已基本盖满上部；第8天菌丝依然生长旺盛；第15天菌丝生长缓慢；第30天菌丝大部分因基质发干而停止生长。其余3个菌系前期生长情况较慢，第4天观察到玉米秸秆上长出1-2mm菌丝；第6天菌丝已基本盖满上部；第15天菌丝依然生长旺盛；第20天开始菌丝生长缓慢；第30天菌丝停止生长。

15℃培养条件下，各菌系在玉米秸秆上的生长情况见图2A。从图2B可以看出，1、8、11、16和17号菌系对秸秆茎髓部组织降解得较多，秸秆组织结构呈松散状态；秸秆颜色从金黄色变为棕色。

2.玉米秸秆降解率测定

以如下培养基作为玉米秸秆降解率测定培养基：将新鲜玉米秸秆晾干劈开成四瓣，剪成1cm³的块，混合均匀，105℃烘干，称取2g加入150mL的三角瓶，每瓶再加入12mL的营养液，混合均匀，自然pH值，于121℃、0.1MPa下灭菌30min。其中营养液的配制为：(NH₄)₂SO₄15g，尿素3g，蛋白胨3g，CaCl₂0.1g，MgSO₄·7H₂O10g，K₂HPO₄1g，NaCl0.1g，FeSO₄.7H₂O0.05g，MnSO₄·7H₂O0.016g，ZnSO₄·7H₂O0.014g，CoCl0.02g，水1000mL，自然pH值。

筛选出的菌系以10％接种量分别接种在玉米秸秆降解率培养基中，15d后取培养基中的玉米秸秆烘干称重。算出玉米秸秆失重率，玉米秸秆失重率＝(接种前的玉米秸秆烘干重-接入菌种15天后的玉米秸秆烘干重)/接种前的玉米秸秆烘干重。实验结果例于表4。

表4各驯化系15d玉米秸秆降解率

秸秆降解率实验结果表明，1号和8号菌系在20℃和15℃条件下对玉米秸秆降解率均显著或极显著高于其他菌系，20℃条件下对玉米秸秆降解率分别为44.56％和43.053％，15℃条件下为30.20％和32.207％；17号菌系15℃和20℃条件下对玉米秸秆降解率均较低。

Claims (8)

1.一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，包括以下步骤：

1)采集年平均气温在-0.6℃～8℃的高寒地区富含纤维素的自然物样品进行纤维素降解菌系的富集培养，获得富集培养物；

2)将富集培养物接种到滤纸条培养基中，以28℃为初始培养温度，培养多代后选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高，pH6.5～7.5的培养物，按每转接一次培养温度降低1-2℃的梯度进行继代培养，至培养温度降低至15℃～20℃的某一温度时，在该温度下连续继代培养，直至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养，初筛出纤维素降解能力保持好的菌系；

3)对初筛菌系进行CMC酶相对活性和纤维素酶活的检测，选出酶活性高的复合菌系；

4)将复合菌系在15℃～20℃的某一温度下，以秸秆和滤纸分别为唯一碳源进行交替继代培养，转接培养到多代次以后，选择秸秆分解能力强、培养物pH6.5～7.5的菌系为秸秆低温降解复合菌系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然作物秸秆粉摇床培养法中的一种或多种进行富集培养，在滤纸平铺法和滤纸崩解法中选择滤纸溃烂程度高、滤纸断裂时间短的样品，在天然作物秸秆粉摇床培养法中选择降解秸秆效果好的样品。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述样品选自下列材料中的多种：腐烂秸秆、腐烂落叶、朽木、烂草、动物粪便、堆肥、锯末、食用菌栽培下脚料、麦田土、树林土、多年秸秆还田土壤、菜园土、草原土。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)在初始培养温度28℃培养4代，然后再梯度降低温度进行继代培养。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中CMC酶相对活性的检测方法是：将初筛菌系接到纤维素刚果红培养基上，在15～20℃的某一温度下培养，通过刚果红水解圈直径/菌落直径计算CMC酶相对活性。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述纤维素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和C1酶活。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)在15～20℃的某一温度下，以秸秆和滤纸分别为唯一碳源对复合菌系进行交替继代培养，转接培养4～6代以后选择秸秆分解能力强、培养物pH6.5～7.5的菌系。

8.如权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述秸秆为玉米秸秆。

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