CN112574062B - 卡比多巴对映异构体的分离制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卡比多巴对映异构体的分离制备方法，采用逆流色谱法进行分离，包括以下步骤：将正丁醇：乙酸乙酯：水按照4:0.8～1.2:4.5～5.5的体积比配制后倒入分液器中，分别得上相和下相；将手性试剂溶于上相，所得的手性试剂溶液与下相混合，得混合剂；将D,L‑卡比多巴溶于混合剂中，得到D,L‑卡比多巴溶液；将上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将D,L‑卡比多巴溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入下相作流动相，分别得到L‑卡比多巴和D‑卡比多巴。采用本发明方法分离得到的两种卡比多巴对映异构体纯度可达到95％以上。

Description

卡比多巴对映异构体的分离制备方法
技术领域
本发明属于药物外消旋体拆分研究技术领域，具体涉及卡比多巴对映异构体的分离制备方法，特别是采用高速逆流色谱法手性分离卡比多巴对映异构体。
背景技术
世界开发的新药中有三分之一均是手性药物，药物对映异构体(左旋以及右旋)的结构不同导致了与受体的不同亲和力，从而有不同的活性。对映异构体的不同对药物的活性有三个方面的影响：
(1)使左旋和右旋具有不同的活性，如奎宁是抗疟疾药，而奎尼丁是治疗心律失常；
(2)使左旋和右旋活性具有不同差异，如左氧氟沙星抗菌活性是右旋的20倍；
(3)使左旋和右旋具有不同的不良反应，如著名的反应停事件，是因为在药物生产过程中没有将左旋右旋拆分干净，右旋有胎儿致畸的不良反应。因而当开发药物为外消旋体时，必须对两种对映异构体进行研究并证明它们都无任何毒副作用或低毒作用，才可使用。
卡比多巴(Carbidopa)是一个具有较强作用的外周多巴胺脱羧酶抑制剂，白色绒毛状结晶；几乎无臭。常与左旋多巴联合使用，用于治疗帕金森病和帕金森综合征。分子量为244.24Da，分子式为C10H14N2O4。卡比多巴具有两种的对映异构体，分别为L-卡比多巴和D-卡比多巴，化学结构如式I所示：
Figure BDA0002862868820000011
目前关于此类化合物的手性拆分方法研究较少。根据开发立体异构新药的技术要求及确保药物的安全、有效，需要对手性起始原料的所有光学异构体进行检测。因此，对D,L-卡比多巴手性拆分建立一种快速、有效的方法，是一个具有理论及实际意义的课题。
色谱分离法具有非常优秀的分辨能力，手性拆分属于色谱研究领域的热点和前沿，但其主要局限在高效毛细管电泳、毛细管气相色谱、高效液相色谱领域。虽然这3种方法分辨率很高，但其分离量常在微克级，只能作为分析测试手段。制备液相色谱满足一般性制备拆分的需要，可用于药理及毒理实验，但手性制备柱价格可高达几万到数十万元，且大进样量严重影响柱的寿命；另外每种柱的适应范围也有限，这就造成手性制备的成本很高，即使制备较少量的手性物质，很多研究工作者都难以承受。由于逆流色谱具有制备性拆分的特点，因此，进行逆流色谱的手性分离研究具有积极的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种拆分卡比多巴对映异构体的方法，以便于加深D,L-卡比多巴异构体的研究和利用。
本发明以D,L-卡比多巴为拆分对象，以(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇作为手性试剂，将其添加到有机相中，用逆流色谱法得到D-卡比多巴和L-卡比多巴。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种卡比多巴对映异构体的分离制备方法(即，从D,L-卡比多巴对映异构体中分离制备卡L-比多巴和D-比多巴的方法)，采用逆流色谱法进行分离，包括以下步骤：
1)、将正丁醇：乙酸乙酯：水按照4:0.8～1.2:4.5～5.5的体积比配制后倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂，分离后，分别得上相和下相；
2)、将作为手性试剂的(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇溶于上相，配制成手性试剂浓度18～27mmol/L的手性试剂溶液；
3)、将步骤2)所得的手性试剂溶液与步骤1)所得的下相按照1:1的体积比混合，得混合剂；将D,L-卡比多巴溶于所述混合剂中，得到D,L-卡比多巴溶液，所述D,L-卡比多巴与混合剂的料液比为40～60mg/9～11mL；
4)、将步骤1)所得的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的D,L-卡比多巴溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入步骤1)所得的下相作流动相，流动相的流速为1.0～3.0mL/min，分别收集保留时间为125～165min和185～220min的组分，旋转蒸发后(温度为45±5℃，至旋，对应得到L-卡比多巴和D-卡比多巴(均为纯化的卡比多巴。
备注说明：注入流动相后，D,L-卡比多巴便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过紫外检测器的在线监测，收集、合并流出物(收集保留时间为125～165min和185～220min的组分)。
作为本发明的卡比多巴对映异构体的分离制备方法的改进：
所述步骤1)中，正丁醇：乙酸乙酯：水＝4:1:5的体积比。
作为本发明的卡比多巴对映异构体的分离制备方法的进一步改进：
所述步骤2)的手性试剂溶液中，手性试剂浓度为24mmol/L。
作为本发明的卡比多巴对映异构体的分离制备方法的进一步改进：
所述步骤3)中，D,L-卡比多巴与混合剂的料液比为50mg/10mL。
作为本发明的卡比多巴对映异构体的分离制备方法的进一步改进：
所述步骤4)中，流动相的流速为2.0mL/min。
本发明所述的D,L-卡比多巴对映异构体，其分子量为244.24Da，分子式为C10H14N2O4，化学结构式如上述(I)所示。
目前，逆流色谱法目前尚未用于卡比多巴对映异构体分离制备的原因是：未发现合适的手性选择试剂及逆流色谱两相溶剂体系，本发明在发明过程中建立了以正丁醇：乙酸乙酯：水为溶剂体系，以(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇为手性选择试剂，实现了逆流色谱中卡比多巴对映异构体的基线分离。
本发明采用的逆流色谱方法能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高，分离得到的两种卡比多巴对映异构体纯度可达到95％以上。而且所用的逆流色谱仪与其他传统的拆分方法如化学拆分法、高效液相色谱法相比更加简单便宜，其溶剂由普通溶剂配制、价格便宜，因此本发明是一种经济的分离纯化卡比多巴对映异构体的方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为卡比多巴外消旋体混合物的高效液相色谱检测谱图；
图2为实施例1实验条件下卡比多巴外消旋体混合物的高速逆流色谱分离谱图；
图3为图2中125min～165min洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即L-卡比多巴；
图4为图2中185min～220min洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即D-卡比多巴。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例所用的卡比多巴外消旋体混合物，经过分析型高效液相色谱面积归一化法检测(如图1所示)，L-卡比多巴的含量为50.9％，D-卡比多巴的含量为48.0％。
卡比多巴外消旋体混合物及其纯化后L型和D型卡比多巴的高效液相色谱分析，均依据以下高效液相色谱法进行：色谱柱：CHIROBIOTICTM T柱(手性分析柱)，4.6mm×25cm×5um或等同的色谱柱；检测波长：UV230nm；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；柱温：30℃；运行时间：20min；流动相：20mmol乙酸铵缓冲液(称取0.31g乙酸铵至200ml纯化水中，用醋酸调节pH至5.3)/甲醇＝20/80(体积比)，用0.45um滤膜过滤，混合脱气。
实施例1、一种从D,L-卡比多巴分离制备L-卡比多巴和D-卡比多巴的方法，用逆流色谱仪从D,L-卡比多巴分离L-卡比多巴和D-卡比多巴，依次进行以下步骤：
1)、将正丁醇、乙酸乙酯和水，按体积比为4:1:5配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，形成互不相溶的两相溶剂，分离后，分别得上相和下相。
2)、称取手性试剂(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇溶于500mL上相，配制成浓度24mmol/L的手性试剂溶液。
3)、将5ml手性试剂溶液(含有手性试剂的上相)和5ml下相混合，得混合剂；将D,L-卡比多巴50mg溶于上述混合剂(10ml)中，得到卡比多巴溶液(D,L-卡比多巴溶液)，作为样品溶液；
4)、逆流色谱柱内径2.6mm，柱体积为310ml。以上相作为固定相，下相为流动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为800转，以2.0ml/min的流速注入流动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长230nm，逆流色谱分离谱图如图2所示。
收集、合并流出物(收集保留时间分别为125～165min和185～220min的组分)，分别旋转蒸发(温度为45℃，至旋干)，相应得到L-卡比多巴20.5mg，D-卡比多巴19.8mg，其纯度分别为98.5％和99.2％，见图3和图4。
实施例2、一种从D,L-卡比多巴分离制备L-卡比多巴和D-卡比多巴的方法：
将实施例1步骤4)中流动相的注入流速由2.0mL/min改成3.0mL/min，其余等同于实施例1。最终所得的L-卡比多巴和D-卡比多巴，纯度均约为95.0％。
实施例3、一种从D,L-卡比多巴分离制备L-卡比多巴和D-卡比多巴的方法：
将实施例1步骤2)中手性试剂(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇的浓度由24mmol/L改成48mmol/L，且将流动相的注入流速由2.0mL/min改成3.0mL/min，其余等同于实施例1。最终所得的L-卡比多巴和D-卡比多巴，纯度均约为85.0％。
对比例1-1、将实施例1中的正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为8:1:11)，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1中的正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为2:1:2.5)，其余同实施例1。
对比例2-1、将实施例1中的正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)组成的两相溶剂体系改成正己烷、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)，其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1中的正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、丙酮和水(体积比为4:1:5)，其余等同于实施例1。
对比例2-3、将实施例1中的正丁醇、乙酸乙酯和水(体积比为4:1:5)组成的两相溶剂体系改成正己烷、丙酮和水(体积比为8:3:9)，其余同实施例1。
对比例3、取消实施例1中的添加手性试剂(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇，其余同实施例1。
对比例4、将实施例1中手性试剂由(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇改成如表1所述，其余同实施例1。
上述所有对比例所制备的L-卡比多巴和D-卡比多巴的纯度如表1所述。
表1
Figure BDA0002862868820000051
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.卡比多巴对映异构体的分离制备方法，其特征是，采用逆流色谱法进行分离，包括以下步骤：
1)、将正丁醇：乙酸乙酯：水按照4:1:5的体积比配制后倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂，分离后，分别得上相和下相；
2)、将作为手性试剂的(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇溶于上相，配制成手性试剂浓度18～27mmol/L的手性试剂溶液；
3)、将步骤2)所得的手性试剂溶液与步骤1)所得的下相按照1:1的体积比混合，得混合剂；将D,L-卡比多巴溶于所述混合剂中，得到D,L-卡比多巴溶液，所述D,L-卡比多巴与混合剂的料液比为40～60mg/9～11mL；
4)、将步骤1)所得的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的D,L-卡比多巴溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入步骤1)所得的下相作流动相，流动相的流速为1.0～3.0mL/min，分别收集保留时间为125～165min和185～220min的组分，旋转蒸发后，对应得到L-卡比多巴和D-卡比多巴。
2.根据权利要求1所述的卡比多巴对映异构体的分离制备方法，其特征是：
所述步骤2)的手性试剂溶液中，手性试剂浓度为24mmol/L。
3.根据权利要求2所述的卡比多巴对映异构体的分离制备方法，其特征是：
所述步骤3)中，D,L-卡比多巴与混合剂的料液比为50mg/10mL。
4.根据权利要求1～3任一所述的卡比多巴对映异构体的分离制备方法，其特征是：
所述步骤4)中，流动相的流速为2.0mL/min。
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