CN112569243A - 制备治疗阿尔茨海默病的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及阿昔洛韦和***联合在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用；本发明所述的应用，包括阿尔茨海默病患者在所有症状，特别是以下症状：认知障碍，神经炎症，本发明发现，阿昔洛韦和***联合应用具有协同增效作用，同时发挥抗炎和免疫调节作用而达到治疗效用。

Description

制备治疗阿尔茨海默病的药物
技术领域
本发明涉及药物的新用途，特别涉及阿昔洛韦和***联合在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是世界上最常见的慢性和不可逆的神经退行性疾病。随着世界老龄化率的不断提高，阿尔茨海默病成为全球最大的医疗挑战之一。然而，这种疾病的有效治疗仍然缺乏。阿尔茨海默病患者的认知障碍与胆碱能退化和兴奋毒性有关。因此，胆碱酯酶抑制剂，包括多奈哌齐、利伐司他明和加兰他明，以及NMDA受体拮抗剂美金刚，在临床上被用于治疗阿尔茨海默病，但这些药物只能缓解该病的症状，而不能阻止或延迟阿尔茨海默病的进展。
阿昔洛韦(鸟苷类似物)被用作治疗单纯疱疹性脑炎的抗病毒药物。以往的研究表明，阿昔洛韦在体外和体内均能抑制色氨酸-2,3-双加氧酶活性，导致血清素和5-羟基吲哚乙酸水平升高1。阿昔洛韦被证明能减轻单纯疱疹性脑炎患者抑郁的临床症状1。此外，据报道，使用阿昔洛韦与阿尔茨海默病的死亡发生率有关，但阿昔洛韦是否具有神经保护作用尚不知晓2。
***是一种合成糖皮质激素，临床上用于治疗过敏反应和炎症性皮肤3。***在中枢神经***中具有广泛的作用，如调节基因转录和调节突触结构4。***的长期治疗可诱导tau的病理改变，增强Aβ的表达，但***是否可以改善认知障碍尚不知晓5。然而，***的短期治疗可以抑制阿尔兹海默病相关的神经炎症，并预防认知障碍4。有趣的是，在母体中使用***可以改善其阿尔兹海默病转基因小鼠后代的认知障碍，表示***对阿尔兹海默病预防的有益作用4。
近年来，阿昔洛韦与***联合应用于单纯疱疹性脑炎早期可有效缓解神经症状，提高小鼠的存活率6。然而，阿昔洛韦和***联合治疗是否能预防与阿尔茨海默病相关的认知障碍在很大程度上尚不清楚。
本发明人评估了阿昔洛韦和***联合治疗对阿尔茨海默病引起的Aβ低聚物治疗小鼠的神经炎症、突触蛋白表达和认知的保护作用。
在本研究中，我们首次发现阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用阿昔洛韦或***，可以预防由阿尔茨海默病引起的β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体引起的空间认知障碍。此外，阿昔洛韦和***还可以预防Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞过度活化和促炎细胞因子过度表达，这表明药物联合治疗的抗阿尔茨海默病作用可能至少部分通过抑制神经炎症和免疫调节作用来实现。此外，阿昔洛韦和***联合应用可阻Aβ寡聚体诱导的PSD95表达下降，提示药物联合应用对突触的保护作用。
为此，本发明提供一种药物联合应用治疗阿尔茨海默病在方法。
发明内容
本发明提供阿昔洛韦和***联合在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明发现:
***可以改善阿昔洛韦诱导的Aβ寡聚体小鼠体重下降。
阿昔洛韦和***联合使用，可显著减轻aβ寡聚体诱导的空间认知障碍。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的促炎细胞因子过度表达。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ诱导的PSD-95表达下降。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的pTau表达。
以上发现提示，本发明已经开发出一种治疗阿尔茨海默病的新的替代疗法，即阿昔洛韦和***联合在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明所述的应用，包括阿尔茨海默病患者在所有症状，特别是以下症状：认知障碍，神经炎症。
本发明进一步发现，阿昔洛韦和***联合应用具有协同增效作用，本发明发现***可以改善阿昔洛韦诱导的体重减轻，同时发挥抗炎和免疫调节作用。
本发明所述的阿昔洛韦，包括其药用盐，使用时可以是其任何一种可以药用的形式，优选其口服制剂形式，如片剂，胶囊剂，颗粒剂等。
本发明所述的***，包括其药用盐，如醋酸***，***磷酸钠等，使用时可以是其任何一种可以药用的形式，优选其口服制剂形式，如片剂，胶囊剂，颗粒剂等。
本发明所述的阿昔洛韦和***联合包括联合同时使用，也包括先后分别使用，使用量均为有效量，如每天500毫克的阿昔洛韦和每天1.5毫克的***，每天两次，对于每克在药用冷霜基质中的乳膏，应含有20毫克的阿昔洛韦和0.25毫克的***，都是为了达到在体内同时起作用在目的。必要时根据药物代谢的差异，可以先施用代谢慢的药物，待药物吸收后，再施用代谢快的药物，以达到在体内同时起作用在目的。因此，本发明包括一种组合包装，其中包括一个包装中为阿昔洛韦制剂，另一个包装中为***制剂。
本发明所述在联合还包括，将所述的阿昔洛韦和***制备成复方药物组合物，即将两种药物放到同一个制剂中，该制剂在服用时两种药物被同时服用。
对于复方药物组合物需要规定两者的重量比例，两者的重量比例为3000-200：10-0.1，优选500：1-5，最优选500：1.5-2。
所述复方药物组合物可以通过胃肠道给药、静脉给药、肌肉注射、皮下注射、口或鼻腔黏膜给药等任意的给药途径摄入人体内，优选通过胃肠道途径给药。可以制备成任何药物可服用的剂型，优选口服制剂，本发明的复方药物组合物，必要时可以加入药物可接受的载体，如其中的药物活性成分在制剂中所占重量百分比可以是0.1～99.9％，其余为药物可接受的载体。
本发明的口服制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、混悬剂、粉剂、滴剂、滴丸剂、微球剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂或喷剂等。
本发明的口服制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
本发明的口服制剂，每剂可包含500mg阿昔洛韦和1.5mg***，每日服用两次。
本发明的口服制剂，每剂可包含500mg阿昔洛韦和2.0mg***，每日服用两次。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
本发明的口服制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的复方药物组合物，在制备成药物制剂时可以采用制剂学常规技术制备，如以活性成分为原料，加入一定数量的药物可接受的载体，混合均匀，根据剂型的特点，制备成片剂，胶囊，颗粒剂等。
以下通过动物实验进一步说明本发明的作用和效果：
材料和方法
化学品和试剂
阿昔洛韦由四川科伦制药有限公司(中国四川)提供。***由浙江仙居制药有限公司(中国浙江)生产。Donepezil由Santa Cruz Biotechnology(中国上海)生产。从GLBiochem(中国上海)合成了Aβ1-42肽。
Aβ寡聚体的制备
如前所述，获得Aβ寡聚体7。简言之，在六氟异丙醇(HFIP，Sigma，St.Louis，Mo，USA)中添加Aβ以形成Aβ单体。Aβ单体在10％六氟异丙醇溶液中旋转真空。然后，在六氟异丙醇蒸发的情况下，我们得到了Aβ溶液。Aβ溶液在搅拌下在25℃下培养2天，在4℃下14000g离心15分钟，上清液主要含有可溶性Aβ寡聚体。上清液通过BCA分析(收集并定量)。
动物研究药物治疗
我们遵循了宁波大学动物研究咨询委员会关于动物使用和护理的指导方针。浙江省医学科学院(浙江)提供了重约25克的ICR小鼠。动物在22±2℃条件下进行12小时光/暗循环(湿度：50±10％)，并提供水和标准食物。阿昔洛韦、***和多奈哌齐溶于水。将小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：对照组、Aβ寡聚体、Aβ加500mg/kg阿昔洛韦、Aβ加2mg/kg***、Aβ加500mg/kg阿昔洛韦和2mg/kg***。小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，然后放置在立体定向仪(中国深圳瑞沃德)中。
第1天，将Aβ寡聚体注射到双侧脑室区域。注射微量药物(1微升/侧)5分钟以上。为了减少回流，套管保留在原位5分钟。以前的研究发现，注射ICR小鼠脑腔中的Aβ寡聚体可能导致认知障碍7,8。小鼠在没有任何实验的情况下恢复3天。第4天，实验组和阳性对照组小鼠灌胃13天(每天2次，每天0.2毫升)。对照组给予生理盐水13天。
旷场实验
为了分析动物的运动活动和探索行为，动物被安置在一个开阔的场地(50×50×39cm)，白色胶合板墙和棕色地板。将开阔场地分为四个等长的正方形(25×25cm)9。将动物一只一只地放在盒子的中心，让它们摸索5分钟。用手持计数器和秒表记录四爪交叉线的数量和饲养的次数，这些被用作标记运动活动和探索行为。一位独立的研究人员对小鼠的药物作用进行了单盲监测。为了避免尿液和粪便对动物造成干扰，在两次试验之间，用10％的酒精溶液和干毛巾清洁开阔场地。
水迷宫试验
用Morris水迷宫测试评估空间记忆10。水迷宫为一个圆形水池(直径110cm)在23±2℃的温度下充满水，并有一个平台。除了最后一天，这个平台总是被放置在西北象限的中间。游泳轨迹是由连接到计算机的录像机录制的。每只老鼠在四天试验中接受定位平台的训练，连续四天每天评估学***台所需的时间。最后一天，我们移走平台，训练老鼠游90秒来进行探测试验。记录游泳池四个象限的游泳时间。在平台之前所占用的象限出现的倾向表示空间记忆能力。
脑组织收集
水迷宫试验后的一天，动物被深度麻醉，并经心灌注冰冷的生理盐水。大脑被迅速解剖。在使用蛋白质免疫印迹(Western blotting)试验(每组4只小鼠)和酶联免疫吸附试验(Elisa，每组3只小鼠)之前，提取海马蛋白并储存在-80℃。在使用免疫组织化学(IHC)染色之前，将完整的脑组织(每组3只小鼠)储存在-80℃的***溶液中。
酶联免疫吸附试验
用新制备的脑组织测定小鼠海马区白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。在0.1M磷酸缓冲液中对脑样本进行均质处理。然后将脑提取液在4℃离心至2000g，持续15分钟。根据制造商的方案，用酶联免疫吸附测定试剂盒(Excell Bio，中国上海)测定IL-6和TNF-α浓度。读取吸光度。
蛋白质印迹分析
如前所述进行蛋白质印迹分析11。简单地说，海马区的脑组织在溶解缓冲液中提取1分钟，并在16000g下离心10分钟。上清液中的蛋白质水平通过Bradford分析估算，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后电转到聚二氟乙烯膜上。在TBST中用5％脱脂牛奶孵育2h后，用相应抗体Tau、IL-17(中国上海圣克鲁斯生物技术公司)、pSer396-Tau、PSD-95和β-肌动蛋白(美国马萨诸塞州贝弗利市细胞信号技术公司)培养12小时。用TBST洗涤样品三次后，用二抗培养膜。随后，使用化学发光联合试剂盒(英国艾尔斯伯里安玛西亚生物技术有限公司)显影膜，并将信号暴露于放射自显影胶片上。所有数据均代表三个独立实验。数据表示为与对照组相比的光学密度(OD)与统计分析的比率。
免疫组化(IHC)染色
IHC染色是根据先前报道的方案进行的11。简单地说，在水迷宫测试后，解剖大脑，用4％多聚甲醛孵育1天。脑标本脱水，石蜡包埋，切成4-微米厚的薄片。然后海马体切片脱蜡和再水化。用3％的H2O2处理10分钟，抑制细胞过氧化物酶活性。切片在4℃与CD45抗原和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的一抗一起孵育过夜。然后冲洗切片并用二抗在37℃下孵育30分钟。用DAB标记切片并进行比色分析。Image Pro 6.0(Media Cybernetics Inc.，MD，USA)用于分析区域的平均光学密度(OD)。这些数字图像用于后续半自动化分析。彩色反卷积分析被应用于此。阳性面积与光学密度由在每个载玻片上随机选取的显微镜视野上的测量确定。IHC指数定义：平均OD＝光学密度×阳性面积/总面积12,13。
数据分析与统计
结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析和Tukey's检验比较各组间的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果
***改善阿昔洛韦诱导的Aβ寡聚体小鼠体重下降
动物实验的整个过程如图1所示。简言之，在第一天，Aβ寡聚体被注射到小鼠海马体的两侧。让老鼠恢复3天。在第4-16天，对小鼠进行13个天的不同治疗。在第17天，通过旷场实验检测小鼠的运动功能。在第18-24天，水迷宫测试测试空间认知能力。第25天，将小鼠处死进行生化研究。
消化障碍是阿昔洛韦常见的不良反应之一。阿昔洛韦长期治疗可引起消化不良和营养不良，导致体重减轻。因此，我们在实验期间每隔2-3天测量一次小鼠的体重。双向重复测量方差分析显示，时间效应[双向方差分析，F(10，385)＝567.5，P<0.001]、治疗效应[双向方差分析，F(5，385)＝274.8，P<0.001]和治疗×时间交互作用[双向方差分析，F(50，385)＝8.4，P<0.001；图2]有显著影响。在实验的最后一天，与对照组相比，多奈哌齐治疗不能改变体重(P>0.05，图2)。然而，与对照组相比，阿昔洛韦和阿昔洛韦+***治疗显著减轻体重，提示阿昔洛韦可能导致小鼠体重减轻(p<0.05，图2)。有趣的是，阿昔洛韦+***组的体重明显高于阿昔洛韦组，这表明***可能改善阿昔洛韦诱导的Aβ寡聚体处理小鼠体重下降。
阿昔洛韦和***对小鼠运动功能无明显影响。
为了进一步研究阿昔洛韦或***是否影响动物的运动功能，采用旷场实验评价其运动活性。如图3所示，站立次数或跨线次数无显著差异，表明阿昔洛韦和***治疗对小鼠运动功能没有显著改变[站立次数，单向方差分析，f(5，13)＝0.1182，p>0.05，图3a；跨线次数，f(5，13)＝0.1937，p>0.05，图3b]。
阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用阿昔洛韦或***，可显著减轻aβ寡聚体诱导的空间认知障碍。
双向重复测量方差分析显示时间效应[双向方差分析，F(3，244)＝163.2，P<0.001，图4A]，治疗效果[双向方差分析，F(5，244)＝27.84，P<0.001，图4A]，治疗×时间交互作用[双向方差分析，F(15，244)＝7.502，P<0.001，FI图4A]对水迷宫训练有显著影响。在训练的最后一天，与对照组相比，Aβ组小鼠发现隐藏平台的时间明显更长(p<0.001，图4A)。此外，阿昔洛韦+***组和多奈哌齐组小鼠的时间明显短于Aβ组(p<0.001，图4A)。在相同条件下，阿昔洛韦或***组的小鼠与Aβ组的小鼠相比没有表现出更好的性能(p>0.05，图4A)。这些结果表明，阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用阿昔洛韦或***，可减轻Aβ寡聚体诱导的小鼠空间学习障碍。
我们还记录了小鼠在测试试验中在靶区的时间。不同组间有显著差异[单因素方差分析，F(5，54)＝5.653，P<0.01，图4B]。与对照组相比，Aβ组小鼠在靶区的时间明显减少(p<0.01，图4B)。阿昔洛韦+***组和多奈哌齐组小鼠的时间明显长于Aβ组(p<0.05，图4B)。在相同条件下，阿昔洛韦或***组的小鼠与Aβ组相比没有表现出更好的性能(p>0.05，图4B)。这些结果表明，阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用阿昔洛韦或***，可减轻Aβ寡聚体诱导的小鼠空间记忆损伤。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的促炎细胞因子过度表达。
我们进一步评价了促炎细胞因子在小鼠海马区的表达。用酶联免疫吸附试验测定小鼠海马区TNF-α和IL-6的含量。Aβ组TNF-α和IL-6的表达均明显高于对照组(P<0.01，图5A和5B)。阿昔洛韦+***治疗显著降低Aβ诱导的TNF-α和IL-6表达增加(p<0.01，图5A和5B)。单用阿昔洛韦不能显著降低IL-6的产生，这表明在联合治疗中，***可能主要起到抗炎作用(p>0.05，图5A)。在相同条件下，多奈哌齐治疗与Aβ组相比不能改变IL-6的表达(p>0.05，图5A)。
免疫印迹法检测促炎细胞因子IL-17的表达。Aβ组IL-17的表达明显高于对照组(P<0.01，图5C和5D)。***和阿昔洛韦+***降低了Aβ诱导的IL-17表达增加(p<0.05，图5C和5D)。在相同的条件下，阿昔洛韦不能降低小鼠海马区IL-17的表达，进一步支持了***在联合治疗中可能主要作为抗炎药(p>0.05，图5D)。在相同条件下，多奈哌齐治疗与Aβ组相比不能改变IL-17的表达(p>0.05，图5D)。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。
为了进一步研究阿昔洛韦和***联合应用是否会影响Aβ寡聚体诱导的星形胶质增生，我们对星形胶质的生物标志物GFAP进行了IHC染色。Aβ寡聚显著增加海马区gfap的平均OD(p<0.001，图6)。阿昔洛韦+***、阿昔洛韦和***显著降低Aβ诱导的gfap平均OD的增加，提示阿昔洛韦和***联合应用可显著减弱Aβ诱导的星形胶质细胞增生(P<0.001，图6)。在相同条件下，阿昔洛韦和多奈哌齐治疗与Aβ组相比，均不能改变GFAP的平均OD(p>0.05，图6)。
同样，Aβ寡聚体显著增加海马区活化小胶质细胞的生物标志物CD45的平均OD(p<0.001，图7)。阿昔洛韦+***和***显著降低了Aβ诱导的CD45平均OD的增加，表明阿昔洛韦和***联合使用可减弱Aβ诱导的小胶质细胞活化(p<0.001，图7)。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ诱导的PSD-95表达下降。
我们还用蛋白质印迹法分析了小鼠海马区突触后蛋白PSD-95的表达。Aβ寡聚体组PSD-95的表达明显低于对照组(P<0.01，图8)。此外，与Aβ组相比，阿昔洛韦+***显著增加小鼠海马区PSD-95的表达(P<0.05，图8)。然而，与Aβ组相比，单用阿昔洛韦、地塞米特或多奈哌齐不能改变PSD-95的表达(p>0.05，图8)。这些结果表明，只有阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用阿昔洛韦或***，才能减弱Aβ诱导的PSD-95表达下降。
阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ寡聚体诱导的pTau表达。
我们还用蛋白质印迹法分析了Tau和pTau的表达。Tau蛋白的高磷酸化是AD的标志，Aβ组的pTau表达明显高于对照组(P<0.001，图9)。此外，与Aβ组相比，阿昔洛韦+***可减弱Aβ诱导的小鼠海马区pTau表达的增加(p<0.01，图9)。然而，与Aβ组相比，单用***不能改变pTau的表达，提示阿昔洛韦可能在联合治疗中作为pTau的抑制剂(p>0.05，图9)。
讨论
在这项研究中，我们发现阿昔洛韦和***的结合，而不是单独的阿昔洛韦或***，显著地预防了Aβ寡聚体诱导的空间认知障碍，而不影响小鼠的运动功能。此外，阿昔洛韦和***联合应用可显著减轻Aβ诱导的神经炎症，而***主要起抗炎作用。
阿昔洛韦能穿透血脑屏障，进入大脑产生作用。以前的研究表明，阿昔洛韦可能有助于预防与AD有关的毒性14。HSV-1被认为是与AD病理学相关的毒素。阿昔洛韦治疗可使HSV-1诱导的Aβ积聚减少70％，并在HSV-1感染的细胞中近100％抑制异常tau磷酸化14。虽然我们的Aβ治疗小鼠没有HSV-1感染，但阿昔洛韦仍有可能通过类似的机制预防AD相关的神经毒性。此外，据报道，阿昔洛韦可以抑制神经毒性色氨酸代谢物——喹啉酸的产生。在AD中广泛观察到色氨酸代谢异常，导致喹啉酸(NMDA受体的***)的形成。喹啉酸可进一步增加皮质神经元中的tau高磷酸化，并引起神经毒性。阿昔洛韦可直接抑制吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO-1)和色氨酸2,3-双加氧酶2(TDO-2)的活性，这两种关键酶负责色氨酸代谢，因此可预防喹啉酸诱导的神经毒性1。我们发现阿昔洛韦能显著减弱Aβ诱导的pTau表达的增加，这与先前的研究一致，即阿昔洛韦能显著体外减少Aβ和pTau的积累15。我们推测阿昔洛韦可能通过抑制IDO-1和TDO-2的活性来抑制PTAU的积累。然而，在我们的研究中，单用阿昔洛韦并没有明显改善小鼠的神经炎症。据报道，阿昔洛韦能抑制脑内hsv-1的复制，但不能抑制hsv-1诱导的炎症反应，提示阿昔洛韦可能不足以产生抗神经炎症作用16,17。这些研究与我们的发现一致，阿昔洛韦不能在很大程度上减少Aβ小鼠的神经炎症。
糖皮质激素能抑制脑内炎症反应，改善预后，降低神经***疾病的死亡率。因此，我们推测，添加***有助于抑制Aβ小鼠的神经炎症。阿昔洛韦和***是临床常用的药物。他们的毒性，吸收和药代动力学研究得很好，没有太多的安全问题。以往研究表明，阿昔洛韦与糖皮质激素联合治疗单纯疱疹性脑炎早期病毒感染小鼠，可有效缓解单纯疱疹病毒感染小鼠的神经症状。我们的研究结果表明，阿昔洛韦和***联合应用可有效预防Aβ诱导的认知障碍和神经炎症，进一步证明阿昔洛韦和糖皮质激素联合应用于治疗AD和其他神经退行性疾病的有效性。
阿昔洛韦最常见的副作用是非特异性炎症引起的肾功能不全，可导致急性肾功能衰竭。***能有效抑制非特异性炎症，临床上可用于阿昔洛韦引起的急性肾功能衰竭。这也是我们在研究中使用阿昔洛韦和***联合治疗的另一个原因。先前的研究表明，阿昔洛韦可引起体重减轻，这可能与肾功能损害有关。在我们的研究中，发现***可以改善阿昔洛韦诱导的体重减轻，表明***也可以逆转阿昔洛韦诱导的副作用。
小胶质细胞是巨噬细胞，约占大脑所有细胞的10％，构成了细胞防御大脑损伤的第一道防线20。先前的研究表明，小胶质细胞的激活与AD进展有关21。活化的小胶质细胞可产生炎性细胞因子，导致神经元损伤。此外，活化的星形胶质细胞可通过分泌各种炎症细胞因子，如IL-6、IL-17和TNF-α参与神经毒性22。此外，星形胶质细胞可以与小胶质细胞相互作用，导致相互激活23。我们发现阿昔洛韦能抑制小胶质细胞的活化，但不能抑制星形胶质细胞的活化，这与先前的研究一致，阿昔洛韦的抗疱疹衍生物甘昔洛韦具有抑制小胶质细胞活化的能力，但不能抑制星形胶质细胞的活化24。据报道，***可通过糖皮质激素受体通路抑制星形胶质细胞的活化25。此外，***可减弱单纯疱疹的小胶质细胞反应26。我们的研究结果表明，***能抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，这与这些报道是一致的。因此，这种联合药物可以同时发挥抗炎和免疫调节作用。
突触可能负责记忆的形成和储存27。PSD-95是决定突触结构和功能完整性的主要支架蛋白28。突触缺失被认为是AD进展的主要病理事件29。在我们的研究中，我们发现阿昔洛韦和***联合使用，而不是单独使用药物，在很大程度上抑制了PSD-95的丢失，这表明药物联合使用可能通过作用于突触部分预防Aβ诱导的认知障碍。
值得注意的是，长期治疗高水平的糖皮质激素可产生糖皮质激素抵抗，并损害大脑中的糖皮质激素受体功能，加重AD进展中的认知障碍4。然而，对糖皮质激素的反应取决于几个因素，包括刺激的持续时间和强度。在病理条件下，糖皮质激素可作为抗炎分子发挥作用30。在生理条件下，糖皮质激素可能起到促炎作用。在我们的研究中，***可以产生抗炎作用，降低Aβ诱导的IL-6和TNF-α表达的增加。我们推测这可能是因为我们用短期低浓度的***治疗小鼠。有趣的是，长期治疗高水平的糖皮质激素可通过增加色氨酸的代谢产物喹啉酸而导致神经毒性。因此，喹啉酸抑制剂阿昔洛韦也可能对抗高水平糖皮质激素诱导的认知功能障碍，进一步支持阿昔洛韦和***联合治疗AD的优势4。
综上所述，我们首次发现阿昔洛韦和***联合应用可能通过减少神经炎症、突触损伤、tau高磷酸化以及星形胶质细胞和小胶质细胞的活化来预防Aβ诱导的认知障碍。由于阿昔洛韦和***是常用的临床药物，本研究可能为AD作为先导或辅助药物的临床治疗提供一种新的策略。
附图说明
图1.整个行为测试的实验设计。简言之，在第一天，Aβ被注射到小鼠的海马区。让老鼠恢复3天。第4天，给小鼠服用药物13天。在第17天，通过旷场实验检测小鼠的运动功能。在第18-24天，水迷宫测试测试空间认知能力。每2-3天测量一次体重。第25天，将小鼠处死进行生化研究。
图2.阿昔洛韦和阿昔洛韦+***组小鼠体重明显低于对照组。在实验过程中，每2-3天测量一次小鼠体重。数据代表平均值±标准差(n＝10)；与第25天的对照组相比，#p<0.05和###p<0.001(单因素方差分析和Tukey检验)。
图3.各组小鼠运动功能无明显改变。在旷场实验中，每组的站立和跨线次数分别如图3A和图3B所示。数据表示为平均值±标准差(n＝10)。
图4.阿昔洛韦和dxmt联合应用可显著减轻Aβ诱导的空间认知障碍，如水迷宫试验所示。图4A表示阿昔洛韦和阿昔洛韦+dxmt组在训练结束后的潜伏期明显短于Aβ组。图4B表示在试验中，阿昔洛韦+dxmt组靶区小鼠的持续时间明显大于Aβ低组。试验中小鼠的代表性游泳轨迹如图4C-4D所示。数据代表平均值±标准差(n＝10)；与对照组相比，##p<0.01和###p<0.001；与Aβ组相比，*p<0.05和***p<0.001(单因素方差分析和Tukey检验)。图4C为训练期小鼠的代表性游泳轨迹图。图4D为潜伏期小鼠的代表性游泳轨迹图。
图5.阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ诱导的促炎细胞因子过度表达。分别用酶联免疫吸附试验测定各组海马提取液中图5A TNF-α和图5B IL-6的含量。图5C采用免疫印迹法检测小鼠海马提取液中IL-17和β-肌动蛋白的表达。IL-17水平的定量分析如图5D所示。数据代表平均值±标准差(图5A和图5B的n＝4，图5D的n＝3)；与对照组相比，##p<0.01和###p<0.001；*与Aβ组相比，*p<0.05和**p<0.01(单因素方差分析和Tukey检验)。
图6.阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ诱导的小鼠海马区星形胶质细胞过度活化。图6A各组海马区GFAP染色的典型图像。GFAP染色平均OD的定量分析如图6B所示。数据代表平均值±标准差(n＝3)；###p<0.001对照组，***p<0.001对Aβ组(单因素方差分析和Tukey检验)。比例尺：30微米。
图7.阿昔洛韦和***联合应用可显著降低Aβ对小鼠海马区小胶质细胞过度活化的影响。图7A各组海马区CD45染色的典型图像。CD45染色平均OD的定量分析如图7B所示。数据代表平均值±标准差(n＝3)；相对于对照组，###p<0.001，相对于Aβ组，**p<0.01和***p<0.001(单向ANOVA和Tukey检验)。比例尺：30微米。
图8.阿昔洛韦和***联合应用可降低Aβ诱导的小鼠海马区PSD-95表达的下降。图8A用免疫印迹法检测PSD-95和β-肌动蛋白的表达。PSD-95表达的定量分析见图8B。数据代表平均值±标准差(n＝4)；##p<0.01对照组，*p<0.05对比Aβ组(单因素方差分析和Tukey检验)。
图9.阿昔洛韦和***联合应用可减弱Aβ低聚物诱导的小鼠海马区pTau表达的增加。图9A用蛋白质印迹分析法测定Tau和pTau的表达。pTau表达的定量分析如图9B所示。数据代表平均值±标准差(n＝4)；###p<0.001对照组，*p<0.05和***p<0.001对比Aβ组(单向ANOVA和Tukey检验)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
阿昔洛韦和***颗粒剂
将阿昔洛韦100g和***0.75g、乳糖、淀粉、低取代羟丙纤维素分别过60目筛，按配方量称取，置混合机混合时间30分钟，加入适量的粘合剂制软材，20目制粒，烘干，18目整粒，得混合粉，向整粒好的颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混合，混合粉分装制成颗粒剂。
实施例2
阿昔洛韦和***胶囊剂
将阿昔洛韦100g和***0.75g、乳糖、淀粉、低取代羟丙纤维素分别过60目筛，按配方量称取，置混合机混合时间30分钟，加入适量的粘合剂制软材，20目制粒，烘干，18目整粒，得混合粉，向整粒好的颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混合，混合粉置胶囊填充机填充胶囊。
实施例3
阿昔洛韦和***片剂
将阿昔洛韦100g和***0.75g、乳糖、淀粉、低取代羟丙纤维素分别过60目筛，按配方量称取，置混合机混合时间30分钟，加入适量的粘合剂制软材，20目制粒，烘干，18目整粒，得混合粉，向整粒好的颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混合，混合均匀后取颗粒适量进行含量测定，根据所测的含量计算片重，压片，包薄膜衣。
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Claims (14)

1.阿昔洛韦和***在制备治疗阿尔茨海默病的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物治疗阿尔茨海默病患者的认知障碍。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物治疗阿尔茨海默病患者的神经炎症。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物促进阿尔茨海默病患者的免疫调节作用。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物中的阿昔洛韦和***联合同时使用，或者先后分别使用。
6.根据权利要求4所述的应用，其中所述药物可缓解阿昔洛韦可能引起的消化问题。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述阿昔洛韦和***制备成复方药物组合物。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述复方药物组合物中的阿昔洛韦和***的重量比例为3000-200：10-0.1。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的重量比例为500：1-5。
10.根据权利要求8所述的应用，其中所述的重量比例为500：1.5-2。
11.根据任一项权利要求1-10所述的应用，其中所述药物可以通过以下途径给药:胃肠道、静脉、肌肉、皮下、口腔黏膜、舌下、口喷剂或鼻喷剂。
12.根据任一项权利要求1-10所述的应用，其中所述药物制备成以下形式的口服制剂：片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、或喷剂。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述口服制剂中包含500mg阿昔洛韦和1.5mg***。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述口服制剂每日服用两次。
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