CN112501228B - 一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基及使用其的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基及使用其的方法，发酵液中天蚕素含量提高了20%‑30%，可以提高到5500‑6000微克/毫升。一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.5‑2.5%，酵母浸粉1.0‑2.0%，玉米粉2.4‑3.6%，磷酸二氢钾0.45‑0.55%，淀粉1.5‑2.5%，硫酸镁0.7‑0.9%，豆粕水解液3.5‑4.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4‑7.7。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产天蚕素，尤其涉及一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基及使用其的方法。
背景技术
现有技术中存在的发酵培养基很多，但是对于菌种发酵生产天蚕素来说，发酵后发酵液中的天蚕素含量一一般为4500-5000微克/毫升，改善蛋白质成分含量或者改变其它营养成分含量，只能微微改善天蚕素含量，很难达到对天蚕素含量的真正的提高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基及使用其的方法，发酵液中天蚕素含量提高了20%-30%，可以提高到5500-6000微克/毫升。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.5-2.5%，酵母浸粉1.0-2.0%，玉米粉2.4-3.6%，磷酸二氢钾0.45-0.55%，淀粉1.5-2.5%，硫酸镁0.7-0.9%，豆粕水解液3.5-4.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4-7.7。
按质量分数计，蛋白胨2%，酵母浸粉1.5%，玉米粉3%，磷酸二氢钾0.5%，淀粉2%，硫酸镁0.8%，豆粕水解液4%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5；。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将枯草芽孢杆菌菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度33-37℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟120-180转，发酵时间为30-36小时，接种量为0.9%-1.1%。
相对于现有技术，本发明发酵培养基中使用了豆粕水解液后，发酵液中天蚕素含量提高了20%-30%，可以提高到5500-6000微克/毫升。
具体实施方式
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.5-2.5%，酵母浸粉1.0-2.0%，玉米粉2.4-3.6%，磷酸二氢钾0.45-0.55%，淀粉1.5-2.5%，硫酸镁0.7-0.9%，豆粕水解液3.5-4.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4-7.7。
按质量分数计，蛋白胨2%，酵母浸粉1.5%，玉米粉3%，磷酸二氢钾0.5%，淀粉2%，硫酸镁0.8%，豆粕水解液4%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将枯草芽孢杆菌菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度33-37℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟120-180转，发酵时间为30-36小时，接种量为0.9%-1.1%。
下面结合具体实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
下面实施例和对比例中菌种枯草芽孢杆菌来源相同。枯草芽孢杆菌为含天蚕素抗菌肽基因质粒转化的工程枯草芽孢杆菌，可用现有的基因工程手段得到。本申请中的参考ZL200810132258.1公开的方法得到。
本申请所使用的豆粕水解液经过检测：按重量计，总固物：大于70%，蛋白质：大于48%，氨氮：大于3%，灰分：小于15%，总磷：大于4000，二氧化硫 ：小于0.3%。
实施例1
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨2%，酵母浸粉1.5%，玉米粉3%，磷酸二氢钾0.5%，淀粉2%，硫酸镁0.8%，豆粕水解液4%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）种子制备：
（a）摇瓶菌种：在250 ml的锥形瓶上，装30ml LB培养基，将一个枯草芽孢杆菌菌落接种于LB培养基上，摇瓶培养条件下培养，培养条件为，温度为37℃、转速每分钟220转、培养10小时；
（b）种子罐培养：从种子培养到最后30M3发酵罐发酵培养需要3级种子扩大，一级种子扩大：将摇瓶培养好的种子按1：100分别扩大于3个500 ml的锥形瓶，装50ml种子培养基，种子培养条件下培养；二级种子扩大：将一级种子扩大的种子按1：100比例扩大于30L种子发酵罐，装15 L种子培养基，种子培养条件下培养；三级种子扩大：将二级扩大的种子按1：100扩大于3 M3种子发酵罐，装1.5 M3种子培养基，种子培养条件下培养；
种子培养基为LB培养基。种子培养条件为：温度为37℃，转速每分钟160转，罐压0.06Mpa.通风量1：1，接种量1%。一级种子扩大培养时间为10h，二级种子扩大培养时间为8h，三级种子扩大培养时间为6h。
（2）将所述的抗菌肽发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（3）将枯草芽孢杆菌菌液接种于30 M3发酵罐，装21 M3抗菌肽发酵培养基，发酵培养条件下培养。发酵条件：温度37℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟180转，罐压0.05Pma，发酵时间为30小时，接种量为1.0%，枯草芽孢杆菌菌液为三级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为6000微克/毫升。
对比例1
与实施例1相比，对比例1中抗菌肽发酵培养基中除了不含有豆粕水解液外，其它成分都相同。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为4912微克/毫升。
对比例2
与实施例1相比，对比例2中抗菌肽发酵培养基：按质量分数计，蛋白胨3%，酵母浸粉2.0%，玉米粉3.5%，磷酸二氢钾0.8%，淀粉2.5%，硫酸镁0.8%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为5000微克/毫升。
实施例2
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.5%，酵母浸粉1.8%，玉米粉3.2%，磷酸二氢钾0.45%，淀粉2.5%，硫酸镁0.7%，豆粕水解液4.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）种子制备：
（a）摇瓶菌种：在250 ml的锥形瓶上，装30ml LB培养基，将一个枯草芽孢杆菌菌落接种于LB培养基上，摇瓶培养条件下培养，培养条件为，温度为34℃、转速每分钟220转、培养13小时；
（b）种子罐培养：从种子培养到最后30M3发酵罐发酵培养需要3级种子扩大，一级种子扩大：将摇瓶培养好的种子按1：100分别扩大于3个500 ml的锥形瓶，装50ml种子培养基，种子培养条件下培养；二级种子扩大：将一级种子扩大的种子按1：100比例扩大于30 L种子发酵罐，装15 L种子培养基，种子培养条件下培养；三级种子扩大：将二级扩大的种子按1：100扩大于3 M3种子发酵罐，装1.5 M3种子培养基，种子培养条件下培养；
种子培养基为LB培养基。种子培养条件为：温度为34℃，转速每分钟160转，罐压0.06Mpa.通风量1：1，接种量1%；一级种子扩大培养时间为13小时，二级种子扩大培养时间为11小时，三级种子扩大培养时间为9小时。
（2）将所述的抗菌肽发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（3）将枯草芽孢杆菌菌液接种于30 M3发酵罐，装21 M3抗菌肽发酵培养基，发酵培养条件下培养。发酵条件：温度34℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟180转，罐压0.06Pma，发酵时间为36小时，接种量为0.9%，枯草芽孢杆菌菌液为三级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为5900微克/毫升。
对比例3
与实施例1相比，对比例1中抗菌肽发酵培养基中除了不含有豆粕水解液外，其它成分都相同。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为4621微克/毫升。
对比例4
与实施例1相比，对比例2中抗菌肽发酵培养基：按质量分数计，蛋白胨2.0%，酵母浸粉2.3%，玉米粉3.5%，磷酸二氢钾0.5%，淀粉2.5%，硫酸镁0.85%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为4669微克/毫升。
实施例3
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨2.5%，酵母浸粉1.0%，玉米粉2.8%，磷酸二氢钾0.55%，淀粉1.5%，硫酸镁0.9%，豆粕水解液3.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.7。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）种子制备：
（a）摇瓶菌种：在250 ml的锥形瓶上，装30ml LB培养基，将一个枯草芽孢杆菌菌落接种于LB培养基上，摇瓶培养条件下培养，培养条件为，温度为36℃下、转速每分钟220转、培养11.5小时；
（b）种子罐培养：从种子培养到最后30 M3发酵罐发酵培养需要3级种子扩大，一级种子扩大：将摇瓶培养好的种子按1：100分别扩大于3个500 ml的锥形瓶，装50 ml种子培养基，种子培养条件下培养；二级种子扩大：将一级种子扩大的种子按1：100比例扩大于30 L种子发酵罐，装15 L种子培养基，种子培养条件下培养；三级种子扩大：将二级扩大的种子按1：100扩大于3 M3种子发酵罐，装1.5 M3种子培养基，种子培养条件下培养；
种子培养基为LB培养基。种子培养条件为：温度为36℃，转速每分钟160转，罐压0.06Mpa.通风量1：1，接种量1%。一级种子扩大培养时间为11小时，二级种子扩大培养时间为9小时，三级种子扩大培养时间为7.5小时。
（2）将所述的抗菌肽发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（3）将枯草芽孢杆菌菌液接种于30 M3发酵罐，装21 M3抗菌肽发酵培养基，发酵培养条件下培养。发酵条件：温度35℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟120转，罐压0.04Pma，发酵时间为36小时，接种量为1.1%，枯草芽孢杆菌菌液为三级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为5500微克/毫升。
对比例5
与实施例1相比，对比例1中抗菌肽发酵培养基中除了不含有豆粕水解液外，其它成分都相同。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为4500微克/毫升。
对比例6
与实施例1相比，对比例2中抗菌肽发酵培养基：按质量分数计，蛋白胨3%，酵母浸粉1.3%，玉米粉3.0%，磷酸二氢钾0.7%，淀粉1.5%，硫酸镁0.9%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.7。其它步骤及步骤的条件都相同。对比例1发酵液中的天蚕素含量为4586微克/毫升。
本申请的实施例还可以是以下实施例
实施例4
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.8%，酵母浸粉2.0%，玉米粉2.7%，磷酸二氢钾0.52%，淀粉1.9%，硫酸镁0.75%，豆粕水解液3.8%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（2）将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将枯草芽孢杆菌菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度35℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟140转，发酵时间为32小时，接种量为0.95%，枯草芽孢杆菌菌液为实施例1二级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为5627微克/毫升。
实施例5
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨2.3%，酵母浸粉1.8%，玉米粉2.4%，磷酸二氢钾0.51%，淀粉2.2%，硫酸镁0.9%，豆粕水解液4.1%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（2）将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将枯草芽孢杆菌菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度36℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟160转，发酵时间为32小时，接种量为1.05%，枯草芽孢杆菌菌液为实施例2二级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为5716微克/毫升。
实施例6
一种提高天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，按质量分数计，蛋白胨1.8%，酵母浸粉1.8%，玉米粉3.6%，磷酸二氢钾0.48%，淀粉2.1%，硫酸镁0.88%，豆粕水解液4.3%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.6。
使用所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，包括以下步骤：
（1）发酵培养基121℃灭菌30分钟，然后接种菌种进行发酵培养；
（2）将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将枯草芽孢杆菌菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度34℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟170转，发酵时间为35小时，接种量为0.9%，枯草芽孢杆菌菌液为实施例3二级种子扩大培养好的种子。
发酵培养后得到的发酵液中的天蚕素含量检测采用高效液相法测定，天蚕素含量为5903微克/毫升。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，应当指出，对于本领域的及任何熟悉本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，及作出的若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种提高由ZL200810132258.1 公开的方法得到的工程枯草芽孢杆菌天蚕素含量的抗菌肽发酵培养基，其特征在于：按质量分数计，蛋白胨1.5-2.5%，酵母浸粉1.0-2.0%，玉米粉2.4-3.6%，磷酸二氢钾0.45-0.55%，淀粉1.5-2.5%，硫酸镁0.7-0.9%，豆粕水解液3.5-4.5%，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.4-7.7。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵培养基，其特征在于：按质量分数计，蛋白胨2%，酵母浸粉1.5%，玉米粉3%，磷酸二氢钾0.5%，淀粉2%，硫酸镁0.8%，豆粕水解液4%，饮用水配制，其余为饮用水，发酵培养基pH为7.5。
3.使用权利要求1或2所述抗菌肽发酵培养基发酵生产天蚕素的方法，将抗菌肽发酵培养基置于发酵容器中，将由ZL200810132258.1 公开的方法得到的工程枯草芽孢杆菌的菌液接种于抗菌肽发酵培养基中，然后进行发酵培养，发酵条件：温度33-37℃，通风比：1：0.5，转速：每分钟120-180转，发酵时间为30-36小时，接种量为0.9%-1.1%。
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