CN112501178B - 一种水稻温敏不育突变体tms18及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻温敏不育基因突变体tms18及其应用，所述水稻温敏不育基因突变体tms18的核苷酸序列包含序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。发明人通过对TMS18的研究发现，其育性的改变与花粉外壁第二层的结构完整与否相关，并对该基因进行了深入研究，在研究过程中，发明人筛选中意外发现了温敏核不育突变体tms18，该突变体的育性受到不同温度的影响，并且在特定情况下可以恢复，更为重要的是，该突变体的育性敏感期与其他温敏不育基因都不同。该基因这一独特的特点可为两系的杂交育种提供新的理论依据与应用价值。

Description

一种水稻温敏不育突变体tms18及其应用

技术领域

本发明涉及农业领域，具体涉及一种水稻温敏不育突变体及其应用，其可以在特定条件下恢复育性。

背景技术

在农业生产中，植物雄性不育为杂种优势(heterosis)利用提供了重要途径和种质资源。水稻为单子叶禾本科(Gramineae)稻属(Oryz Linnaeus)的一年生草本植物，是世界上最重要的粮食作物之一。通过利用品种间杂种优势到亚种间杂种优势，甚至远缘间杂种优势，使杂种优势更加明显。水稻雄性不育材料在杂交育种和农业生产上具有十分重要的利用价值，“三系法”和“两系法”制种技术的应用，大大促进了人们对水稻花粉发育的研究。

在光温敏不育系的应用后，杂交水稻的生产了基于细胞质雄性不育的三系法杂交稻和依赖于光温敏核不育(photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility,P/TGMS)的两系法杂交稻的这两个***。三系法杂交稻需要细胞质雄性不育系、恢复系和保持系，而两系法则包括光温敏核不育系和恢复系，光温敏核不育系在不同的环境因子条件下即可繁殖自身也可用于杂交制种。

水稻光温敏核不育系是两系法杂交稻的基础与核心。据统计从1994年到2009年，培育出了427个两系不育系用于商业化的生产利用，总面积大约2100万公顷(斯华敏等,2011)。

但是，不育基因位点的多样性使得基因的分离模式也存在多样性。根据不同的遗传模式，可分为单基因遗传模式、双基因遗传模式、三基因遗传模式、质量-数量基因遗传模式及非典型分离模式等。例如最近的基因克隆研究发现，NK58S材料中除了目前已知的pms3/ptms12-1这个被定位的隐性遗传基因外，同样还存在着pms1的半显性基因控制(Zhouet al,2012；Ding et al,2012；Fan et al,2016)。因此深入分析和挖掘已有光温敏基因，更有助于分子育种的应用。目前基于对光照和温度响应的核不育系大概定位有20多个，但其中克隆到的基因仅3个，虽已取得一定程度的突破，但还需进一步的深入研究，光温敏基因的资源相对较少，因此发掘新的光温敏基因资源很有必要。

发明内容

本申请的发明人通过对TMS18的研究发现，其育性的改变与花粉外壁第二层的结构完整与否相关。并对该基因进行了深入研究，在研究过程中，发明人筛选中意外获得了一个温敏核不育突变体tms18，该突变体的育性受到不同温度的影响，并且在特定情况下可以恢复，更为重要的是，该突变体的突变位点与已报道的光温敏突变位点都不同，育性敏感期与其他温敏不育基因也不同。目前已知克隆的光温敏核不育系基因育性的敏感时期主要集中在花粉母细胞减数***以前，而该突变体是在花粉母细胞减数***以后受到影响。该基因这一独特的特点可为两系的杂交育种提供新的理论依据与应用价值，并且，由于低温育性恢复的时间特殊并且更晚，可以更方便地对其育性恢复期进行判断，进而在育种中进行应用，比如，对相应植株在花粉母细胞减数***以后进行低温处理。

本发明的技术方案如下：

一种水稻温敏不育基因突变体tms18，其特征在于，所述水稻温敏不育基因突变体tms18的核苷酸序列包含序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

在一种优选实现方式中，所述水稻温敏不育基因突变体tms18的核苷酸序列由序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列构成。

此外，本发明还提供了一种含有所述水稻温敏不育基因突变体tms18的表达载体。

本发明还提供了一种所述的水稻温敏不育基因突变体tms18在制备隐性雄性核不育转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种所述的水稻温敏不育基因突变体tms18在水稻育种中的应用，所述应用包括(1)将含有导致水稻不育的突变基因tms18导入水稻，其表型显示为高温不育，低温育性恢复；

(2)或将其通过杂交导入到水稻其他品种中，F2代中得到的不育植株同样也能显示温敏不育表型的；

(3)或者以(1)和(2)中获得的不育植株为母本，用不同的水稻品种作为父本进行杂交，培育杂交目标水稻，获得相应杂交种子。

本发明还提供了一种培育在水稻花粉发育受温度影响的育性可恢复水稻的方法，所述方法包括将所述水稻温敏不育基因突变体tms18导入到水稻种子细胞中，利用导入了所述温敏不育基因突变体tms18的水稻种子进行相应水稻培育。

本发明还提供了一种调节植物的温敏育性性状的方法，其特征在于，包括步骤：将野生型的TMS18蛋白的N端非催化活性区域的特定甘氨酸(G)采用(S)进行替换。

本发明还提供了一种所述的水稻温敏不育基因突变体tms18的用途，其特征在于，用于调节或提供植物的温敏育性性状，或被用作转基因植物的选择标记。

在一种优选实现方式中，所述选择标记的标记性状为温敏育性性状的可逆性变化。

在另一种优选实现方式中，所述温敏育性性状的可逆性变化指在低温(如27－25，较佳地，25－23)条件下，植物表现为育性恢复的性状；在高温(如28－29，较佳地，29－32)条件下，植物表现为不育性状。

本发明的温敏不育突变体基因对温度敏感，当对其进行低温处理时，可以实现90％以上的育性恢复效果，并且，该基因突变体的低温响应时间具有着特殊性，在花粉发育的第9-10期时，此时花粉的外观特征更加明显，更容易判断，更有利于对实验的精准控制，因此，应用中，可以在该时期对相应植株进行低温处理。

附图说明

图1为tms18植株育性变化的环境温度和湿度。

图2为不同温度下野生型和tms18温敏植株表型分析结果，其中(A-C)野生型和tms18突变体抽穗后表型比较；(D)野生型和tms18突变体的开花后花药比较；(E)野生型和tms18突变体小穗去壳后花药比较；(H)野生型和tms18突变体单个花药比较；(F)野生型和tms18突变体花药Alexander染液比较；HT，高温处理(>28℃)；LT，低温处理(<23℃)；标尺长度(E-F)为100μm；(G)为200μm。

图3为不同时间处理下tms18的结实率分析，其中，(A)tms18突变体抽穗后结实表型比较；(B)tms18突变体抽穗后结实率表统计。

图4为不同温度下野生型和tms18突变体花药发育过程细胞学观察结果。

图5为不同温度下野生型和tms18突变体花药及花粉在扫描电镜观察结果，其中，(A,F,K)野生型(A)和tms18材料高温下(B)、低温下(C)花药的扫描电镜观察结果；(B,G,L)野生型(B)和tms18材料高温下(G)、低温下(L)花药放大结构的扫描电镜观察结果；(C,H,M)野生型(C)和tms18材料高温下(H)、低温下(M)花药开裂后结构的扫描电镜观察结果；(D,I,N)野生型(D)和tms18材料高温下(I)、低温下(N)成熟花粉的扫描电镜观察结果；(E,J,O)野生型(E)和tms18材料高温下(J)、低温下(O)成熟花粉放大结构的扫描电镜观察结果；HT，高温处理(>28℃)；LT，低温处理(<23℃)；图中标尺(A,F和K)为200μm，(B,G,L,D,I和N)为10μm，(C,H和M)为，(E,J和O)为1μm。

图6为不同温度下野生型和tms18突变体花粉透射电镜观察结果；

其中，(A-E)野生型花药第7期到第10期，12期的花粉透射电镜观察结果；(F-J)tms18突变体花药高温下第7期到第10期，12期的花粉透射电镜观察结果；(K-O)tms18突变体花药低温下第7期到第10期，12期的花粉透射电镜观察结果；每个时期图的右侧小图为该图的放大结果。HT，高温处理(>28℃)；LT，低温处理(<23℃)。Ap，不正常花粉；Ba，棒状结构；E，花药表皮；En，花药内皮层；Ex，花粉壁；Msp，小孢子；Ne，外壁内层；PE，初生外壁；Se，外壁外层；T，绒毡层；Tds，四分体。图中标尺E，J和O为1μm；其它均为5μm(左)；500nm(右放大)；

图7示出了不同温度下野生型和tms18突变体花粉外壁II厚度，图中分别为在第9期、第10期和第12期野生型和tms18突变体在不同温度下花粉外壁II的厚度。图中数据为平均值±标准差，每组数据为4个生物学重复。

P<0.05；

图8为TMS18基因克隆定位和序列分析结果，其中，(A)Indel分子标记对水稻12号染色体初定位结果。(B)tms18突变体遗传互补验证。(C)TMS18基因SNP测序定位分析。

图9为TMS18同源蛋白进化树及其保守位点分析结果，其中，(A)为采用邻接法对TMS18及其在不同物种间的直系同源基因进行进化树分析的结果；模型计算过程中进化树的自展值为1000；(B)为TMS18同源蛋白的保守位点分析结果。

图10为TMS18基因在水稻不同组织中半定量PCR分析结果，其中示出了TMS18基因和内参基因OsACTIN在不同组织中的半定量分析。Le，外稃；Pa，内稃；L2.5，颖壳长度2.5mm；L3.0，颖壳长度3.0mm；L4.0，颖壳长度4.0mm；L5.0，颖壳长度5.0mm。

图11为TMS18-GFP荧光蛋白在水稻花药中的定位分析结果。

图12为tms18不同位点突变蛋白氨基酸序列与野生型比较分析结果，其中，“1”为本试验中产生温敏核不育系的蛋白氨基酸突变位置；“2”为Chang et al,2016文献中蛋白氨基酸突变后导致完全雄性不育位置。

图13为进行基因互补实验的结果。

具体实施方式

以下结合附图及其实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例描述的范围之中。

发明人以粳稻品种中花11为材料，用甲基磺酸乙酯(EMS)筛选获得了温敏核不育系TMS18植株材料，并在实验中获得了tms18突变体，突变体的基因序列如序列表中SEQ IDNo.1所示(包含外显子和内含子)，其所编辑的氨基酸序列如图12所示。下面对具体的实验过程进行详细描述。

植物材料与种植

本实施例中，所采用的水稻材料为水稻粳稻品种中花11(Oryza sativassp.japonica,ZH11)。EMS突变株的诱变和筛选参照Zhang et al.2007。筛选中，意外获得了含有SEQ ID No.1所示基因序列的突变植株。

tms18的温敏特性鉴定

本实施例中，在2018年5月18日起，每周分别萌发24株中花11野生型，tms18突变体，以及农业生产上应用面积最广的安农S-1不育系，育秧后将秧苗***上海奉贤大田种植，至7月26日-8月1日期间，上海的平均气温达到最高点，约在30.5摄氏度，第一批(5月18日萌发)材料到达孕穗期(花粉发育时期)，经过高温处理后，开花自交后，由于没有花粉，显示出几乎完全不育的表型(如图2所示)。而在第八批材料(7月6日萌发)中，由于其孕穗时间在9月10日左右，上海平均温度降至26.5度，低温导致花粉发育部分恢复正常，自交材料的育性从而得到部分的恢复。其高温不育性要优于安农S-1

细胞学分析

植物材料拍摄用尼康数码相机(Nikon D7000)。亚历山大染色配置可参考Alexander,1969。对于半薄切片，选取水稻不同发育阶段的小穗进行固定并包埋于Spurr环氧树脂中(具体方法可参考Zhang et al,2007。使用Olympus DX51数码相机(Olympus,Japan)进行花药切片的拍摄。将8nm金颗粒包裹新鲜雄蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用JSM-840显微镜(JEOL,Japan)观察。对于透射电镜实验，将水稻小穗冰上固定于固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.2)。小穗材料则进一步依次包埋至树脂(‘Hard Plus’Embedding Resin,Unite Kingdom)中(具体方法可参考Zhang etal.,2007)。超薄切片(50-70nm)则利用JEM-1230透射电子显微镜(JEOL,Japan)进行观察。

RNA抽提和定量RT-PCR

总RNA提取利用Trizol试剂(Invitrogen,USA)由成熟土培水稻植物小穗组织进行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5μg的RNA反转第一条cDNA链(60分钟，42℃)，合成好的cDNA链作为PCR的模板。定量RT-PCR则是利用SYBR Green Imaster mix(Toyobo,Japan)通过ABI PRISM 7300***(Applied Biosystems,USA)进行检测。定量RT-PCR的程序参数是：95℃5分钟，94℃10秒变性40个循环，60℃退火延伸1分钟。定量RT-PCR中所使用的引物列表于电子版的附件中。β-actin则作为对照。

需要说明的是，本发明中的植物材料都是培养于肥沃的土壤中，培养条件为：高温与低温处理在玻璃温室和人工智能光照房。高温处理温度一般在夏季或平均温度大于28℃的环境中，低温处理一般在秋季或平均温度为22-24.5℃的条件下，光照为自然条件光源。

如图所示，与野生型相比，tms18突变体营养生长正常，无明显差异(图2A-C)。在高温下(>28℃)tms18植株表现为雄性不育(图1)，在低温环境下(<23℃)tms18植株育性可恢复(图1)。植株花序开花后tms18突变体植株的花药在高温下没有花粉散出，而在低温下植株花药中花粉呈现正常(图2D)。通过对小穗的观察发现其外稃和内稃无明显差异，但野生型花药呈饱满且黄色，而tms18突变体在高温下花药明显皱缩变小，低温下则恢复饱满状态(图2E-F)。花药的Alexander染色结果表明野生型花粉累积的内容物丰富呈现出***，而突变体中在高温下没有可见被染成***的花粉粒，低温下则恢复正常，说明tms18突变体花药发育过程中受到温度的影响，低温能够弥补tms18突变体中的雄配子体发育缺陷。

为了验证tms18对不同温度的响应，发明人分别对该突变体进行不同时间段的种植处理。种植的时间为7月1号到9月15号，每隔两周进行一次萌发种植，以观察育性恢复的情况。如图3所示，在7月中旬前移栽的tms18材料均表现出完全不育表型，在8月初移栽的材料则有部分育性恢复，恢复率在10％左右。随着移栽时间的推后，tms18材料在自然低温条件下的恢复可基本与野生型材料的育性相似，小穗下垂较为明显，结实率达90％左右。说明在适当温度条件下tms18材料具有较好的育性恢复。

机理分析：

申请人发现，低温能够弥补tms18突变体(本文中类似表述均指含有该突变体的水稻植株，发明人所培育含tms18突变体植株是通过实验获得的，本领域技术人员可以根据本发明所提供的基因序列采用该现有的农杆菌介导等方法将该突变体导入到水稻植株中，这些方法都是现有技术这里不再详细描述)中从四分体释放后的小孢子发育缺陷。

为了分析在不同温度条件下含tms18植株在花药及花粉发育的变化和差异，通过半薄切片对野生型中花11和tms18突变体在花药长度为1-5.6mm的幼穗小花进行观察。野生型和突变体植株在高温下花药的半薄切片结果表明，在第6期到第8期，花药发育的均能正常进行减数***，形成四分体，两者无明显区别(图4A-C和G-I)。野生型的绒毡层细胞在前期形成并且在第9期开始进行正常PCD，小孢子进一步发育膨胀在花粉壁的孢粉素沉积较为致密，花粉的发育正常(图4D)。在第10期，野生型小孢子正常发育浓缩形成月牙型结构，绒毡层细胞继续降解随后发育形成成熟的花粉，最后形成饱满正常的花粉粒(图4E-F)。tms18突变体在高温下，绒毡层在前期几乎没有明显变化，但花粉的发育在后期成熟时期发育异常，最终表现出破裂，不能形成正常的花粉粒(图4K-L)。tms18突变体在低温条件下，花粉及绒毡层细胞发育均正常，能形成正常的花粉(图4M-R)。

为更细致的了解tms18突变体花药及花粉发育的情况，发明人采用扫描电镜观察花药外表面及内表面、花粉的表面结构。在扫描电镜下，野生型花药发育正常呈现饱满型，而高温下tms18突变体与野生型相比花药相对较小、干瘪，低温下则恢复正常(图5A，F和K)。在花药发育的后期，野生型正常发育表面出现网状的蜡质和角质结构，tms18突变体在低温和高温下均的花药表面无明显差异(图5B，G和L)。对花药内壁的结构观察发现，无论在高温和低温下野生型、tms18突变体花药内壁有较多致密的球状体结构(图5C，H和M)，但在高温下tms18突变体花药中的花粉呈现皱缩表型。此外与野生型花粉外壁的致密结构相比，tms18突变体花粉外壁的结构存在表明开裂的缺陷且明显皱缩(图5D-E，I-J，和N-O)。这说明tms18基因突变不影响花药外表皮和内表面，但会导致花粉外壁的缺陷表型。

为更进一步清晰阐述tms18突变体在高温和低温下花粉外壁情况，发明人对花药第7-10，12期的小孢子进行透射电镜观察。结果显示在花药发育的第7期(四分体时期)tms18突变体与野生型不同温度下的小孢子周围均被胼胝质包裹着，无明显的差异(图6A，F和K)。随后小孢子从胼胝质中释放出来进入第8期，对该时期的花粉外壁结构观察发现，野生型花粉外壁逐渐出现了孢粉素的沉积且较为致密，而tms18突变体在高温下的花粉外壁孢粉素沉积较少，而在低温环境下花粉外壁孢粉素的沉积有所恢复(图6B，G和L)。在第9期时，野生型小孢子呈膨胀放大，花粉外壁的结构基本形成呈现出“工”字型结构，而tms18突变体在高温处理下小孢子花粉外壁也能呈现出“工”字型结构，但其内部第二层结构出现明显变薄现象，且在内部存在一些明显的断口(图6C，H和M)。在第10期小孢子进入月牙型结构，高温下花粉外壁第二层存在缺陷结构依旧能观察到，而在低温下其厚度仍然没有恢复，但其裂口消失(图6D，I和N)。在花药发育后期，野生型能正常形成可育的花粉，而tms18突变体在高温下花粉外壁结构存在缺陷最终不能正常形成花粉，而在低温下可形成成熟花粉粒。说明tms18突变体的温敏特性与花粉外壁第二层结构缺陷有关(图6E，J和O)。对花粉发育第9期，第10期及第12期的花粉外壁第二层结构用image J软件进行统计分析。在花粉发育的第9-10期小孢子进入快速膨胀期及浓缩期，高温处理下tms18突变体的花粉外壁第二层厚度显著变薄，与野生型相比分别减少了60.7％和61.2％，差异显著。当花粉发育第10期时，小孢子进入月牙型结构，tms18突变体在高温和低温环境下呈现出显著差异，与低温处理下相比减少了32.7％。当花粉发育处于成熟期时，高温处理下的花粉依旧破裂，而在低温处理下能形成正常花粉，但两者的厚度无显著差异。以上结果说明温度对tms18突变体花粉发育受到温度的影响主要是在第9期(小孢子膨胀期)和第10期(月牙型期)，在小孢子母细胞减数***时期之后的时期影响较大。具有这一特性的基因目前尚未见到报道。

TMS18基因编码葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)家族氧化还原酶

为进一步确定控制tms18温敏核雄性不育性状的基因，发明人通过Indel分子标记的方法对水稻12条染色体的分子标记多态性进行检测。通过构建籼稻与粳稻的F₂群体对中花11和卡萨拉斯的多态性进行分析，结果发现位于第10号染色体的20.11M-20.70M位置附近的标记在野生型和野生型的1:1混合池中均表现出正常带型，但在其它4个雄性不育基因池中却与野生型和卡萨拉斯的1:1混合池不一致，而与中花11的带型相似呈现出单一条带(图8A)。因此初步认定该标记20.11M-20.70M处与控制tms18温敏核不育性状的基因具有一定的连锁关系。

基于全基因组SNP测序、基于初定位结果以及候选基因测序验证，在TMS18基因第2个外显子181bp上有一个从G到A的碱基突变，该碱基突变导致野生型中花11编码的甘氨酸突变为丝氨酸(图8C)。结合图位克隆技术对水稻染色体上的初定位结果在第10号染色体的上RM237i位置附近，同时对已有的高温下不育的纯合突变体测序分析(图8C)，基本确定了SNP全基因组成测序的可靠性。

发明人利用遗传互补实验进一步进行验证分析。

克隆了目标基因片段，包括上游启动子区和下游区域，利用农杆菌介导转化tms18/+杂合的水稻种子，进行转基因植株的培育。

具体而言，以野生型植株为模板，将光温敏基因用特异性引物扩增cDNA，然后通过中间载体构建到Blunt上，大量扩增，然后通过BamHI和SalI两个酶切位点构建到1300-eGFP上。将含有载体和eGFP的质粒转化到农杆菌EHA105中，然后侵染相应突变体的杂合子种子中，获得互补转基因植株。互补植株在高温下显示正常可育表型，结果如图13所示。

申请人鉴定了13个转基因株系中6个为tms18/tms18背景，在高温环境中(大于29℃)，这些植株与未经过转基因的tms18/tms18背景相比，恢复了育性可形成正常的种子。扫描电镜的结构也显示，转基因植株的花粉恢复正常与野生型无明显差异(图8B)。

TMS18基因编码一个含义587个氨基酸大约65kDa的蛋白。结构分析表明TMS18蛋白属于葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶家族成员，该家族成员普遍存在于动物、植物及微生物体内，包括葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶(Wongnate and Chaiyen,2013)。

在tms18突变体中，小孢子在四分体时期之后坍塌，表明该基因与的花粉外壁的形成有密切联系。

tms18温敏核不育系的可能分子机理分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族可催化醇类物质氧化成相应醛类物质，且产生H₂O₂产物(Wongnate and Chaiyen,2013)。有研究表明，真菌中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族的蛋白结构预测发现N端可能是ADP的结合位点，C端可能是酶促催化反应的结合位点，而中间部分则为FAD的结合位点(Zámocky et al,2004)。通过对包含野生型基因与突变基因的植株的其他部位进行对比观察，发现本发明的温敏基因突变体在花药中特异表达。该基因单碱基突变在高温下引起花粉外壁第二层结构变薄，进而产生了温敏不育表型。

tms18温敏核不育系潜在的应用价值

对于光温敏核不育系材料生产应用的选择，其育性转换敏感时期的温度很关键，一般不育起点温度较低的材料较好。光温敏核不育系育性转换的敏感时期越长所带来的风险相对较少，因此在筛选光温敏核不育系中两个方面较为重要。有研究表明，光敏核不育系NK58S的育性敏感转换时期为第二次枝梗原基、颖花原基分化期，雌雄蕊原基分化期和花粉母细胞形成时期，且育性转换最敏感时期为后面两个时期(元朝生等,1988)。AnS-1是籼型温敏核不育系，其育性转换的敏感时期为花粉母细胞形成时期到第二次减数***形成四分体时期，主要的敏感时期在开花前9-16d左右的时间(刘爱民,1996)。无论是原始还是衍生的光温敏核不育系，其育性的敏感时期均在减数***四分体时期以前，而在减数***后面时期的材料未有相应报道，因此发掘在减数***时期以后的敏感光温敏核不育系具有良好的应用前景。本研究中tms18温敏核不育系基因主要表达时期在花药的中后期，且在花粉发育的第9-11期，花粉外壁表现出变薄的现象。这可能暗示着温敏核不育系受到温度影响敏感时期可能在花粉母细胞减数***时期之后。目前生产上应用广泛的光温敏核不育系基因95％左右主要来源于安农S-1和农垦58S(Zhang et al,2014)。这些光温敏核不育系及其衍生品种受到温度和光照敏感时期的影响在花粉母细胞减数***之前，而tms18温敏核不育系受温度的影响主要是在后期。因此对于目前生产上制种所遇到的夏季低温潮易恢复的问题，其应用价值可与生产上应用的温敏核不育系进行杂交，构建双突以延长受温敏影响的时期，从而试图解决所遇到的一些制种安全问题。

相同基因位点在不同的材料上有着不同的育性转换温度，其中不同的遗传背景发挥着关键作用。对于以上两个相对较为原始的光温敏核不育系来说，育种家选育衍生出的品种在生产上应用更加广泛与实用。将tms18与温敏核不育系Peiai64S和AnS-1相比较，其育性转换温度在两者之间。将该基因导入到不同的遗传背景中选育出育性转换温度较低的温敏不育系也是一个应用途径之一。因此，在利用新的水稻光温敏核不育基因资源，选择育性转换温度低的光温敏核不育系是两系法杂交水稻的研究主要方向之一(雷开荣,1997)，此外选育具有广亲和的光温敏核不育系是实现粳籼杂交利用杂种优势的有效途径之一(袁隆平,1996)。

本发明的tms18突变体氨基酸的序列发生改变主要是在蛋白的N端，由甘氨酸变为丝氨酸的变化，其它的位置均未发生改变。对于该蛋白结构的预测分析表明，N端可能是ADP的结合位点，C端可能是酶促催化反应的结合位点，而中间部分则为FAD的结合位点。因此tms18突变体可能与ADP保守区域的结合有关。以上结果说明TMS18基因与水稻的雄性有着密切关系，且不同位点突变会引起不一致的性状表型。该基因保守的ADP的结合位点突变后在其他物种上也是否具有温敏的特性，需进一步研究分析。

综上所述，本申请的发明人克隆获得了水稻中葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶家族的基因TMS18，发现该基因突变体表现为光温敏雄性不育表型，与目前生产应用的光温敏核不育系均非同一位点。细胞学分析表明tms18突变体花粉外壁的第二层结构完整性存在明显变薄且断裂的缺陷，现象导致花粉在快速膨胀期破裂败育。但低温处理下小孢子外壁断裂现象得以一定程度恢复。进一步的分析表明，TMS18蛋白特由绒毡层细胞分泌出，特异性在绒毡层、药室和花粉表面定位。发明人的研究数据表明tms18作为一个新的温敏核不育系，其育性敏感期主要是在花粉母细胞减数***以后，这与目前报道的光温敏材料不同，具有一定的应用价值。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 上海师范大学

<120> 一种水稻温敏不育突变体tms18及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2191

<212> DNA

<213> tms18

<400> 1

atggcagcac ttggccgcgc gagctcgtcg gcgccggtgc ttgccgccgc cgccgccgtg 60

ctcctctcgc tctgcctcgc cgcgctctcg gaagagcaag gtgcgtaaac gttgcgttgt 120

atctttgcgt tgatgcgtgt tgcgtcgtcg tcgtgttcat ggcgtgcgat ggcgttgtgc 180

agagcaactg gagaacctgc ggttcgtgcg gcacgcgcag gacgcgccgc tggtgtcgag 240

ctacaactac atcgtcatcg gcagcggcac ggcggggtgc ccgctggcgg cgacgctgtc 300

ggagcactcg cgcgtgctgc tgctggagcg cggcggcctg ccgtacgcca acatgtcgag 360

cgagcagcac ttcacggacg cgctggccga cacgtcgccg gcgtcgccgg cgcagcggtt 420

catctcggag gacggcgtgg tgaacgcccg ggcgcgggtg ctcggcggcg ggagctgcct 480

caacgccggg ttctacacgc gggcgagcaa cgagtacgtg cgcgcctccg ggtgggacgc 540

gcggctggtg aactcgtcgt accggtgggt ggagcgctcg ctggtgttcc gccccgacgt 600

gccgccgtgg caggcggcgc tccgcgacgc gctgctcgag gtcggcgtca cgcccgacaa 660

cggcttcacc ttcgaccacg tcaccggcac caagatcggc ggcaccatct tcgacaactc 720

cggccagcgc cacaccgccg ccgacttcct ccgccacgcc cgcccccgcg gcctcaccgt 780

cctcctctac gccaccgtct cccgtatcct cttcaaaagc caaggtacac agctacgatg 840

aaaatggaaa atgtgctgtg cgccgaagaa gcttgacctc acgacggcga gcttttgcca 900

tggcgtgcag acggggtgcc gtacccggtg gcgtacgggg tggtgttctc ggacccgctg 960

ggggtgcagc accgggtgta cctccgcgac ggcgacaaga acgaggtgat cgtgtcggcg 1020

gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tcgggccgca ggcgcacctg 1080

gaggcgcacg gcatcgaggt gatcgtggac caacccatgg tcgggcaggg cgtcgccgac 1140

aacccgatga actcggtgtt catcccgtcg ccggtgccgg tggagctctc cctggtgcag 1200

gtcgtcggca tcacccgctc cggcagcttc atcgaggggg tgagcgggtc ggagttcggc 1260

atgccggtgt cggacggcgc gctccggtgg gcgcgcagct tcgggatgct gtcgccgcag 1320

acggggcagc tcggcacgct gccgccgaag cagaggacgc cggaggcgct gcagcgggcg 1380

gcggaggcga tgatgcggct ggacaggagg gcgttccggg gaggcttcat cctggagaag 1440

atcctcgggc cggtgtcctc cggccacgtc gagctgcgaa ccaccgaccc gagggcgaac 1500

ccgtcggtga cgttcaacta cttccgcgag gcagaggatc tggagcggtg cgtccatggc 1560

atcgagacga tcgagcgggt gatccagtcg cgggccttct ccaacttcac ctacgccaac 1620

gcctccgtcg agtccatctt caccgattcc gccaacttcc ccgtcaacct gctgccgcgc 1680

catgtcaacg actcgcgctc gccggagcag tactgcatgg acaccgtcat gaccatctgg 1740

cactaccacg gcggctgcca tgtcggcgcc gtcgtcgacg acgattaccg ggtgttcggg 1800

gtgcaggggc tcagggtgat cgacagctcc accttcaagt actcccccgg caccaaccct 1860

caggccaccg tcatgatgct cggcaggtaa ctggcatcat tttagctcat gaaagtgcat 1920

tgccatgagt aacaacacac taacagtata gttttcaata tggacactgg gcaggtatat 1980

gggtgtgaag attcagtccg agagatggaa gaaatgatga acaaaagata atttcgtttc 2040

aggagcaaaa aaatgcatgt aattcaagga aaagaaaatg ttcaactgtc tttagagttt 2100

agagtagatt ttatttgcac ccacttaatt tttactcttc tctagacata ggttcagtat 2160

ctgcttgttg attatgtaac cttgaagaag c 2191

Claims (9)

1.一种水稻温敏不育基因突变体tms18，其特征在于，所述水稻温敏不育基因突变体tms18的核苷酸序列由序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列构成。

2.一种含有权利要求1所述水稻温敏不育基因突变体tms18的表达载体。

3.一种权利要求1所述的水稻温敏不育基因突变体tms18在制备隐性雄性核不育转基因植物中的应用。

4.一种权利要求1所述的水稻温敏不育基因突变体tms18在水稻育种中的应用，所述应用包括(1)将含有导致水稻不育的突变基因tms18导入水稻，其表型显示为高温不育，低温育性恢复；

(2)或将其通过杂交导入到水稻其他品种中，F2代中得到的不育植株同样也能显示温敏不育表型的；

(3)或者以(1)和(2)中获得的不育植株为母本，用不同的水稻品种作为父本进行杂交，培育杂交目标水稻，获得相应杂交种子。

5.一种培育受温度影响的育性可恢复水稻的方法，所述方法包括将权利要求1所述的水稻温敏不育基因突变体tms18导入到水稻种子细胞中，利用导入了所述温敏不育基因突变体tms18的水稻种子进行相应水稻培育。

6.一种权利要求1所述的水稻温敏不育基因突变体tms18的用途，其特征在于，用于调节植物的温敏育性性状，或被用作转基因植物的选择标记。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述选择标记的标记性状为温敏育性性状的可逆性变化。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述温敏育性性状的可逆性变化指在低温条件下，植物表现为育性恢复的性状；在高温条件下，植物表现为不育性状。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述低温为27－23摄氏度，植物表现为育性恢复的性状；所述高温为28－32摄氏度。

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