CN108315336B - 一种控制水稻小穗发育基因pis1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用。具体涉及一个控制水稻小穗发育基因的定位、克隆、功能验证和应用。所述的PIS1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2 所示。PIS1决定水稻小穗的花器官发育，特别是雌蕊与雄蕊的发育。利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻中的表达，可以调节水稻的育性，创造水稻育种的新种质。因此，本发明对遗传改良水稻具有很好的应用前景。

Description

一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻花器官发育的基因PIS1（Panicle In Spikelet），并利用转基因互补实验验证了该基因的功能。同时，还涉及利用该基因调控水稻性器官的发育，即通过利用遗传工程的方法调节PIS1基因的表达，从而控制水稻的育性，创造水稻育种的新种质。因此，本发明对遗传改良水稻具有很好的应用前景。

背景技术

水稻是我国第一大栽培作物，在国民经济中占有举足轻重的地位。稻穗是水稻最重要的农艺性状之一，由若干小穗组成。水稻小穗既是繁殖器官，也是形成籽粒的基础，任何一个与之有关的重要基因发生功能性突变，均会导致其花器官发育异常而不能结实。因此，小穗一直是水稻遗传改良工作者关注的重点，深入理解小穗形成的分子机制，对指导水稻生产、特别是杂交水稻的品种选育，具有十分重要的意义。

花是植物的最显著特征，花的形成是植物生活史上的一个重大转折点。植物花器官的形成是一个多基因参与调控的复杂生物学过程。20多年前，利用拟南芥等双子叶植物的突变体开展研究，花器官发育的分子遗传研究取得了很大进展，先后克隆了多个以MADS基因为主的花器官特征基因，提出了决定花器官形成的遗传模型。水稻小花的结构特异，与双子叶植物明显不同，但目前仍普遍认为，以MADS基因为主的花器官特征基因的功能相对保守，基于双子叶植物提出的花器官发育模型也基本适用于水稻等单子叶植物。

尽管花器官特征基因的作用十分重要，但它们并不是植物花器官形成的唯一决定因素。近年来发现，作为花器官特征基因的上游调节基因（以转录因子为主），已被证实在不同时期、不同部位或不同调控路径中，通过激活或抑制花器官特征基因的表达，参与决定植物花器官的形成。近年来，植物中鉴定出一种数量少、但广泛分布于植物中的RBR（RB-related）基因。此类基因不仅参与调节细胞周期的进程、维持细胞增生与分化之间的平衡，也参与控制细胞的大小、细胞的死亡、维持干细胞***增殖及分化能力，从而在控制植物的根、茎、叶、花、种子等组织分化与器官形成中发挥至关重要作用。

水稻中有2个RBR基因，但其具体功能并不清楚。本发明利用图位克隆的方法克隆了一个控制水稻小穗发育的因PIS1基因，该基因编码一个RBR蛋白（OsRBR1）。PIS1的功能缺失引起水稻小穗发育异常、性器官完全退化，而降低PIS1的表达则引起雄性不育。因此，利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻中的表达，可以调节水稻的育性，创造水稻育种新种质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制水稻小穗发育的基因，该基因失活造成水稻花器官发育异常，而降低该基因的表达量则导致雄性不育。本发明还提供一种该基因的转基因植株在改良水稻育性中的应用。

为实现以上目的，采用以下技术方案：

PIS1基因具有如SEQ ID No.1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No.1所示的DNA序列至少有90%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No.2所编码的蛋白质是一种植物的RBR蛋白，其中包括进行一个或几个氨基酸替换、***或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No.1中添加、取代、***或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明克隆的水稻PIS1基因的单碱基突变体表现为小穗发育明显异常，但其它性状完全正常（见实施例1）。将正常功能的PIS1基因转化该突变体后，植株恢复正常表型（见实施例2）。

本发明还提供一种用PIS1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了SEQ ID No.1所示的序列基因或该基因类似的部分功能片段的载体，如图4所示（见实施例2）。该载体还有一种含有以上表达载体的宿主细胞。该宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。

本发明利用反义RNA技术抑制水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻雄性不育但其它性状完全正常，可用于培育水稻不育系材料（见实施例3）。具体地说，就是将PIS1基因与其它调控元件如组成型启动子或器官特异性启动子融合构建基因抑制表达载体，通过转基因技术（如反义RNA或RNAi）人为控制水稻的育性，创造新的水稻雄性不育种质，可用于选育水稻新品种。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一．水稻pis1突变体的分离和遗传分析：

利用辐射诱变水稻品种明恢86，本发明获得了一种如图1所示的小穗发育明显异常但其它性状完全正常的突变体pis1。除外稃发育正常外，该突变体小穗的其它花器官均明显异常，其花分生组织的决定性丧失，在大部分小穗的中央长出一个穗状的结构。通过突变杂合体植株自交及与野生型植株正反交实验，证明pis1是一个符合单基因控制的遗传规律。

二、图位克隆PIS1基因：

1．PIS1的定位：

为了分离PIS1基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F₂定位群体，由PIS1突变杂合体为母本、DZ60为父本杂交获得的F₂中的psd1突变体组成。利用水稻微卫星标记和InDel标记对PIS1基因进行定位，将PIS1基因精细定位于如图2所示的BAC克隆AP004592上的InDel4和InDel5之间约32 kb的范围内，通过分析此区段中突变体与野生型的基因组序列差异，以确定候选基因。定位结果如图2所示。

2．PIS1基因的鉴定和功能分析：

构建了一个如图3所示的互补实验载体。本发明通过转基因技术将互补载体转入pis1突变体后获得了如图4所示的表型恢复正常的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了PIS1基因；氨基酸序列分析表明，PIS1编码一个RBR蛋白。

三、抑制水稻内源PIS1的表达，创制水稻新型雄性不育系材料

利用反义RNA技术抑制水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻小穗的雄性不育而不能结实，可用于培育水稻新型不育系材料（见实施例3）。

本发明的优点在于：目前主要是利用杂交水稻的杂种优势来培育高产水稻品种。本发明获得的水稻小穗发育明显异常但其它性状完全正常的突变体pis1，是单基因隐性突变，符合孟得尔遗传规律。本发明通过图位克隆技术获得了PIS1基因，并通过功能互补实验鉴定了该基因的功能。氨基酸序列分析表明，该基因编码一个RBR蛋白。而减少水稻内源PIS1基因的表达，造成水稻小穗的雄性完全不育。因此，可以利用基因工程技术有目的地调节它在水稻中的表达，进而可培育出水稻不育系新种质，以提高水稻的产量、提高杂交制种质量、降低生产成本。因此，该基因具有非常重要的应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1：水稻野生型与对应突变体pis1的表型；A：野生型与对应突变体pis1的小穗表型；B：野生型小穗的表型（张开内、外稃片）；C：pis1突变体小穗的表型。

图2：PIS1基因精细定位及候选基因确定图。

图3：互补实验载体的图谱。

图4：野生型、pis1突变体与互补实验T₀代的小穗表型图。

图5：RNAi实验载体pTCK303-OsRBR1的图谱。

图6：野生型与RNAi-T₀代小穗的育性表型图；A：野生型的雄性可育与RNAi-T₀代的雄性不育的表型图（去除内、外稃片）；B：野生型的高结实率与RNAi-T₀代无结实的表型图。

具体实施方式

实施例1：水稻PIS1基因的图位克隆

1．水稻材料和定位群体：

如图1所示的水稻突变体pis1为本发明者利用辐射诱变的方法获得，原始野生型亲本为籼型水稻品种明恢86。将突变杂合体与野生型品种DZ60进行杂交，F₁代自交，得到F2群体，在水稻抽穗期依据pis1突变表型选出1148个植株作为定位群体。

2．利用水稻微卫星标记（RM或SSR）和InDel标记定位PIS1基因：

采用水稻微量法快速提取水稻的总DNA。取大约0.3克水稻叶片，放入1.5ml离心管中经液氮冷冻后快速提取DNA，获得的DNA溶于100 ul超纯水中。利用DNA池的定位方法，初步定位PIS1基因。根据公布的水稻微卫星遗传图谱，均匀选取分布于各条染色体上的微卫星引物进行PCR扩增，于6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离和硝酸银染色，检测PCR产物的多态性。然后选取F2群体中的208个突变体进行连锁分析，将PIS1基因初步定位在水稻第8染色体长臂上的RM256和RM447两个标记之间。

在精细定位PIS1基因时，对F2群体中的1148个突变体个体进行微卫星标记和InDel标记的连锁分析。根据分子标记RM256和RM447之间的BAC序列分析，利用已公布的水稻基因组序列，设计了28对SSR引物和15对InDel引物用于精细定位PIS1基因，其中有4对SSR引物和4对InDel引物（引物序列见表1）在两个亲本间有多态。用这8对有多态的标记对F2群体中的1148个突变体个体进行了连锁分析。精细定位的结果如图2所示。

表1 用于精细定位PIS1基因的引物序列

3．基因预测与比较分析

根据精细定位的结果，PIS1基因位于BAC克隆AP004592上的ID4和ID5之间约32kb的范围内。根据TIGR（http://rice.plantbiology. msu.edu/）网站上提供的基因注释信息，PIS1基因所在的32kb区间内共有5个基因，分别编码 mtN9蛋白、RBR蛋白、PPR蛋白、锌指基因蛋白和一个未知蛋白。基因组序列分析结果表明，该区域内的一个OsRBR1基因发生了单碱基（TGG→TAG）突变，导致转录提前终止。而其余4个基因的基因组序列在突变体和野生型中完全一致。因此，将OsRBR1基因作为PIS1的候选基因。候选基因分析与确定的结果如图2所示。

实施例2 互补实验

1. 构建互补实验载体。根据籼稻明恢86基因的序列，利用增加了酶切位点的pCAMBIA1300 载体构建了如图3所示的侯选基因的互补实验载体。载体构建的具体过程是：在候选的OsRBR1基因区和启动子区设计一对带有酶切位点的引物，利用高保真酶进行高保真PCR扩增并测序，挑选序列完全正确的克隆，经酶切和连接，构建成如图3所示的载体，再将其转入农杆菌中。该互补载体的DNA序列为8547bp，包括起始密码前2000bp和终止密码后1000bp片段。扩增互补实验的DNA序列所用引物是 (下划线为酶切位点)：上游引物：CAGTG CTCTTCatagcagataaccccaatcaagtccat gag ctgtgatcc；下游引物：CAGTGCTCTTCagacatcaaaatccacata cacac tattaaaatgtacat。

2. 互补实验：

由于突变体不育，无法收获种子。因此，突变基因只能由杂合体种子保存，其自交后代会分离出突变体。互补试验所用种子是以突变杂合体植株上收获的种子，采用单粒诱导胚性愈伤组织，以保证每一粒种子形成的愈伤互不混杂。由于pis1的表型由单碱基突变引起，故采用测序鉴定的方法，从中挑选出基因型为pis12的纯合突变型愈伤组织，用于转化实验。

利用愈伤侵染法技术，转化pis1突变体的愈伤组织。挑选生长迅速、颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株浸染水稻愈伤，置25℃条件下暗培养3 天；经30 mg/LHygromycin的筛选培养基培养2次，每次15天；经50 mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养7天；将经3次筛选获得的抗性愈伤转入分化培养基，于光照条件下进行分化培养；于幼苗长至2-3cm时，转至1/2MS培养基进行生根培养。对获得的17个再生植株进行鉴定和连续的观察，显示转基因水稻植株生长发育状况如图4所示，所有转基因植株的花器官发育正常，与野生型比较没有明显区别，说明该侯选的OsRBR1基因就是PIS1基因。

实施例3 抑制水稻内源PIS1（OsRBR1）的表达培育新型水稻雄性不育种质

根据籼稻明恢86中OsRBR1基因的序列，利用pTCK303载体构建抑制内源OsRBR1基因表达的载体。载体构建的具体过程是：首先提取野生型水稻叶片总RNA，然后反转录成cDNA，以cDNA为模板PCR扩增出OsRBR1的cDNA序列；PCR产物经回收、纯化后连接到pGEMT-easy载体上；经测序确认完全正确后，同时用BamH1和Sac1双酶切pGEMT-easy载体及pTCK303载体，酶切产物分别回收后，利用T4 DNA 连接酶进行连接，将OsRBR1的cDNA反向连接到pTCK303载体Ubiquitin启动子的下游，构建成如图5所示的RNAi表达载体pTCK303-OsRBR1，再将其转入农杆菌中。扩增OsRBR1的cDNA所用引物序列为（下划线分别为酶切位点Sac1和BamH1）: 上游引物：5'-CGAGCTC ccatacatcagaagatgagttgag -3',下游引物：5'-CGGGATCCTGAAGGAAGGGG AGAGATTGAGCT -3。

利用愈伤侵染法技术将构建好的RNAi载体转化水稻品种中花种子诱导的愈伤组织中，获得转反义RNA的转基因植株（转化方法同实施例2的第二部分）。以转化pTCK303空载体分化出的植株作对照，共获得17个如图6所示的转化株系。这些转基因植株的营养生长正常，但花器官的雄蕊发育异常、无花粉而导致完全不结实。因此，可以利用遗传工程的方法，通过控制水稻内源PIS1的表达，可培育出水稻新型雄性不育的种质。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对与本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种控制水稻小穗发育基因PIS1的应用

<130> 22

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3036

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagggtg ccgcgccgcc agcgagctcc gggtcggagg tgacgggtgc gggctcgggg 60

aaggtggacg ctggcggcgg cgccgccatg gaggagcggt tcgccgatct gtgcaagagc 120

aagcttgggc tggacgagag cataacgagg caggcaatgc agctgttcaa ggagagcaag 180

agcatcctcc tatccagcat gtcatccttg ggcagtggat cgcctgagga gatcgagagg 240

ttctggtctg cttttgttct ttactgtgtg tcaaggcttg gcaaagcagg caaagggaag 300

gaagatggtg gcatctcact gtgccagata ttgagggcat ttagtctgaa catcgtcgat 360

ttcttcaagg agatgccaca gttctgcata aaggttgggt ctgttctggc tggtctatat 420

ggttcagatt gggagaagag gcttgagttg aaggaactgc aagcgaatgt cgtccattta 480

agcctgctaa gcaggtacta caagcgtgcc taccaggagc tgttcctatt aaatgatgcc 540

aagccaccag aaaattctgc agaaccaaat gcacaagcct ctgactatta tcgctttgga 600

tggttacttt tcttggtgtt aagaatccaa acattcagcc gatttaagga tcttgttaca 660

tccacaaatg gactagtttc tgtgttggcc gtacttattg ttcacattcc tgtgcggcta 720

aggaatttca atatcaaaga gtcttctagt tttgccaaga agtcagacaa gggagtaaat 780

cttattgctt ccctatgtga aaaataccat acatcagaag atgagttgag taaagcaatc 840

gagaagacaa atactctcat agtggatatt ctgaagaaga aaccatgtcc agctgcttca 900

gaatgtcagc aggataggtt gtcttttatt gatccagagg gcttgacata ttttaagaat 960

ttgctcgagg aagactcatt gaaattaagt ttgctaatgc tggaaaagga atatgagaat 1020

gcaattaaca ccaagggaga attagatgag cgcatgttcg caaacgatga ggacagcttg 1080

cttggcagtg gaagtctgtc aggaggtgcc atcaatttac caggcacaaa gagaaagtac 1140

gatgttatgg cctcacctgc aaaatcaata acaagtccaa gtccgatgtc tcctccacgg 1200

ttttgtgcat cccctactgg aaatggctac tgcagctcaa aaatggctcc tatcacccca 1260

gtgagcacag ccatgacaac agccaagtgg cttcggagca caatctctcc ccttccttca 1320

aaaccttccg gggagttact gcgcttcttc tcagcttgtg ataaggatgt gacagatgac 1380

attacacgca gagctggtat tatacttgga gccatattca caagcagttc tttcggcgaa 1440

cgtatatgta ccagcgtgcg aagcacaaac aggattgatg ctatctggac agagcaaaga 1500

aaaatggaag cacttaagct atattacagg gttctggaat caatgtgcag agcagagact 1560

cagatcttga gtgggaacaa tcttacatcg cttctgtcta atgagcgatt ccatcggtgt 1620

atgattgctt gttctgctga gttagtgctg gccactcaca agacagtcac aatgatgttc 1680

ccagctgtgt tagagaaaac tggcataaca gcttttgact tgagcaaagt catagagagt 1740

tttgttaggc atgaggatac acttccacga gagctgaaac gtcatttgaa ttcacttgag 1800

gaacggctcc tggaaagcat ggcatgggag aaaggctcat caatgtacaa ttctctgatt 1860

gttgccaggc caacactatc tgcagaaata aacaggctag gtttattggc tgaaccaatg 1920

ccatcacttg atgccattgc ggcgcaccat aacatttcac tcgaggggct gccacctctt 1980

ccctttcaaa agcaagaaca ttcaccagac aaggatgaag ttagatctcc caaaagagca 2040

tgcactgaaa ggaggaatgt gctggtggac aacaattcat ttagatcacc agtcaaggat 2100

accctcaaat caaagttgcc tcctctccaa tcagcatttt taagtccaac aagacctaat 2160

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gcaaagcttg cagctattag aatcagaggt ctttgtgaaa ggctgcaact ttctcagcaa 2280

gtcttggagc gagtgtactc ccttgtgcaa caaatcatta tccaacaaac tgctctattt 2340

ttcaatcggc acatcgatca gattatacta tgcagcatat atggagttgc taagatatct 2400

caattggcac tgacattcaa ggaaattatt ttcggctaca gaaaacaatc tcagtgcaag 2460

ccacaagttt tccgtagtgt ttatgttcat tgggcatcac gaagccgcaa tgggaaaaca 2520

ggggaggacc atgttgacat tatcactttc tacaacgaag tatttattcc tactgtgaaa 2580

cctttgctgg ttgagctagg gtctggtact agtccaaaca agaagaatga ggaaaaatgt 2640

gctgctgatg caggtccata tccagaatct cctcggctat ctcggtttcc aaaccttcct 2700

gacatgtctc ccaagaaagt ttctgctgct cataacgtat atgtttcacc cttgcgcaca 2760

tcaaagatgg atactttgct ttccccaagc tccaagagct attacgcctg tgtaggggag 2820

agtactcatg catttcagag cccctccaag gaccttaagg ttataaacaa ccgcctaaac 2880

agtgggaaga aagtcagtgg aagactgaac tttgatgttg tcagtgattt ggttgttgcc 2940

agaagtctca gcgatcaaaa tagcgcatca gcagcagcaa caacagcaga tatcgccaca 3000

aaaacaccag tgaaattgga gcagccagac tgctag 3036

<210> 2

<211> 1011

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Gly Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ser Gly Ser Glu Val Thr Gly

1 5 10 15

Ala Gly Ser Gly Lys Val Asp Ala Gly Gly Gly Ala Ala Met Glu Glu

20 25 30

Arg Phe Ala Asp Leu Cys Lys Ser Lys Leu Gly Leu Asp Glu Ser Ile

35 40 45

Thr Arg Gln Ala Met Gln Leu Phe Lys Glu Ser Lys Ser Ile Leu Leu

50 55 60

Ser Ser Met Ser Ser Leu Gly Ser Gly Ser Pro Glu Glu Ile Glu Arg

65 70 75 80

Phe Trp Ser Ala Phe Val Leu Tyr Cys Val Ser Arg Leu Gly Lys Ala

85 90 95

Gly Lys Gly Lys Glu Asp Gly Gly Ile Ser Leu Cys Gln Ile Leu Arg

100 105 110

Ala Phe Ser Leu Asn Ile Val Asp Phe Phe Lys Glu Met Pro Gln Phe

115 120 125

Cys Ile Lys Val Gly Ser Val Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Ser Asp Trp

130 135 140

Glu Lys Arg Leu Glu Leu Lys Glu Leu Gln Ala Asn Val Val His Leu

145 150 155 160

Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Tyr Lys Arg Ala Tyr Gln Glu Leu Phe Leu

165 170 175

Leu Asn Asp Ala Lys Pro Pro Glu Asn Ser Ala Glu Pro Asn Ala Gln

180 185 190

Ala Ser Asp Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp Leu Leu Phe Leu Val Leu Arg

195 200 205

Ile Gln Thr Phe Ser Arg Phe Lys Asp Leu Val Thr Ser Thr Asn Gly

210 215 220

Leu Val Ser Val Leu Ala Val Leu Ile Val His Ile Pro Val Arg Leu

225 230 235 240

Arg Asn Phe Asn Ile Lys Glu Ser Ser Ser Phe Ala Lys Lys Ser Asp

245 250 255

Lys Gly Val Asn Leu Ile Ala Ser Leu Cys Glu Lys Tyr His Thr Ser

260 265 270

Glu Asp Glu Leu Ser Lys Ala Ile Glu Lys Thr Asn Thr Leu Ile Val

275 280 285

Asp Ile Leu Lys Lys Lys Pro Cys Pro Ala Ala Ser Glu Cys Gln Gln

290 295 300

Asp Arg Leu Ser Phe Ile Asp Pro Glu Gly Leu Thr Tyr Phe Lys Asn

305 310 315 320

Leu Leu Glu Glu Asp Ser Leu Lys Leu Ser Leu Leu Met Leu Glu Lys

325 330 335

Glu Tyr Glu Asn Ala Ile Asn Thr Lys Gly Glu Leu Asp Glu Arg Met

340 345 350

Phe Ala Asn Asp Glu Asp Ser Leu Leu Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly

355 360 365

Gly Ala Ile Asn Leu Pro Gly Thr Lys Arg Lys Tyr Asp Val Met Ala

370 375 380

Ser Pro Ala Lys Ser Ile Thr Ser Pro Ser Pro Met Ser Pro Pro Arg

385 390 395 400

Phe Cys Ala Ser Pro Thr Gly Asn Gly Tyr Cys Ser Ser Lys Met Ala

405 410 415

Pro Ile Thr Pro Val Ser Thr Ala Met Thr Thr Ala Lys Trp Leu Arg

420 425 430

Ser Thr Ile Ser Pro Leu Pro Ser Lys Pro Ser Gly Glu Leu Leu Arg

435 440 445

Phe Phe Ser Ala Cys Asp Lys Asp Val Thr Asp Asp Ile Thr Arg Arg

450 455 460

Ala Gly Ile Ile Leu Gly Ala Ile Phe Thr Ser Ser Ser Phe Gly Glu

465 470 475 480

Arg Ile Cys Thr Ser Val Arg Ser Thr Asn Arg Ile Asp Ala Ile Trp

485 490 495

Thr Glu Gln Arg Lys Met Glu Ala Leu Lys Leu Tyr Tyr Arg Val Leu

500 505 510

Glu Ser Met Cys Arg Ala Glu Thr Gln Ile Leu Ser Gly Asn Asn Leu

515 520 525

Thr Ser Leu Leu Ser Asn Glu Arg Phe His Arg Cys Met Ile Ala Cys

530 535 540

Ser Ala Glu Leu Val Leu Ala Thr His Lys Thr Val Thr Met Met Phe

545 550 555 560

Pro Ala Val Leu Glu Lys Thr Gly Ile Thr Ala Phe Asp Leu Ser Lys

565 570 575

Val Ile Glu Ser Phe Val Arg His Glu Asp Thr Leu Pro Arg Glu Leu

580 585 590

Lys Arg His Leu Asn Ser Leu Glu Glu Arg Leu Leu Glu Ser Met Ala

595 600 605

Trp Glu Lys Gly Ser Ser Met Tyr Asn Ser Leu Ile Val Ala Arg Pro

610 615 620

Thr Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Leu Gly Leu Leu Ala Glu Pro Met

625 630 635 640

Pro Ser Leu Asp Ala Ile Ala Ala His His Asn Ile Ser Leu Glu Gly

645 650 655

Leu Pro Pro Leu Pro Phe Gln Lys Gln Glu His Ser Pro Asp Lys Asp

660 665 670

Glu Val Arg Ser Pro Lys Arg Ala Cys Thr Glu Arg Arg Asn Val Leu

675 680 685

Val Asp Asn Asn Ser Phe Arg Ser Pro Val Lys Asp Thr Leu Lys Ser

690 695 700

Lys Leu Pro Pro Leu Gln Ser Ala Phe Leu Ser Pro Thr Arg Pro Asn

705 710 715 720

Pro Ala Ala Gly Gly Glu Leu Cys Ala Glu Thr Gly Ile Gly Val Phe

725 730 735

Leu Ser Lys Ile Ala Lys Leu Ala Ala Ile Arg Ile Arg Gly Leu Cys

740 745 750

Glu Arg Leu Gln Leu Ser Gln Gln Val Leu Glu Arg Val Tyr Ser Leu

755 760 765

Val Gln Gln Ile Ile Ile Gln Gln Thr Ala Leu Phe Phe Asn Arg His

770 775 780

Ile Asp Gln Ile Ile Leu Cys Ser Ile Tyr Gly Val Ala Lys Ile Ser

785 790 795 800

Gln Leu Ala Leu Thr Phe Lys Glu Ile Ile Phe Gly Tyr Arg Lys Gln

805 810 815

Ser Gln Cys Lys Pro Gln Val Phe Arg Ser Val Tyr Val His Trp Ala

820 825 830

Ser Arg Ser Arg Asn Gly Lys Thr Gly Glu Asp His Val Asp Ile Ile

835 840 845

Thr Phe Tyr Asn Glu Val Phe Ile Pro Thr Val Lys Pro Leu Leu Val

850 855 860

Glu Leu Gly Ser Gly Thr Ser Pro Asn Lys Lys Asn Glu Glu Lys Cys

865 870 875 880

Ala Ala Asp Ala Gly Pro Tyr Pro Glu Ser Pro Arg Leu Ser Arg Phe

885 890 895

Pro Asn Leu Pro Asp Met Ser Pro Lys Lys Val Ser Ala Ala His Asn

900 905 910

Val Tyr Val Ser Pro Leu Arg Thr Ser Lys Met Asp Thr Leu Leu Ser

915 920 925

Pro Ser Ser Lys Ser Tyr Tyr Ala Cys Val Gly Glu Ser Thr His Ala

930 935 940

Phe Gln Ser Pro Ser Lys Asp Leu Lys Val Ile Asn Asn Arg Leu Asn

945 950 955 960

Ser Gly Lys Lys Val Ser Gly Arg Leu Asn Phe Asp Val Val Ser Asp

965 970 975

Leu Val Val Ala Arg Ser Leu Ser Asp Gln Asn Ser Ala Ser Ala Ala

980 985 990

Ala Thr Thr Ala Asp Ile Ala Thr Lys Thr Pro Val Lys Leu Glu Gln

995 1000 1005

Pro Asp Cys

1010

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acttcatccg tttcacaatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaacag tggttgacga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctgatgtga tgagttctgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaagctagt gttggaattg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgcctgttg actgttgaa 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcatatatt tttagcct 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcggcaccta cggcgccct 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catccctaac ccgagaagac 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attcttcttt ctgccgcttg c 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccactttgcc ccattgaa 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acaagtcacc aacgaatctc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

actgaatgag caaaacgagt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtctcacac aacgacctct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtccgaacac agctaaccta 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaatgggtcg tattgggct 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggggtgact cagtttgatt 20

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cagtgctctt catagcagat aaccccaatc aagtccatga gctgtgatcc 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cagtgctctt cagacatcaa aatccacata cacactatta aaatgtacat 50

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgagctccca tacatcagaa gatgagttga g 31

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgggatcctg aaggaagggg agagattgag ct 32

Claims (1)

1.PIS1基因在控制水稻雄蕊发育中的应用，所述PIS1基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示，所述PIS1基因编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示。

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