CN110423269B

CN110423269B - 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用

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Publication number: CN110423269B
Application number: CN201910610744.8A
Authority: CN
Inventors: 陈金顶; 吴珂珂; 罗朝唯; 易琳; 赵明秋; 丁红星
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-07-08
Also published as: CN110423269A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用。该串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码上述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明进一步构建了含有上述核苷酸序列的双启动子转移载体，并转化大肠杆菌，获得重组杆状病毒质粒；然后转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒，其重组蛋白表达量达914μg/ml，能够与阳性血清发生特异性结合，具有良好的免疫学反应性。本发明提供的亚单位疫苗，免疫小鼠后能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫应答；免疫仔猪后可诱导机体产生特异性免疫反应，能为攻毒仔猪提供良好的免疫保护作用。

Description

一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PCV2主要侵害机体的免疫***，造成严重的免疫抑制，从而容易发生其他致病性微生物的继发或混合感染，严重危害猪群健康。自2006年猪圆环病毒2型疫苗问世以来，疫苗的免疫接种成为防治猪圆环病毒病的主要手段。PCV2 ORF2编码的Cap蛋白是病毒主要的结构蛋白并且具有型特异性表位，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶向物。目前四种商品化疫苗已在世界范围内广泛使用，其中两种都是以PCV2 Cap蛋白作为免疫原，实验和现场研究已经清晰地表明PCV2疫苗具有降低病毒血症、消除PCVAD、增加生长性能等方面的功效，但是在免疫接种的猪群中仍然会发生PCVAD，这意味着现有商品化疫苗的免疫接种无法完全阻止PCV2感染或传播；此外，还有全病毒培养获得的病毒滴度低、灭活不彻底导致毒力返强、价格昂贵和保护率差等可能性。因此，开发新的安全有效的亚单位疫苗对控制PCV2感染是十分必要的。

近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，能够很好的弥补传统的原核表达***表达的蛋白以包涵体形式存在，导致产物纯化困难，且原核表达***翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等不足。为寻找一种能增强Cap蛋白免疫原性的方法，本发明利用更容易获得具有正确结构和修饰活性的蛋白的杆状病毒表达载体表达串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，与新型佐剂混合制备的亚单位疫苗，以期提高Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效果。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列，该序列经过人工修饰，可提高重组蛋白在杆状病毒***中的表达量和免疫原性。

本发明的第三个目的是提供一种重组杆状病毒转移载体，该载体为双启动子转移载体，含有上述编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列。

本发明的第四个目的在于提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒能够分泌表达串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

本发明的第五个目的在于提供一种PCV2亚单位疫苗。

本发明的第六个目的在于提供上述串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

编码上述串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

一种重组杆状病毒转移载体，包含上述编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列；

所述重组杆状病毒转移载体的出发载体优选为pFastBac^TM Dual载体；

所述重组杆状病毒转移载体为杆状病毒转移载体pFBD-TBCap-2，即分别在P10、PH启动子下克隆上述编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列；

一种重组杆状病毒，由上述重组杆状病毒转移载体转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒；最后利用阳离子脂质体cellfectin II将重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞后，收集上清得到；

所述的昆虫细胞优选为sf9细胞或High-five细胞；

一种PCV2亚单位疫苗，将上述重组杆状病毒接种昆虫细胞，扩大培养后，收集目的蛋白，将目的蛋白与免疫佐剂混合得到；

所述的PCV2亚单位疫苗的制备方法，优选包含如下步骤：

将上述重组杆状病毒接种悬浮培养的High-Five昆虫细胞，感染后收集培养物，离心去除培养上清；超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，收集超声上清；将超声上清中目的蛋白与免疫佐剂乳化或混合制得；

所述的重组杆状病毒的感染剂量优选为MOI＝1；

所述的感染时间优选为96h；

所述的免疫佐剂优选为ISA 201VG佐剂和Montanide^TM GEL 01佐剂中的至少一种；

所述的免疫佐剂进一步优选为Montanide^TM GEL 01佐剂；

所述的PCV2亚单位疫苗中目的蛋白的浓度优选为200～500μg/ml；

所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备PCV2疫苗中的应用；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明根据杆状病毒密码子的偏爱性，人工设计合成了含多个优势抗原表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，该序列提高了目的基因在杆状病毒中表达水平和免疫原性。

(2)本发明构建了含有上述编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列的双启动子重组杆状病毒转移载体，该重组转移载体与单启动子重组杆状病毒转移载体相比，蛋白表达量更高。

(3)本发明提供的重组杆状病毒能够分泌表达串联多个优势抗原表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，能够与阳性血清发生特异性结合，具有良好的反应原性，且经过表达条件优化的重组蛋白TBCap表达量高达914μg/ml，应用于实际生产中可以很大程度上降低生产成本。

(4)本发明的重组杆状病毒所表达得串联优势抗原表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白制备的亚单位疫苗，免疫小鼠后，能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫应答；免疫仔猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，能为攻毒仔猪提供良好的免疫保护作用。本发明提供的亚单位疫苗可作为治疗PCV2感染的有效、安全的PCV2亚单位疫苗候选。

附图说明

图1是重组杆粒PCR鉴定原理图。

图2是重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-1和pFBD-Cap-2的质粒图谱图。

图3是重组杆状病毒转移载体pFBD-TBCap-1和pFBD-TBCap-2的质粒图谱图。

图4是正常Sf9与转染后出现CPE的Sf9细胞的显微镜图；其中，A：正常Sf9细胞，B：转染后出现CPE的Sf9细胞。

图5是感染重组杆状病毒Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2的细胞样品的Western-blot鉴定结果图；其中，A：P1代重组杆状病毒蛋白，B：P2代重组杆状病毒蛋白，C：P3代重组杆状病毒蛋白。

图6是重组杆状病毒收获时间对重组蛋白表达影响的Western-blot结果图；其中，A为收获时间为72h，A中，1～4：Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-2(MOI＝1)，5～8：Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-1(MOI＝2)，9～12：Ac-Cap-1Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-2(MOI＝4)；B为收获时间为96h，B中，11～14：Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-2(MOI＝1)，15～18：Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-1(MOI＝2)，19～22：Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1、Ac-TBCap-2(MOI＝4)。

图7是不同培养基和不同昆虫细胞对重组蛋白表达影响的Western-blot结果图；其中，A：SF900和SIM SF培养基培养sf9细胞后重组蛋白表达量；B：不同昆虫细胞重组蛋白表达量，1：表达重组Cap-2蛋白的sf9细胞样品，2：表达重组Cap-2蛋白的High-five细胞超声前样品，3：表达重组TBCap-2蛋白的sf9细胞样品，4：表达重组TBCap-2蛋白的High-five细胞样品。

图8是重组杆状病毒感染剂量、收获时间对重组蛋白表达影响的Western-blot结果图；其中，1：48h，MOI＝1；2：48h，MOI＝2；3：48h，MOI＝4；4：72h，MOI＝1；5：72h，MOI＝2；6：72h，MOI＝4；7：96h，MOI＝1；8：96h，MOI＝2；9：96h，MOI＝4。

图9是重组Cap蛋白和重组TBCap蛋白的可溶性分析结果图；其中，A：重组Cap蛋白，A中，1：未感染的High-five细胞；2：感染Ac-Cap-2的High-five细胞样品；3：感染Ac-Cap-2的High-five超声上清样；B：TBCap蛋白，B中1：未感染的High-five细胞；2：感染Ac-TBCap-2的High-five细胞样品；3：感染Ac-TBCap-2的High-five超声上清样品。

图10是重组Cap蛋白和重组TBCap蛋白分泌表达时相结果分析图；其中，A：重组Cap蛋白，A中，1～5：分别为重组杆状病毒感染High-five细胞后24、48、72、84、96h收获细胞培养上清样品；B：TBCap蛋白，B中，1～5：分别为重组杆状病毒感染High-five细胞后24、48、72、84、96h收获细胞培养上清样品。

图11是小鼠免疫后ELISA抗体检测结果分析图。

图12是攻毒后仔猪体温的测定结果分析图；其中，CC：攻毒对照组，NC：空白组。

图13是仔猪免疫后ELISA抗体检测(S/P)结果分析图。

图14是Real-time PCR标准曲线图。

图15是攻毒后各组仔猪血清病毒载量结果分析图。

图16是攻毒后各组仔猪***病毒载量结果分析图。

图17是攻毒组组织显微病变结果分析图；其中，A：攻毒组肺脏HE染色(40×)，B：攻毒组肺脏HE染色(100×)，C：攻毒组***显微病变HE染色(100×)，D：攻毒组***显微病变HE染色(400×)。

图18是免疫组化检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例中，表达载体pFastBac^TM Dual)、大肠杆菌感受态细胞DH10Bac、DH5a、野生型病毒AcNPV均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存，均可市购；猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗(Ingelvac CircoFLEX)为勃林格殷格翰公司产品；猪PCV2阳性血清由广东农业科学院兽医研究所惠赠。

实施例1重组杆状病毒转移载体的构建

(1)重组蛋白的基因序列设计及合成

以GenBank中收录的PCV2 LG株全基因序列(HM038034.1)为模板，于PCV2 cap蛋白上引入Cap/Rep线性抗原表位，具体方法如下：应用DNAStar生物软件对抗原表位进行序列分析，筛选出抗原性好且特异性高的肽段即Rep蛋白上第81-100、201-220位以及Cap蛋白上第61-85、113-131、169-180、192-202位性抗原表位，并确定优势抗原表位间的串联顺序，并引入蜂毒信号肽序列(honeybee melittin signal peptide，HBM)以期实现分泌型表达，于终止密码子前设计编码6个组氨酸的碱基序列，最终设计出重组蛋白PCV2-TBCap的核苷酸序列，对其核苷酸序列进行针对昆虫细胞的密码子优化后，送至上海生工生物工程有限公司合成。PCV2-Cap蛋白和重组蛋白PCV2-TBCap的核苷酸序列如下所示：

PCV2-Cap蛋白的核苷酸序列：

其中，灰色突出部分为蜂毒信号肽，划线部分为Cap基因序列，灰色突出+斜体部分为6×His；

PCV2-Cap蛋白的氨基酸序列：

MKFLVNVALVFMVVYISYIYATYPRRRFRRRRHRPRSHLGLILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSCTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGTNEISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTRATALTYGPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDHVGLGIAFENSTYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKPHHHHHH.

PCV2-TBCap的核苷酸序列：

其中，灰色突出部分为蜂毒信号肽，加粗部分为T细胞表位，灰色突出+波浪线部分为B细胞表位，下划线部分为Cap基因序列，灰色突出+斜体部分为6×His；

PCV2-TBCap的氨基酸序列如下所示：

MKFLVNVALVFMVVYISYIYACHIEKAKGTDQQNKEYCSKEGGKWWDGYHGEEVVVIDDFYGWGGTVRTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGGGQGDRGVGSTAVILDDNFVTGGSTIDYFQPNNKRGGNVDHVGLGIAFGGTYPRRRFRRRRHRPRSHLGLILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSCTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGTNEISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTRATALTYGPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDHVGLGIAFENSTYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKPHHHHHH.

(2)重组杆状病毒转移载体的构建

①根据上述PCV2-Cap蛋白和重组蛋白PCV2-TBCap的核苷酸序列应用Primer5.0软件分别设计引物(见表1)，其中Cap-p10-F/R和Cap-pH-F/R用于扩增不含多抗原表位的Cap基因序列，TBCap-p10-F/R和TBCap-pH-F/R用于扩增重组TBCap，上游引物5’端引入BamH I或Xho I酶切位点，下游引物5’端引入Sac I或Nhe I酶切位点。以合成的PCV2-Cap蛋白和重组蛋白PCV2-TBCap的核苷酸序列为模板，分别用上述引物扩增重组Cap和重组TBCap片段。PCR体系如下：5×PrimeSTAR Buffer 10.0μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，DNA模板1.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，dNTP Mixture 4.0μL，双蒸水32.5μL；PCR反应条件为：98℃3min；98℃15s，55℃15s，72℃5min，共30个循环；72℃10min。将扩增得到的目的片段进行琼脂糖核酸电泳，并对目的条带进行胶回收纯化。

②将步骤①回收的带有Xho I和Nhe I酶切位点的目的片段和pFastBac ^TM Dual载体分别用Xho I和Nhe I限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切体系如下：10×FastDigestBuffer 2.0μL，FastDigest Xho I 1.0μL，FastDigest Nhe I 1.0μL，PCR回收产物/载体10.0μL/2μL，双蒸水加至总体积20μL；37℃水浴双酶切30min，产物分别胶回收纯化。将双酶切后的目的片段和pFastBac^TM Dual载体进行连接，并将连接产物转化DH5α感受态细胞，以LB(AMP)固体培养基筛选。挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，上下游鉴定引物为pFBD2-F/R，并扩增阳性克隆，按Omga质粒提取试剂盒说明步骤提取质粒，并酶切鉴定。最终分别获得重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-1、pFBD-TBCap-1。

③将步骤①回收的带有BamH I和Sac I酶切位点的目的片段和重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-1、pFBD-TBCap-1分别用BamH I和Sac I限制性核酸内切酶进行双酶切，胶回收后连接、转化、鉴定(鉴定引物为pFBD1-F/R和pFBD2-F/R，具体方法参见步骤②，鉴定原理见图1)，分别获得重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-2、pFBD-TBCap-2，于-20℃保存。

表1用于扩增不同基因的引物序列及检测引物

转移载体pFastBac Dual中包含pFBD-2F/R引物结合位点，位于p10启动子下多克隆位点的两侧，电泳结果显示：以pFBD-2F/R引物为扩增引物，重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-1和pFBD-Cap-2 PCR扩增产物长度以及重组杆状病毒转移载体pFBD-TBCap-1和pFBD-TBCap-2 PCR扩增产物长度与预期大小一致。

转移载体pFastBac Dual中包含pFBD1-F/R引物结合位点，位于多角体启动子(PH启动子)下多克隆位点的两侧，电泳结果显示：以pFBD-1F/R引物为扩增引物，重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-2和pFBD-TBCap-2 PCR扩增产物长度与预期相符。

实施例2重组杆状病毒的获得及重组蛋白表达条件优化

(1)重组杆状病毒质粒的获得

将鉴定成功的重组杆状病毒转移载体pFBD-Cap-1、pFBD-Cap-2、pFBD-TBCap-1、pFBD-TBCap-2分别转化至DH10Bac感受态并用移液枪轻轻吹打混匀，冰上静置25min；②将感受态细胞从冰浴中取出，迅速置于42℃水浴中热激45s，后取出于冰浴中孵育2min；③向EP管中加入900μL SOC培养基，于37℃细菌培养摇床200rpm振荡培养转座4h；④用SOC培养基对转化菌进行梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3)，分别吸取上述稀释梯度的转化菌100μL涂布于LB(Gen、Kan、Tet、IPTG、X-Gel，使用浓度按Bac-to-Bac Baculoviruse Expression System操作说明书)固体培养基上；⑤将平板置于37℃细菌培养箱中培养48h后观察菌落颜色，其中白色菌落即为目标菌落；⑥为了进一步纯化，挑取白色菌落后重新在LB(Gen、Kan、Tet、IPTG、X-Gel)固体培养基上进行划线，37℃细菌培养箱中培养48h；⑦挑取白色菌落，接种于5mL LB(Gen、Kan、Tet)液体培养基中，37℃200rpm培养24～36h；手提法提取重组杆粒，最终获得重组杆状病毒质粒rBac-Cap-1、rBac-TBCap-1、rBac-Cap-2、rBac-TBCap-2，检测杆粒浓度，4℃保存备用。

(2)重组杆状病毒质粒的鉴定

由于重组后的杆状病毒质粒分子量较大，不能使用常规的酶切鉴定检验外源基因片段是否***成功。由于外源基因***位点位于重组杆状病毒质粒的Tn7转座位点左右臂之间，所以使用M13-F和M13-R通用引物(M13F：CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG，M13R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG)对重组杆粒进行PCR鉴定，结果显示能够扩增出与预期大小一致的特异性条带，表明目的基因片段在大肠杆菌中已成功重组入杆状病毒基因组中。

(3)重组杆状病毒的获得

利用阳离子脂质体cellfectin II介导转染，将重组杆状病毒质粒rBac-Cap-1、rBac-TBCap-1、rBac-Cap-2、rBac-TBCap-2分别转染sf9单层细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)，于27℃培养箱中孵育3～5h；转染完成后，去除细胞孔中的上清，并补充2mLsf900III培养基，27℃培养箱中静置培养72h以上；

转染后，每隔24h对转染后细胞观察一次，当转染细胞开始出现了典型的细胞病变特征，如细胞停止增长、细胞边缘粗糙、胞内出现大量囊泡等特征(图4)时，表明可能成功拯救出重组杆状病毒。继续培养可观察到细胞开始大量脱壁并裂解破碎(约转染后4～6d)，收获细胞培养物，室温1000rpm离心5min，上清即为重组杆状病毒(P1代)，于收获的病毒液中加入终浓度为2％的FBS，-80℃保存备用。将重组杆粒分别转染后获得的重组杆状病毒分别命名为Ac-Cap-1、Ac-TBCap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-2。由于P1代重组杆状病毒的病毒滴度较低，需要对其进行传代及扩增，以增加病毒滴度，参照Bac-to-Bac BaculoviruseExpression System操作说明书，分别获得第二代重组杆状病毒(P2代)和第三代重组杆状病毒(P3代)。

(4)重组杆状病毒滴度测定

①标准质粒的构建

应用Primer 5软件，以杆状病毒(野生型病毒AcNPV)全基因组为模板，设计一对引物Ac-F/R用于实时荧光定量PCR，另设计一对引物AcMK107-F/R用于扩增荧光定量PCR标准质粒片段，并连接T载体。引物序列见表2。

表2荧光定量PCR及标准质粒构建引物序列

用手提质粒法抽提杆状病毒(野生型)总DNA，以杆状病毒总DNA为模板，AcMK107-F/R为引物，扩增目的序列，PCR体系为：DNA模板1μL，AcMK107-F 1μL，AcMK107-R 1μL，2×Taq PCR StarMix 10μL，双蒸水7μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃10min。扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化目的片段，连接到pMD18-T载体中，连接体系如下：pMD18-T Vector 1μL，目的片段1μL，Solution 1 5μL，双蒸水3μL；配好连接体系后16℃孵育30min，将连接产物转化DH5α感受态细胞，并以LB(AMP)固体培养基筛选。挑取阳性克隆接种于5mL LB(AMP)液体培养基，37℃恒温摇床200rpm振荡培养16h，按Omga质粒提取试剂盒说明步骤提取质粒，并以BamH I/Xba I对质粒进行双酶切鉴定。用微量紫外分光光度计测量所提质粒浓度，并按以下公式计算质粒拷贝数，质粒命名为pMD-Ac，于-20℃保存备用。

②绝对荧光定量PCR

根据测量的标准品质粒pMD-Ac的拷贝数，将标准品质粒倍比稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，以该系列浓度质粒为模板，每个浓度做3个重复，作为标准曲线；待测重组杆状病毒DNA做3个重复，荧光定量PCR反应体系为：2×T5Fast qPCR Mix 10μL，Ac-F0.8μL，Ac-R 0.8μL，标准质粒/重组杆状病毒DNA 2.0μL，双蒸水6.4μL；反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，共35个循环。60℃采集荧光信号；

根据荧光定量PCR结果绘制标准曲线，计算重组病毒DNA拷贝数，并按以下公式计算病毒滴度：

重组杆状病毒Ac-Cap-1、Ac-TBCap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-2经连续两代扩增，获得P3代病毒各50ml。利用步骤①构建的标准质粒pMD-Ac，通过绝对荧光定量PCR测定重组杆状病毒的滴度，结果显示重组杆状病毒Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2拷贝数分别为6.4×10⁷copies/μL、1.5×108copies/μL、5.7×10⁷copies/μL和1.1×10⁸copies/μL，计算病毒滴度分别为1.2×10⁹PFU/mL、2.8×10⁹PFU/mL、1.1×10⁹PFU/mL和2.1×10⁹PFU/mL。

(5)Western-blot检测重组蛋白表达

①按照SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒说明书配制SDS-PAGE凝胶。分别将P1、P2、P3代重组病毒Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2感染后的sf9细胞样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，转印PVDF膜后进行Western blot鉴定，检测表达的Cap和TBCap蛋白对PCV2阳性血清的反应性。

结果如图5所示，感染Ac-Cap-1和Ac-Cap-2重组病毒的细胞样品在28kDa处有特异性条带；Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2在44kDa处有特异性条带。以上条带均符合预期大小，而野生杆状病毒并无特异性条带，证明重组病毒构建成功且能正确表达目的蛋白。

②将P3代重组杆状病毒Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2以相同MOI值感染对数期生长的sf9细胞，具体方法同步骤①。

相同收获时间的蛋白表达量对比发现，双启动的rBac-Cap-2、rBac-TBCap-2获得的重组杆状病毒均比单启动子的rBac Cap-1、rBac-TBCap-1获得的重组杆状病毒感染细胞样品表达量高，所以后续实验无特别说明均使用双启动子杆粒获得的重组杆状病毒Ac-Cap-2、Ac-TBCap-2。(图6)。

(6)重组蛋白表达条件优化

重组蛋白的半定量分析：以已知浓度的His标签蛋白为标准品蛋白，进行Westernblot半定量分析，测定重组蛋白浓度。将制备的细胞样品按照预定顺序加样，同时将系列浓度的标准His标签蛋白按顺序加样，后进行SDS-PAGE凝胶电泳，依次进行Western blot分析。曝光图片用ImageJ软件对每个目的条带进行灰度值分析，以标准蛋白条带为基础绘制灰度值-蛋白浓度线性函数，计算重组蛋白浓度。

①以SF900和SIM SF两种不同培养基培养sf9细胞至对数生长期，重组杆状病毒Ac-Cap-2、Ac-TBCap-2以MOI＝1的感染剂量分别感染细胞，并以相同时间收获细胞样品，制备蛋白样品，按上述重组蛋白的半定量分析方法进行Western-blot定量检测，以标准品浓度为纵坐标，对应的灰度值为横坐标绘制标准蛋白曲线，计算得重组Cap-2蛋白浓度分别为333μg/mL(SF900)和115μg/mL(SIM SF)，重组TBcap-2蛋白浓度分别为424μg/mL(SF900)和66μg/mL(SIM SF)。(图7A)。可知培养基的选择对重组蛋白表达量有一定的影响，使用sf9细胞用于表达目的蛋白时，如不考虑培养基成本，可优先选择SF900培养基。

②重组杆状病毒Ac-Cap-2、Ac-TBCap-2以MOI＝1的感染剂量分别感染对数生长期的sf9(考虑到成本，此处sf9采用SIM SF培养)和High-five细胞(采用与SIM SF同等价位的培养基)，于96h收获细胞制备蛋白样品，并按上述重组蛋白的半定量分析方法进行Western-blot定量检测，以标准品浓度为纵坐标，对应的灰度值为横坐标绘制标准蛋白曲线，计算得重组Cap-2蛋白浓度分别为335μg/mL(sf9细胞)和709μg/mL(High-five细胞)，重组TBcap-2蛋白浓度分别为278μg/mL(sf9细胞)和914μg/mL(High-five细胞)(图7B)。可知使用High-five细胞表达蛋白量均远远高于sf9表达细胞量，故后续实验均使用High-five细胞以表达重组蛋白。

③将P3代重组杆状病毒Ac-Cap-1、Ac-Cap-2、Ac-TBCap-1和Ac-TBCap-2分别以1、2和4的MOI值接种对数期生长的High-five细胞，27℃恒温摇床140rpm振荡培养，分别于接种病毒后的第48h、72h、96h取100μl细胞培养物制备蛋白样品，进行Western blot检测，确定重组蛋白最优表达条件。

结果如图8所示，在细胞裂解液中，第48h后即可检测到Cap和TBCap重组蛋白的表达，细胞裂解液中重组蛋白表达量随时间增加；随着感染剂量的增加，各个时间点的细胞培养物的表达蛋白浓度无较明显差异。考虑到实际生产过程中的成本问题，本实验未尝试使用更高感染剂量。实际生产中建议使用MOI＝1的感染剂量，并于96h收获Cap和TBCap重组蛋白，表达量分别可达约709μg/mL和914μg/mL。

(7)重组蛋白的可溶性及分泌表达分析

按照上述探究的最优接毒剂量，将P3代重组杆状病毒Ac-Cap-2和Ac-TBCap-2分别接种于浓度为2×10⁶cells/mL的体积为10mL的悬浮High Five细胞中，于不同时间收获细胞培养上清，并制备蛋白样品；按照最优收获时间，将细胞悬浮培养液倒入50mL的离心管中，室温1000rpm离心10min，加入5mL的PBS将细胞沉淀重悬，放置于冰上进行超声波破碎，取80μL的超声波破碎样品，将其余的超声波破碎样品放置于4℃离心机中，11000rpm离心15min，收获上清，取出80μL的上清溶液。分别于80μL的超声波破碎样品和离心后的上清样品中加入20μL的5×SDS上样缓冲液，于恒温金属浴中100℃煮沸10min，将样品放于-20℃保存。将变性后的蛋白样品通过Western blot以His标记的鼠源抗体鉴定表达的重组蛋白的可溶性。

结果如图9所示，接种P3代重组杆状病毒Ac-Cap-2的High Five细胞经超声波破碎后的细胞碎片和上清中均能检测到重组蛋白Cap，大小约28kDa(图9A)；接种P3代重组杆状病毒Ac-TBCap-2的High Five细胞经超声波破碎后的细胞碎片和上清中均能检测到重组蛋白TBCap，大小约44kDa。结果表明：重组蛋白Cap和TBCap经超声波破碎离心处理后，部分蛋白均可溶于PBS中；同时表明，重组蛋白Cap和TBCap经超声破碎离心处理后仍具有良好的反应原性。

以1个MOI的P3代重组杆状病毒感染High-five细胞，感染后适当时间取少量细胞培养上清，经Western-blot检测目的蛋白表达情况，结果显示细胞感染后48h开始有重组TBCap蛋白分泌表达，在72h达到最大，以后无明显增加；细胞感染后96h才开始有重组Cap蛋白分泌表达，这种分泌表达差异可能与重组蛋白结构特性有关(图10)。

实施例3重组蛋白制备的亚单位疫苗的免疫效力实验

(1)PCV2亚单位疫苗的制备

将第3代重组杆状病毒液Ac-Cap-2和Ac-TBCap-2分别按照最佳接毒量接种于浓度为2×10⁶cells/mL的High Five悬浮细胞中，放置于27℃恒温摇床120rpm振荡培养细胞，分别按照最佳收获时间离心收集细胞沉淀，加入适量的PBS重悬细胞，放置于冰上，进行超声波破碎细胞，然后于4℃条件下11000rpm离心15min。收集上清，即为表达的免疫抗原液。

将重组蛋白的浓度调整到每毫升1000μg，将此浓度的重组蛋白Cap、TBCap分别和ISA201VG佐剂按照1：1的比例进行乳化，制备成每200μl含有100μg目的蛋白的PCV2亚单位疫苗用于免疫小鼠实验。将重组蛋白的浓度调整到每毫升625μg，将此浓度的重组蛋白Cap、TBCap分别和Montanide^TM GEL 01佐剂按照4：1的比例进行均匀混合，制备成每200μl含有100μg目的蛋白的PCV2亚单位疫苗用于免疫小鼠实验。

将重组蛋白的浓度调整到每毫升250μg重组蛋白，将此浓度的重组蛋白Cap、TBCap分别和Montanide^TM GEL 01佐剂按照4：1的比例进行均匀混合，制备成每毫升含有200μg目的蛋白的PCV2亚单位疫苗用于免疫猪实验。

(2)小鼠免疫实验

①小鼠分组及免疫

将30只4周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分成6组，每组5头，采用皮下多点注射相应疫苗，各组免疫时间、剂量和注射试剂见表1。

表1实验动物分组(小鼠)

组别	注射试剂	首免剂量	二免剂量(首免2周后)
				1	Cap+Montanide<sup>TM</sup> Gel 01佐剂	200μl/只	200μl/只
2	TBCap+Montanide<sup>TM</sup> Gel 01佐剂	200μl/只	200μl/只
				3	Cap+ISA 201VG佐剂	200μl/只	200μl/只
4	TBCap+ISA 201VG佐剂	200μl/只	200μl/只
				5	商品化猪圆环病毒2型亚单位疫苗	一头份	一头份
6	空白对照	200μl PBS/只	200μl PBS/只

免疫前、首免后第7、14天，二免后第7、14天对每组小鼠进行眼眶采血，每批血样分离血清于-80℃保存，用于ELISA抗体检测。同时观察免疫组小鼠存活情况，接种部位有无异常等以进行亚单位疫苗安全性检查。

②ELISA抗体检测

用猪圆环2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前生物股份有限公司)检测待检血清抗体水平。

结果见图11，免疫小鼠，并评价比较免疫保护效果。用间接ELISA测定PCV2特异性抗体，结果以血清稀释50倍时的OD值表示。结果表明，以不同佐剂混合制备的疫苗免疫组，在首免后14天的ELISA抗体均达到较高水平，以GEL 01佐剂混合的Cap和TBCap组在首免后14天的ELISA抗体已达到较高水平，在21天、28天仍保持在较高水平；而以201佐剂乳化制备的Cap和TBCap组在首免后28天ELISA抗体达到最高水平，可推测出水性佐剂GEL 01混合疫苗组能在免疫后较短时间内诱导较高水平的体液免疫应答，油性佐剂201乳化疫苗组在增强免疫后也能够诱导高水平的体液免疫应答，故后续免疫仔猪试验优先采用Montanide^TMGEL 01水性佐剂制备亚单位疫苗。此外，结果表明，两种重组蛋白制备的亚单位疫苗免疫小鼠后均能刺激小鼠产生特异性抗体，其中重组杆状病毒表达的TBCap蛋白在相同佐剂情况下较Cap蛋白具有更好的免疫原性。

③亚单位疫苗安全性检查一周内免疫组小鼠全部健活，接种部位无异常反应。

(3)仔猪免疫保护实验

①仔猪分组及免疫攻毒

将20头PCV2和PRRSV抗原、抗体检测均为阴性的猪，随机分为4组，每组5头，采用经肌肉注射途径注射相应的疫苗，各组免疫时间、剂量和注射试剂见表2。

表2实验动物分组(猪)

攻毒后每天上午测量所有仔猪的体温，并观察仔猪的临床表现。在一免后7、14、21、28天采血，分离血清用于ELISA抗体检测。攻毒后第28天将所有猪剖杀，采血、分离血清用于病毒血症检测，观察每头猪肺脏和***等脏器病变情况，取***、肺脏于4％多聚甲醛中固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。具体方法及结果如下：

②攻毒后仔猪临床表现及体温变化

在攻毒前，没有观察到任何实验组的临床病变。首次免疫4周后，对两个免疫组和攻毒对照组进行攻毒，每天测量体温，连续4周，统计结果见图12。在相同时间点，各个组的体温没有明显的差异，也没有出现发热的现象(大于40℃)。但是从临床表现来看，攻毒组有两头猪出现明显消瘦、震颤、被毛粗乱嗜睡和生长不良的现象。两个免疫组和空白对照组则表现基本正常，没有明显的临床症状。

③ELISA抗体检测

具体方法同小鼠实验，结果见图13，根据小鼠免疫试验的结果，确定以GEL01佐剂混合的TBCap和Cap分别免疫仔猪，并评价比较其免疫保护效果。用间接ELISA测定特异性抗体，结果以血清稀释40倍时的S/P值表示。结果显示，除阴性对照组外，两个免疫组都在初次免疫后第14天都呈血清阳性，表明两个免疫组均有不同程度的特异性抗体产生，其中TBCap组免疫组的抗体水平略高于Cap组；增强免疫2周后，两个免疫组的抗体水平逐渐升高，TBCap组免疫组的抗体水平显著高于Cap组。

④攻毒后仔猪病毒血症检测

利用不同稀释度的标准质粒pMD-Ac进行qPCR，得到如图14所示的标准曲线，攻毒28天后，提取仔猪血清DNA作为模板，用于qPCR测定其中病毒含量，得到了各个样品的Ct值，根据标准曲线即可算出对应的核酸拷贝数。结果显示两个免疫组的病毒含量要明显低于攻毒对照组的水平，其中TBCap组比Cap组更低。这表明免疫组在一定程度上均降低了***组织中的感染，且TBCap组效果更好(图15)。

⑤攻毒后仔猪病毒含量检测

利用不同稀释度的标准质粒pMD-Ac进行qPCR，得到了如图14所示的标准曲线。攻毒28天后，剖杀所有猪并提取腹股沟***DNA作为模板，用于测定其中病毒含量，得到了不同时间点各个样品的Ct值，根据标准曲线即可算出对应的核酸拷贝数。与病毒血症结果类似，所有实验组猪的***中都能检测到病毒的存在，但是两个免疫组要明显低于攻毒对照组的水平，这表明在一定程度上降低了***中的PCV2感染，但两组间差异不大。结果表明，在攻毒之后，虽然疫苗组不能完全抑制病毒血症的产生，但是在很大的程度上能够降低其强度(图16)。

⑥病理变化观察

试验结束后，剖杀所有猪，观察***和肺脏的病变情况。空白对照组和疫苗组的肺脏正常，攻毒对照组的肺脏出现间质增宽、出血和实变的现象。除了攻毒对照组的***出现水肿外，免疫组和空白组基本都正常。完成组织切片后，进行病理学观察，结果如图17所示。与免疫组相比，攻毒对照组出现了明显的间质性肺炎的症状，主要表现为肺泡壁增厚、间质增宽和肺泡缩小，炎性渗出物增多。免疫组则较为正常或者只有轻微的症状。攻毒对照组的所有猪严重的淋巴细胞耗竭、出血性***炎和红细胞增多，免疫组未发现组织病理学淋巴损伤，空白对照组***组织未见明显组织学病变。结果表明，本研究制备的亚单位疫苗能够减轻由PCV2感染导致的肺脏和***病变。

⑦免疫组化

釆用PCV2单克隆抗体对***组织进行IHC检测，检测结果见图18。攻毒组淋巴组织中存在较多的棕黄色细胞，而免疫组则没有显著特异性的着色细胞，表明TBCap和Cap能够在很大程度上减轻在PCV2在***中的增殖，从而对免疫仔猪提供保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用

<130> 1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白

<400> 1

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln

20 25 30

Gln Asn Lys Glu Tyr Cys Ser Lys Glu Gly Gly Lys Trp Trp Asp Gly

35 40 45

Tyr His Gly Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Gly

50 55 60

Gly Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn

65 70 75 80

Ile Asn Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Asp Arg

85 90 95

Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Gly

100 105 110

Gly Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Gly Gly Asn

115 120 125

Val Asp His Val Gly Leu Gly Ile Ala Phe Gly Gly Thr Tyr Pro Arg

130 135 140

Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg Ser His Leu Gly Leu

145 150 155 160

Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro Arg His Arg Tyr Arg

165 170 175

Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Cys Thr Phe

180 185 190

Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val

195 200 205

Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly

210 215 220

Thr Asn Glu Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val

225 230 235 240

Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly

245 250 255

Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Arg Ala

260 265 270

Thr Ala Leu Thr Tyr Gly Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr

275 280 285

Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro

290 295 300

Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn

305 310 315 320

Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Ala Asn Val Asp His Val Gly

325 330 335

Leu Gly Ile Ala Phe Glu Asn Ser Thr Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile

340 345 350

Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro

355 360 365

Pro Leu Lys Pro His His His His His His

370 375

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码上述串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列

<400> 2

atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60

gcgtgtcaca tcgaaaaggc taagggcacc gaccagcaga acaaggagta ctgtagcaag 120

gagggtggca agtggtggga cggttaccac ggtgaagaag tggttgtgat cgacgacttc 180

tacggctggg gtggcacagt gcgtactcct agctgggctg tggacatgat gcgtttcaac 240

atcaacgact tcgtccctcc tggtggtggc ggcggccagg gtgaccgtgg cgtgggcagc 300

actgctgtga tcctggacga caacttcgtg accggcggct ccactatcga ctacttccag 360

ccaaacaaca agcgtggtgg taacgtggac cacgtgggcc tcggcatcgc tttcggcggt 420

acatacccac gtcgtcgttt ccgtcgtcgc cgccaccgtc ctcgttccca cctgggtctc 480

atcctgcgtc gtcgcccctg gctggtgcac cctcgccacc gttaccgctg gcgccgcaag 540

aacggcatct tcaacacccg cctgtcctgt actttcggtt acactgtcaa ggccaccacc 600

gtgcgtaccc cttcctgggc tgtggacatg atgcgtttca acatcaacga cttcgtgcct 660

cctggtggcg gcactaacga aatctccatc ccattcgagt actaccgtat ccgtaaggtg 720

aaggtggaat tctggccatg tagccctatc acacagggtg accgcggtgt gggtagcacc 780

gccgtgatcc tggacgacaa cttcgttacc cgtgccaccg ctctgaccta cggtccttac 840

gtgaactact cctcccgcca cacaatccct cagccattca gctaccactc ccgctacttc 900

acccctaagc ctgtgctgga cagcaccatc gactacttcc agcctaacaa caagcgtaac 960

cagctgtggc tgcgcctgca gaccagcgcc aacgtggacc acgtgggtct gggcatcgct 1020

ttcgagaact ccacctacga ccaggactac aacatccgtg tgaccatgta cgtgcagttc 1080

cgtgaattca acctgaagga ccctcctctg aagcctcatc atcaccatca ccattaa 1137

<210> 3

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2-Cap蛋白的氨基酸序列

<400> 3

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg

20 25 30

His Arg Pro Arg Ser His Leu Gly Leu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp

35 40 45

Leu Val His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile

50 55 60

Phe Asn Thr Arg Leu Ser Cys Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr

65 70 75 80

Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile

85 90 95

Asn Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Glu Ile Ser Ile Pro

100 105 110

Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys

115 120 125

Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile

130 135 140

Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Arg Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Gly Pro

145 150 155 160

Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr

165 170 175

His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp

180 185 190

Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln

195 200 205

Thr Ser Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Ile Ala Phe Glu Asn

210 215 220

Ser Thr Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln

225 230 235 240

Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro His His His

245 250 255

His His His

<210> 4

<211> 780

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PCV2-Cap蛋白的核苷酸序列

<400> 4

atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60

gcgacctacc ctcgccgccg cttccgtcgt cgtcgtcacc gtcctcgtag ccacctgggt 120

ctgatcctgc gtcgtcgtcc ttggctggtg caccctcgcc accgttaccg ctggcgccgt 180

aagaacggta tcttcaacac ccgtctgagc tgtaccttcg gttacacagt gaaggctacc 240

accgtgcgta cccctagctg ggccgtggac atgatgcgtt tcaacatcaa cgacttcgtg 300

cctcctggcg gcggtaccaa cgaaatcagc atccctttcg agtactaccg tatccgcaag 360

gtgaaggtgg agttctggcc ttgctcccct atcacccagg gtgaccgtgg tgtgggctcc 420

actgctgtga tcctggacga caacttcgtc acccgtgcta ccgctctgac ctacggtcct 480

tacgtgaact actcctcccg ccacaccatc ccacagcctt tcagctacca cagccgctac 540

ttcaccccta agcctgtgct ggactccacc atcgactact tccagcctaa caacaagcgc 600

aaccagctgt ggctccgcct gcagactagc gctaacgtgg accacgtggg tctgggcatc 660

gctttcgaaa actccaccta cgaccaggac tacaacatcc gtgtgaccat gtacgtgcag 720

ttccgtgaat tcaacctgaa ggaccctcct ctgaagcctc atcatcacca tcaccattaa 780

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Cap-p10-F

<400> 5

ctcgagatga aattcttagt caacgttgcc cttg 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Cap-p10-R

<400> 6

gctagcttaa tggtgatggt gatgatgagg cttc 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Cap-pH-F

<400> 7

ggatccatga aattcttagt caacgttgcc cttg 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Cap-pH-R

<400> 8

gagctcttaa tggtgatggt gatgatgagg cttc 34

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物TBCap-p10-F

<400> 9

ctcgagatga aattcttagt caacgt 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物TBCap-p10-R

<400> 10

gctagcttaa tggtgatggt gatgat 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物TBCap-pH-F

<400> 11

ggatccatga aattcttagt caacgt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物TBCap-pH-R

<400> 12

gagctcttaa tggtgatggt gatgat 26

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物pFBD-1F

<400> 13

tattccggat tattcatacc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物pFBD-1R

<400> 14

acaaatgtgg tatggctga 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物pFBD-2F

<400> 15

tttgttcgcc caggactcta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物pFBD-2R

<400> 16

acggaccttt aattcaaccc 20

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物M13F

<400> 17

cccagtcacg acgacgttgt aaaacg 26

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物M13R

<400> 18

agcggataac aatttcacac agg 23

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Ac-F

<400> 19

agatgcgaca cagatgga 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Ac-R

<400> 20

tcaacaagaa tggaccgaat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物AcMK107-F

<400> 21

gaaattacaa ccgtccaact 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物AcMK107-R

<400> 22

cagcgacact gactaccata 20

Claims

1.一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于通过如下制备方法制备得到：

（1）将包含编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列的重组杆状病毒转移载体转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒；

（2）利用阳离子脂质体cellfectin II将重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞后，收集上清，得到重组杆状病毒；

（3）将步骤（2）制备的重组杆状病毒接种悬浮培养的High-Five昆虫细胞，感染后收集培养物，离心去除培养上清；超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，收集超声上清，得到串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述重组杆状病毒转移载体为分别在pFastBac ^TM Dual载体P10、PH启动子下克隆编码串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于：

编码权利要求1中所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，其特征在于：

步骤（2）中所述的昆虫细胞为sf9细胞或High-five细胞。

4.一种PCV2亚单位疫苗，其特征在于将权利要求1~3任一项所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白与免疫佐剂混合得到。

5.根据权利要求4所述的PCV2亚单位疫苗，其特征在于：

所述的免疫佐剂为ISA 201VG佐剂和Montanide^TM GEL 01佐剂中的至少一种；

所述的PCV2亚单位疫苗中串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的浓度为200~500µg/ml。

6.权利要求1-3任一项所述的串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备PCV2疫苗中的应用。