CN112494712A - 一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备方法 - Google Patents

一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其包括：将季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β‑磷酸三钙和丝素蛋白溶液混合均匀后，冷冻干燥，制得所述可吸收海绵状骨蜡。本发明结合特定的原料配比和制备工艺制得一种具有止血和促进骨愈合的可吸收海绵状骨蜡。由于本发明所用原料均具有良好的生物相容性和可被人体吸收，因此制得的海绵状骨蜡能够被人体吸收，不残留，有利于骨创面愈合。其次，由于季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的作用，该骨蜡具有良好的止血效果，并具有一定的抗菌消炎作用，促进骨创面愈合的效果较好。该骨蜡中还添加了具有骨诱导和骨引导作用的β‑TCP，使得骨蜡能促进骨创面中的骨缺损部位修复。

Description

一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医学工程材料技术领域，具体涉及一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备方法。
背景技术
骨科手术中松质骨创面出血不止或难以彻底止血，是骨外科医生经常遇到的棘手问题。松质骨的结构松散，血运丰富形成密布的血窦，组织中血管收缩性差，加之创面多为锐器切割、暴力打击所致，其出血多为渗血，不同于其它组织出血，难以靠血管收缩自行止血，术中亦难以靠电凝、钳夹、止血纱布、胶海绵填塞等常规方法止血。松质骨最有效的止血方法是迅速填充松质骨表面裂隙、血窦，中止渗血过程，进而激活血管内、外凝血途径，从而达到止血目的。
利用骨蜡迅速填充松质骨的表面裂隙、血窦，可达到止血的目的。骨蜡是骨科止血最常用和有效的止血材料，其具有止血效果确实，简单易用，储存方便等诸多优点。目前常用的骨蜡的主要成分为蜂蜡、麻油、凡士林等。然而，这种骨蜡的粘合性差，脆性大，生物相容性差，难以被机体降解、吸收，且残留在局部对骨愈合造成很大的障碍，一方面会降低组织的抗感染能力，增加术后感染的风险，另一方面骨蜡止血机理只是机械的物理屏障作用，阻止了血液成分(纤维蛋白和血小板)的聚集，不利于原始骨痂的形成，阻碍骨创面的修复。此外，因骨蜡形成异物肉芽肿而引起的局部疼痛、渗液等症状临床上也较多见。国内外有大量文献报道了手术中应用了传统骨蜡止血而引起骨折不愈合的诸多病例；尤其是在脊柱外科手术，涂抹骨蜡势必会影响植骨后的融合效果，文献报道的脊柱外科手术融合效果欠佳的病例几乎都在术中应用了传统骨蜡进行止血。因此，有必要开发一种止血效果良好、能够促进骨创面愈合的新型可吸收骨蜡。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备方法。
为达到其目的，本发明所采用的技术方案为：
一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其包括：将季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液混合均匀后，冷冻干燥，制得所述可吸收海绵状骨蜡。
优选地，所述丝素蛋白溶液的质量体积浓度为4％。
优选地，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:β-磷酸三钙:丝素蛋白溶液＝50mg:10mg:1mL。该配比下，制得的可吸收海绵状骨蜡具有优异的止血效果，并能促进骨创面中的骨缺损部位修复，且生物相容性好，可被人体吸收，无细胞毒性。
优选地，所述冷冻干燥的条件为-80℃冷冻干燥24h。
优选地，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的制备方法，包括：
(1)可溶性淀粉和季铵化壳聚糖加入水中，加热至糊化，并调节pH值至≥10，得到糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物；
(2)将三偏磷酸钠和聚乙二醇溶于水中，然后加入步骤(1)所得的糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物，搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将司盘80溶于橄榄油中，然后滴入步骤(2)所得的混合溶液，反应完全后，冷冻静置过夜，最后离心、洗涤、冻干，即得所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球。
优选地，所述可溶性淀粉、季铵化壳聚糖、三偏磷酸钠、聚乙二醇和司盘80的质量比为，可溶性淀粉:季铵化壳聚糖:三偏磷酸钠:聚乙二醇:司盘80＝10:10:0.8:0.8:2。该条件下，可成功制得具有较好的生物相容性、止血效果和抑菌作用的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球。
优选地，所述洗涤为用无水乙醇和纯化水交替洗涤。
本发明还提供了一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡，其由上述的具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡的制备方法制得。
本发明通过乳化法制得季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球，生产工艺简单，制得的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球同时兼具了季铵化壳聚糖和改性淀粉的优点。季铵化壳聚糖不会产生毒性、刺激性以及免疫抗原性，也不会溶血，是一种生物相容性较好的可降解生物基材料，还具有一定的止血、抑菌等功能。季铵化壳聚糖对血细胞有一定的凝聚作用，原因是因为红细胞表面胞壁酸带的负电荷和季铵化壳聚糖单元中的氮原子所带的正电荷产生静电吸引，从而导致了红细胞的聚集，最终使血液凝结成为血块，达到止血效果；这种止血作用不依赖于人自体凝血过程，尤其是对于病患具有自体凝血障碍的出血情况更加适用。改性淀粉赋予复合微球以下的特点：具有多孔结构，吸附性强；在生物体内具有一定的可变形性；在人体中，易被相关的酶降解。同时，改性淀粉具有很好的生物相容性，无毒，可生物降解，无免疫原性，而且原料来源广泛，价格低廉，其综合性能远远优于合成脂质体、蛋白质和高分子材料等早期的原料。经试验证实，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球具有优异的止血效果，因其表面具有微孔结构，并具有一定的吸水性，能够快速吸干血液中的水分，同时发挥分子筛的作用，使血液中红细胞、凝血酶、血小板和纤维蛋白等有形成分在颗粒表面聚集，形成凝胶状混合物，达到迅速止血的效果；还具有一定的抗菌消炎作用。
此外，本发明采用的丝素蛋白具有良好的生物相容性、易加工性和可降解性，有利于组织血管化。β-磷酸三钙(β-TCP)具有良好的生物相容性、骨传导作用和生物降解性，其组成成分与生物骨中的无机成分相似，植入体内后会发生溶解，溶解析出的Ca、P进入活体循环***然后形成有生命的新生骨。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过冷冻干燥的方法，以丝素蛋白、季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球和β-TCP作为基质，结合特定的原料配比和制备工艺制得一种具有止血和促进骨愈合的可吸收海绵状骨蜡。由于本发明所用原料均具有良好的生物相容性和可被人体吸收，因此制得的海绵状骨蜡能够被人体吸收，不残留，有利于骨创面愈合。其次，由于季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的作用，该骨蜡具有良好的止血效果，并具有一定的抗菌消炎作用，促进骨创面愈合的效果较好。另外，该骨蜡中还添加了具有骨诱导和骨引导作用的β-TCP，使得骨蜡能促进骨创面中的骨缺损部位修复。本发明的原料易得，生产工艺简单，经济价值和临床价值高，有利于工业化和市场化。
附图说明
图1为实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的扫描电镜图；
图2为实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡的扫描电镜图；
图3为实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～3制备的海绵状骨蜡的细胞毒性测试结果；
图4为实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～3制备的海绵状骨蜡的ALP测试结果；
图5为各海绵状骨蜡样品移植于兔子胫骨出血缺损处的流程，A为兔子胫骨造缺损，B为海绵状骨蜡移植于兔子胫骨缺损处；
图6为实施例3制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡对骨创面的修复大体图；
图7为实施例3制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡对骨创面的修复3D重建图。
具体实施方式
下面将结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的方法如无特别指明，均为本领域的常规方法。
实施例1
丝素蛋白溶液的制备，包括如下步骤：
(1)用质量分数为0.5％的Na2CO3溶液煮沸处理蚕茧5次，每次1小时，温度为100℃，浴比为l:100，然后用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维；
(2)用摩尔比为1:2:8的CaCl2、CH3CH2OH和H2O混合而成的三元溶剂溶解步骤(1)制得的纯丝素纤维，三元溶剂与丝素纤维的质量比为10：1，于75～80℃下搅拌溶解1～2小时，得到混合溶液；
(3)将步骤(2)制得的混合溶液冷却后，注入纤维素透析膜中，在流水中透析2～4天，将透析后的溶液置于4℃保存，即得质量体积浓度为4％的丝素蛋白溶液。
实施例2
季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的制备，包括如下步骤：
(1)称取10g可溶性淀粉和10g季铵化壳聚糖置于烧杯中，并加入100mL纯化水，在磁力搅拌下用水浴锅加热到95℃直至糊化，并用1％的氢氧化钠溶液调节PH≥10，得到糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物；
(2)称取0.8g的三偏磷酸钠和0.8g的PEG置于烧杯中，并加入30mL纯化水搅拌溶解，然后加入步骤(1)得到的糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物并搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)量取150mL的橄榄油，加入2g span80，在60℃水浴中搅拌溶解后降温至50℃，然后缓慢滴入步骤(2)得到的混合溶液，滴加完成后，继续反应6h，然后放在4℃冰箱中静置过夜，然后在5000RPM转速下离心，取沉淀并用无水乙醇和纯化水交替洗涤3次，然后冻干得到季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球。
实施例3
可吸收海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：
将实施例1制备的丝素蛋白溶液、实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、及β-TCP在400RPM下搅拌24h，以将其混合均匀，然后在-80℃下冷冻干燥24h，即得可吸收海绵状骨蜡。本实施例中，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:β-磷酸三钙:丝素蛋白溶液＝50mg:10mg:1mL。
实施例4
可吸收海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：
将实施例1制备的丝素蛋白溶液、实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、及β-TCP在400RPM下搅拌24h，以将其混合均匀，然后在-80℃下冷冻干燥24h，即得可吸收海绵状骨蜡。本实施例中，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:β-磷酸三钙:丝素蛋白溶液＝100mg:10mg:1mL。
对比例1
海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：将实施例1制备的丝素蛋白溶液在-80℃下冷冻干燥24h，即得海绵状骨蜡。
对比例2
海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：
将实施例1制备的丝素蛋白溶液、及β-TCP在400RPM下搅拌24h，以将其混合均匀，然后在-80℃下冷冻干燥24h，即得海绵状骨蜡。β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液的质量体积比为，β-磷酸三钙:丝素蛋白溶液＝10mg:1mL。
对比例3
海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：
将实施例1制备的丝素蛋白溶液和实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球在400RPM下搅拌24h，以将其混合均匀，然后在-80℃下冷冻干燥24h，即得海绵状骨蜡。季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:丝素蛋白溶液＝20mg:1mL。
对比例4
海绵状骨蜡的制备，包括如下步骤：
将实施例1制备的丝素蛋白溶液和实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球在400RPM下搅拌24h，以将其混合均匀，然后在-80℃下冷冻干燥24h，即得海绵状骨蜡。季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:丝素蛋白溶液＝50mg:1mL。
试验例
一、将实施例2制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球喷金后，置于扫描电子显微镜下观察，测试条件为：5kV electron beam。
图1为该季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的扫描电镜图，从图1可看出，本发明制备的季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球为椭圆形，粒径为20～50微米。
二、将实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡喷金后，置于扫描电子显微镜下观察，测试条件为：5kV electron beam。
图2为实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡的扫描电镜图。图中，A图为对比例1的海绵状骨蜡，B图为对比例2的海绵状骨蜡，C图为对比例3的海绵状骨蜡，D图为对比例4的海绵状骨蜡，E图为实施例3的海绵状骨蜡，F图为实施例4的海绵状骨蜡。
从图2可看出，6组海绵状骨蜡均为多孔结构，A图中未看到多孔结构中有粉末填充，而其余图中可看到多孔结构中有明显的粉末填充，而且随着所加入粉末量的增加，多孔结构的孔隙中填充的粉末量不断增多。其中，海绵状骨蜡D和E中有大量的粉末均匀地分布在多孔结构中，而且多孔结构没有受到破坏。而海绵状骨蜡F中能够看到粉末层叠在多孔结构中，海绵状骨蜡的多孔结构已经受到了破坏。由此说明，只有以特定配比将丝素蛋白溶液、季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球及β-TCP混合制备海绵状骨蜡，才能获得具有多孔结构、具有优异止血功能和促骨修复功能的可吸收海绵状骨蜡。
三、细胞毒性
依据国标GB/T 16886.12对医疗器械的浸提液浸提标准，按照表面积1.25cm2/mL的比例浸提浸提液。按国标加入浸提液后，在37℃摇床中培养24±2h，即用，剩余可放4℃冰箱待用。将含100uL,1×104个/mL小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养基接种于96孔板中。接种12h后取出原培养液，并分别在每孔皿中加入100μL实验材料浸提液。每组至少设5孔。培养液2天换一次。细胞在培养到设定的时间点后，培养液被移除，细胞PBS洗涤2次。每孔加入培养基量50uL的CCK8溶液，并设定阴性对照(空白培养基)，在细胞培养箱中培养1h～2h。根据颜色变化判断，将培养板取出，将对应孔内液体吸至96孔板中。并在酶标仪450nm波长下检测吸光度值(OD值)，记录并计算数据。实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～3制备的海绵状骨蜡样品，进行细胞相容性测试-细胞毒性，测试结果如图3所示。图3中，A图为对比例1的海绵状骨蜡，B图为对比例2的海绵状骨蜡，C图为对比例3的海绵状骨蜡，E图为实施例3的海绵状骨蜡，F图为实施例4的海绵状骨蜡。
从图3可看出，实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～3制备的海绵状骨蜡样品都具有良好的细胞相容性，细胞存活率均＞80％。其中，海绵状骨蜡E的细胞存活率最高，原因是：(1)海绵状骨蜡E中含有β-TCP，β-TCP具有骨诱导和骨引导的作用，因此对BMSCs细胞的增殖和分化有促进作用；(2)海绵状骨蜡E保持了多孔支架结构，有利于细胞的粘附，对BMSCs细胞的增殖和分化有促进作用。
四、碱性磷酸酶活性(ALP)
将实施例3～4制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～3制备的海绵状骨蜡样品放入96孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)从培养基消化，1500RPM离心5min，去除上清夜，加入含有血清的新鲜低糖DMEM培养基，并且将细胞悬液浓度调为5×106/mL。细胞种植密度为1×105/支架。孵化2h后，每孔加入500μL培养基，24h后换为含***培养基(含10％FCS、50mM的抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油二钠和100nM***的高糖DMEM)。在37℃，5％的CO2培养箱中培养至所需时间，为了保持细胞的营养供应，隔天更换培养基一次。
将支架从培养板中取出，用PBS溶液清洗3次后，加入500μL细胞裂解液，随后于4℃裂解过夜，超声破碎。加入500μL ALP底物反应液于孔板中，37℃水浴加热反应30min后，加入500μL，浓度为0.1M的NaOH溶液终止反应，随即在紫外-可见光分光光度计(UV-Probe2550,Shimadzu)测定405nm处的吸收值，并按照说明书对ALP进行计算。每组样品平行测试3次，测试结果如图4所示。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种膜结合蛋白，是成骨细胞分化的早期标志物，参与矿物沉积的过程。因此，我们在体外实验通过研究支架上碱性磷酸酶(ALP)活性的测量，研究海绵状骨蜡对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分化的情况。
从图4可看出，随着培养时间的增加，各种海绵状骨蜡的细胞的ALP活性均有增加，这表明五种海绵状骨蜡都能够支持BMSCs的成骨分化。另外，如图4所示，海绵状骨蜡E具体更高的ALP活性，这个结果与细胞相容性的结果相符，其原因也是因为海绵状骨蜡E含有β-TCP，并且保持了多孔支架结构。
五、海绵状骨蜡的止血效果与对骨缺损的修复情况
取经过检疫合格的新西兰兔40只，雄性，根据动物体重随机分为5组。
新西兰兔耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液(40mg/kg)麻醉后，动物右后肢部位剃毛、清洁，碘伏消毒后酒精脱碘，沿动物右后肢胫骨中线切开皮肤、皮下组织，暴露右后肢胫骨侧面。在膝关节下方3cm处，使用ZAZJ-I型电池式医用电动钻钻出直径4.2mm、深3mm的骨缺损区。模型成功后进行拍照。立即分别用实施例3制备的可吸收海绵状骨蜡和对比例1～4制备的海绵状骨蜡对缺损部位进行填充，记录海绵状骨蜡至缺损部位停止出血时间(至多观察5min)，然后缝合切口。实验流程，如图5所示。结果如表1和图6～7所示。
表1和图6～7中，海绵状骨蜡A为对比例1的海绵状骨蜡，海绵状骨蜡B为对比例2的海绵状骨蜡，海绵状骨蜡C为对比例3的海绵状骨蜡，海绵状骨蜡D为对比例4的海绵状骨蜡，海绵状骨蜡E为实施例3的海绵状骨蜡。
表1海绵状骨蜡的止血时间
Figure BDA0002844037380000091
Figure BDA0002844037380000101
从表1可看出，海绵状骨蜡A和B的出血时间都大于5min，没有止血效果。海绵状骨蜡C的止血时间为30±5S，而海绵状骨蜡D和E的止血时间为立即止血。实验结果说明，只含SF(丝素蛋白)或者含有SF和β-TCP的海绵状骨蜡没有止血效果，而含有季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的海绵状骨蜡具有止血效果，说明季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球是海绵状骨蜡止血功能的主要成分，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的含量越高，止血效果越好。
综合图6和图7可得知，随着时间的增加，五组海绵状骨蜡对骨缺损位置都有修复作用。其中，海绵状骨蜡B和E的修复效果最好，这是因为海绵状骨蜡B和E中含有具有骨引导和骨诱导作用的β-TCP。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，包括：将季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液混合均匀后，冷冻干燥，制得所述可吸收海绵状骨蜡。
2.如权利要求1所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的质量体积浓度为4％。
3.如权利要求1所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球、β-磷酸三钙和丝素蛋白溶液的质量体积比为，季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球:β-磷酸三钙:丝素蛋白溶液＝50mg:10mg:1mL。
4.如权利要求1所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为-80℃冷冻干燥24h。
5.如权利要求1所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的制备方法，包括：
(1)可溶性淀粉和季铵化壳聚糖加入水中，加热至糊化，并调节pH值至≥10，得到糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物；
(2)将三偏磷酸钠和聚乙二醇溶于水中，然后加入步骤(1)所得的糊化淀粉/季铵化壳聚糖复合物，搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将司盘80溶于橄榄油中，然后滴入步骤(2)所得的混合溶液，反应完全后，冷冻静置过夜，最后离心、洗涤、冻干，即得所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球。
6.如权利要求5所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的制备方法中，所述可溶性淀粉、季铵化壳聚糖、三偏磷酸钠、聚乙二醇和司盘80的质量比为，可溶性淀粉:季铵化壳聚糖:三偏磷酸钠:聚乙二醇:司盘80＝10:10:0.8:0.8:2。
7.如权利要求5所述的可吸收海绵状骨蜡的制备方法，其特征在于，所述季铵化壳聚糖/改性淀粉复合微球的制备方法中，所述洗涤为用无水乙醇和纯化水交替洗涤。
8.一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡，其特征在于，由如权利要求1～7任一项所述的具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡的制备方法制得。
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