CN106166308B - 一种三维多孔复合支架及其制备方法 - Google Patents
一种三维多孔复合支架及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106166308B CN106166308B CN201610715160.3A CN201610715160A CN106166308B CN 106166308 B CN106166308 B CN 106166308B CN 201610715160 A CN201610715160 A CN 201610715160A CN 106166308 B CN106166308 B CN 106166308B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- hyaluronic acid
- solution
- protein solution
- silk fibroin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 75
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 25
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 29
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 29
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 10
- 239000008236 heating water Substances 0.000 claims description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 241000382353 Pupa Species 0.000 claims description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 18
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 7
- 229940059936 lithium bromide Drugs 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 6
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 4
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000032984 Intraoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000005030 aluminium foil Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- -1 hyaluronic acid benzyl ester Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
- A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
- A61L27/48—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with macromolecular fillers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/60—Materials for use in artificial skin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开了一种三维多孔复合支架及其制备方法，所述复合支架是以2～10wt％丝素蛋白溶液、透明质酸和海藻酸钠为原料制备而得的，其中，透明质酸与丝素蛋白溶液的比为0.1g：5～30ml，丝素蛋白溶液和透明质酸组成的混合溶液与海藻酸钠的比为15～25ml：0.1g，将透明质酸和海藻酸钠的溶液和丝素蛋白进行物理混合，经冻干后即可得到三维多孔复合支架。得到的支架不仅有利于成纤维细胞的粘附与增值，还具有较好的亲水性等等，克服了现有支架材料欠缺的一些问题，多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了原有材料性能的不足。本发明制备工艺简单，所需的原材料配比中所需成本较低，适合大量生产。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，特别涉及一种丝素蛋白/透明质酸/海藻酸钠三维多孔复合支架及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，主要分为表皮层、真皮层和皮下组织，对人体具有重要的屏障、机械、感知和调控的功能。但是皮肤是人体最脆弱和最容易受到伤害的器官之一，皮肤溃烂、创伤、手术损伤和烧伤是皮肤受损的重要原因，其中烧伤是皮肤受损的主要原因。就中国来说，每年烧伤的病人在1000万以上，其中因为严重烧伤需要皮肤移植的患者达到300万以上。但是由于自体皮的来源有限，遇到大面积皮肤严重缺损时会存在可供皮不足，极大的限制了其在皮肤修复中的广泛应用。人工皮肤作为自体皮肤的替代物，在皮肤创面修复中扮演着越来越重要的角色。在自体皮肤供应不足的情况下，皮肤大面积损伤者受益。
近年来随着组织工程和再生医学的发展，研究者已经通过组织工程支架，生长因子，种子细胞以及基因治疗等方法开发出多种组织工程支架的人工皮肤替代物。
丝素蛋白(Silk fibroin，SF)是一种疏水性的蛋白质，力学性能优异，结构稳定，具有良好的生物相容性，而且来源丰富，成本低廉，是一种优良的天然的高分子材料。基于丝素蛋白这些优点，其一直广泛运用在组织工程领域上，如软骨修复、网状***修复、骨修复和神经修复等方面。有研究表明，用丝素蛋白能够促进成纤维细胞的增殖，分化，对皮肤伤口愈合有促进作用，所以丝素蛋白能够作为皮肤敷料使用。
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是一种独特的线性大分子粘多糖，是细胞外基质的主要成分，体外细胞实验表明，透明质酸不仅可以促进细胞的黏附与增殖，而且在生物性修复术中，透明质酸可隔离组织表面，作为一种机械保护剂，在手术后可防止粘连及纤维性组织形成。高浓度、高分子量的透明质酸不但能抑制出血，减少能形成永久粘连骨架的血块数量，而且能抑制成纤维细胞的运动和活性。透明质酸苄酯的微孔膜已被研究证明是培养和输送活性角质化细胞进行烧伤、慢性溃疡治疗的一种优良的材料。
海藻酸钠(sodium alginate,Alg)是从天然褐藻中提取的一种聚阴离子多糖,由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸连结而成,具有良好的生物相容性且能在二价离子如Ca2+等的作用下形成凝胶,广泛应用于组织工程领域。
目前利用丝素蛋白作为三维支架用作皮肤敷料已经成为热点，透明质酸和海藻酸钠各自优点在支架上的应用也层出不穷，如今丝素蛋白透明质酸海藻酸钠多者混合的很多性能有待研究，比如吸水性、在生物环境下的降解特性、血液相容性等等。多者混合比率不恰当或者混合条件不合适会影响支架的成孔率以及孔径大小，不利于细胞的粘附增值，进而也会影响支架的应用性能。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明利用丝素蛋白、透明质酸、海藻酸钠三者在皮肤修复中各自优点，提供了一种三维多孔复合支架及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种三维多孔复合支架，所述复合支架是以2～10wt％丝素蛋白溶液、透明质酸和海藻酸钠为原料制备而得的，其中，透明质酸与丝素蛋白溶液的比为：0.1g：5～30ml，2～10wt％丝素蛋白溶液和透明质酸混合溶液与海藻酸钠的比为：15～25ml：0.1g。
在其中一些实施例中，所述丝素蛋白溶液的浓度为3.5wt％，所述透明质酸与丝素蛋白溶液的比为：0.1g：20ml。
在其中一些实施例中，丝素蛋白溶液和透明质酸混合溶液与海藻酸钠的比为：21ml：0.1g。
本发明还提供了上述三维多孔复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将2～10wt％的丝素蛋白溶液加入到透明质酸溶液中，室温搅拌25～35min，再加入0.05～0.5gEDC/NHS搅拌30～45min；其中，每0.1g透明质酸中加入5～30ml丝素蛋白溶液；
(2)、将0.05～0.2g海藻酸钠溶于10～24ml去离子水中，再与步骤(1)得到的溶液混合均匀，注入孔板形成凝胶，冷藏形成冰晶状固体，冻干，即得；其中，每0.1g海藻酸钠加入15～25ml步骤(1)的溶液。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述丝素蛋白的制备方法为：取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复煮一遍取出，洗干净置于烘箱中烘干。
在其中一些实施例中，所述蚕茧为去蛹的蚕茧。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述丝素蛋白溶液的制备方法为：称量2～4g丝素蛋白置于圆底烧瓶中，加入9.8mol/L的溴化锂溶液，40～60℃水浴加热溶解3～5小时，取出丝素蛋白混合液置于透析袋中透析3～5天，每天更换1～3次去离子水，将完成透析的溶液离心8～15分钟，最后取出离心管，上层清液即为丝素蛋白溶液。
在其中一些实施例中，所述透析袋的截留分子量为8-14kD。
在其中一些实施例中，所述离心条件为25℃，5000r/min，10～15min。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述冷藏结晶温度为-80℃。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述冻干条件为-60℃，48h。
本发明还提供了上述三维多孔复合支架在皮肤修复方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的三维多孔复合支架孔径均匀，成孔率高，血液相容性好，不仅有利于成纤维细胞的粘附与增值，还具有较好的亲水性等等，克服了现有支架材料因为多者复合制备方法不当使得支架孔径率大大降低，不易降解，并且严重影响组织局部环境进而对皮肤造成伤害等等诸多问题。本发明多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了原有材料性能的不足，能够降低受伤皮肤感染以及促进皮肤的修复，加快伤口愈合；
2、本发明的三维多孔复合支架的制备方法简单，成本低，生产效率高，适合工业化大生产。
附图说明
图1为本发明实施例1的三维多孔复合支架的外观图；
图2为实施例1的三维多孔复合支架在扫描电子显微镜下的结构图，由图可知孔径均匀，平均孔径为30-120μm，测出的孔隙率约为76％；
图3为实施例1，对比实施例1，2,3的多孔支架的FT-IR图，图中可知实施例1复合支架为物理混合，包含单体物质的性能；
图4为实施例1的三维多孔复合支架的降解图，pH保持稳定变化，不改变环境pH；
图5为实施例1的三维多孔复合支架的降解图，a折线显示缓冲液下基本不降解，b折线显示酶下缓慢降解；
图6为实施例1，对比实施例1,2,3的多孔支架的质量分析图；
图7为实施例1，对比实施例1,2,3的多孔支架的溶血率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的原料都来源于市售。
实施例1三维多孔复合支架及其制备方法
本实施例的三维多孔复合支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取2.5g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热5h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为8kD透析3天，每天换3次水)，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到3.5wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、称取0.1g透明质酸溶于1ml去离子水中，震荡摇匀半小时左右，待形成均匀溶液后加入20ml步骤(2)的丝素蛋白溶液，常温下搅拌1小时左右，然后加入0.1g EDC/NHS再搅拌2～3小时，搅拌速度为300～400r/min；
(4)、称取0.1g海藻酸钠室温下加入至12ml去离子水中，搅拌溶解，再将溶液加入步骤(3)的溶液中混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，将孔板于37℃环境下匀低速震荡直至形成凝胶液。再将凝胶液置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干2天取出，即得本实施例的三维多孔复合支架。
图1为本实施例1的三维多孔复合支架的外观图；图2为三维多孔复合支架在扫描电子显微镜下的结构图，由图可知本实施例得到的三维多孔复合支架孔径均匀，平均孔径为30-120μm，测出的孔隙率约为76％；图4、5为本实施例的三维多孔复合支架的降解图，从图中可知，pH保持稳定变化，不改变环境pH，在缓冲液下三维多孔复合支架基本不降解，在酶下三维多孔复合支架缓慢降解。表1为实施例1的三维多孔复合支架的吸水率。结果显示支架的吸水率达到质量比约为42倍的比率，效果明显。
表1实施例1的三维多孔复合支架的吸水率
| V<sub>0</sub> | Dry weight±SD(mg) | V±SD(ml) | R±SD |
| 10 | 35.74±6.34 | 8.5±0.23 | 41.97±0.86 |
实施例2三维多孔复合支架及其制备方法
本实施例的三维多孔复合支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取1g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热3h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为10kD)透析3天，每天换3次水，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到2wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、称取0.1g透明质酸溶于1ml去离子水中，震荡摇匀半小时左右，待形成均匀溶液后加入20ml步骤(2)的丝素蛋白溶液，常温下搅拌1小时左右，然后加入0.1g EDC/NHS再搅拌2～3小时，搅拌速度为300～400r/min；
(4)、称取0.1g海藻酸钠室温下加入至12ml去离子水中，搅拌溶解，再将溶液加入步骤(3)的溶液中混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，将孔板于37℃环境下匀低速震荡直至形成凝胶液。再将凝胶液置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干2天取出，即得本实施例的三维多孔复合支架。
该实施例的三维多孔复合支架的性能与实施例1的三维多孔复合支架的性能相似。
实施例3三维多孔复合支架及其制备方法
本实施例的三维多孔复合支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取7.5g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热3h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为12kD)透析3天，每天换3次水，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到10wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、称取0.1g透明质酸溶于1ml去离子水中，震荡摇匀半小时左右，待形成均匀溶液后加入20ml步骤(2)的丝素蛋白溶液，常温下搅拌1小时左右，然后加入0.1g EDC/NHS再搅拌2～3小时，搅拌速度为300～400r/min；
(4)、称取0.1g海藻酸钠室温下加入至12ml去离子水中，搅拌溶解，再将溶液加入步骤(3)的溶液中混合均匀，然后将溶液注入孔板中，保鲜膜封口，并扎适量小孔，将孔板于37℃环境下匀低速震荡直至形成凝胶液。再将凝胶液置于-80℃下冷藏形成冰晶状固体，最后取出置于冻干机中-60℃冻干2天取出，即得本实施例的三维多孔复合支架。
该实施例的三维多孔复合支架的性能与实施例1的三维多孔复合支架的性能相似。
对比例1多孔丝素蛋白支架及其制备方法
本对比例的多孔丝素蛋白支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取2.5g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热5h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为8kD)透析3天，每天换3次水，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到3.5wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、取3.5wt％的丝素蛋白溶液-60℃下冻干2天得到丝素蛋白支架。
对比例2多孔丝素蛋白/透明质酸支架及其制备方法
本对比例的多孔丝素蛋白/透明质酸支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取2.5g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热5h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为8kD)透析3天，每天换3次水，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到3.5wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、称取0.1g透明质酸溶于1ml去离子水中，震荡摇匀半小时左右，待形成均匀溶液后加入20ml步骤(2)的丝素蛋白溶液，常温下搅拌1小时左右，然后加入0.1g EDC/NHS再搅拌2～3小时，搅拌速度为300～400r/min；
(4)、取上述丝素蛋白/透明质酸混合液于-60℃下冻干2天得到丝素蛋白/透明质酸混合支架。
对比例3多孔丝素蛋白/海藻酸钠支架及其制备方法
本对比例的多孔丝素蛋白/海藻酸钠支架的制备方法包括如下步骤：
(1)、取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复上述步骤，置于烘箱中烘干，获得丝素蛋白待用；
(2)、取2.5g丝素蛋白加入25ml 9.8mol/L的溴化锂溶液，60℃下水浴加热5h后，用透析袋透析(透析袋的截留分子量为8kD)透析3天，每天换3次水，然后于25℃，5000r/min下离心10分钟，得到3.5wt％的丝素蛋白溶液；
(3)、称取0.1g海藻酸钠室温下加入至12ml去离子水中，搅拌溶解，再将溶液加入步骤(3)的溶液中混合均匀；
(4)、取上述丝素蛋白/海藻酸钠混合液于-60℃下冻干2天得到丝素蛋白/海藻酸钠混合支架。
在获取实施例1和对比例1～3材料的情况下为比较之间的特征做如下分析实验：
(1)、取适量KBr干燥磨细后压片放入傅里叶红外光谱仪中测定。光谱扫描范围为500-4000cm-1，分辨率为4cm-1，KBr光谱作为背景对比图，将实施例1及对比例1～3和分别和KBr大约以1:100的量混合研磨干燥压片后放入傅里叶红外光谱仪中测定，获得红外光谱，如图3所示，由图3可知实施例1及对比例1～3样品的吸收峰基本相似，主要吸收峰在1667cm-1(酰胺Ⅰ)，1532cm-1(酰胺Ⅱ)，1244cm-1(酰胺Ⅲ)678cm-1(酰胺Ⅴ)，这些特征峰主要和丝素蛋白的无规卷曲或者α-螺旋结构有关，说明了透明质酸海藻酸钠的加入并没有改变丝素蛋白的结构性能。
(2)、分别称取干燥的约10mg的上述实施例1及对比例1～3样品支架，装入一个干净的小铝箔锅里，在仪器中充满N2的环境下，从室温一直加热到700℃，升温速率为10℃/min。热重分析仪开始收集数据，进而得到热重分析图谱，如图6所示，由图6可以看出0℃到250℃时，每种支架的重量都有所减少，而SF/HA/Alg支架的减少速度适中，这一阶段主要是支架表面吸附水的损失。而在约250℃到325℃这个区间曲线突然变得很陡，可以看出样品的质量开始大幅度分解，而温度在大于400℃后样品的质量减少变得越来越缓慢，逐渐减少到0，而SF/HA/Alg复合物的减缓速度一直处于适中状态，结合上述FT-IR图可知，复合属于物理结合，没有改变重要基团的结构，复合物质具有单独物质的特性。并且质量损失不快不慢，说明实施例1样品混合较均匀，且该支架热性能更趋稳定变化。
(3)、将收集洗净的红细胞悬浮于适量PBS中，配成红细胞的体积占总体积16％的红细胞悬浮液。分别取适量实施例1及对比例1～3支架样品，用PBS(PH＝7.4)缓冲液浸泡24小时，取出浸透液分别编号，PBS和去离子水分别作为阴性对照组和阳性对照组，取上述各样品1ml于离心管中，并加入50μL红细胞悬液，实验分为5个时间点，37℃下孵化0h，0.5h，1h，1,5h，2h，然后取出1000×g离心2～3min，移取上清液于96孔板中，通过酶标仪测量540nm处吸光度，实验平行做3次。红细胞的溶血率如下计算：
溶血率(％)＝[(A-A0)/(A1-A0)]*100
A------实验组吸光值；
A0------阴性对照组吸光值；
A1------阳性对照组吸光值。
计算绘图获得溶血率，如图7所示。从图7溶血率图可知实施例1的溶血率始终保持在5％以下，且在不同时间段都保持稳定值，较其他对比例更优。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种三维多孔复合支架，其特征在于，所述复合支架是以2～10wt％丝素蛋白溶液、透明质酸和海藻酸钠为原料制备而得的，其中，透明质酸与丝素蛋白溶液的比为0.1g：5～30ml，丝素蛋白溶液和透明质酸组成的混合溶液与海藻酸钠的比为15～25ml：0.1g。
2.根据权利要求1所述的三维多孔复合支架，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的浓度为3.5wt％，所述透明质酸与丝素蛋白溶液的比为0.1g：20ml。
3.根据权利要求1所述的三维多孔复合支架，其特征在于，丝素蛋白溶液和透明质酸的混合溶液与海藻酸钠的比为21ml：0.1g。
4.权利要求1所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将2～10wt％的丝素蛋白溶液加入到透明质酸溶液中，室温搅拌25～35min，再加入0.05～0.5gEDC/NHS搅拌30～45min；其中，每0.1g透明质酸中加入5～30ml丝素蛋白溶液；
(2)、将0.05～0.2g海藻酸钠溶于10～24ml去离子水中，再与步骤(1)得到的溶液混合均匀，注入孔板形成凝胶，冷藏形成冰晶状固体，冻干，即得；其中，每0.1g海藻酸钠加入15～25ml步骤(1)的溶液。
5.根据权利要求4所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述丝素蛋白的制备方法为：取8g蚕茧置于大烧杯中，加入400ml去离子水，同时加入2g无水碳酸钠，煮沸半小时取出，用去离子水清洗几遍至中性，再重复煮一遍取出，洗干净置于烘箱中烘干。
6.根据权利要求5所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，所述蚕茧为去蛹的蚕茧。
7.根据权利要求4所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述丝素蛋白溶液的制备方法为：称量2～4g丝素蛋白置于圆底烧瓶中，加入9.8mol/L的溴化锂溶液，40～60℃水浴加热溶解3～5小时，取出丝素蛋白混合液置于透析袋中透析3～5天，每天更换1～3次去离子水，将完成透析的溶液离心8～15分钟，最后取出离心管，上层清液即为丝素蛋白溶液。
8.根据权利要求7所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为8-14kD，所述离心条件为25℃，5000r/min，10～15min。
9.根据权利要求7所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述冷藏结晶温度为-80℃。
10.根据权利要求7所述的三维多孔复合支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述冻干条件为-60℃，48h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610715160.3A CN106166308B (zh) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | 一种三维多孔复合支架及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610715160.3A CN106166308B (zh) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | 一种三维多孔复合支架及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106166308A CN106166308A (zh) | 2016-11-30 |
| CN106166308B true CN106166308B (zh) | 2019-01-18 |
Family
ID=57376743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610715160.3A Active CN106166308B (zh) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | 一种三维多孔复合支架及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106166308B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113975461B (zh) * | 2021-12-01 | 2022-04-01 | 四川大学 | 一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与应用 |
| CN114316162B (zh) * | 2022-01-18 | 2023-06-13 | 四川大学 | 光交联可注射纳米纤维-水凝胶复合物及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2210971A1 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-28 | Politecnico Di Milano | Silk fibroin textile structures as biomimetic prosthetics for the regeneration of tissues and ligaments |
| CN101700409A (zh) * | 2009-11-20 | 2010-05-05 | 佘振定 | 一种由纯天然材料制备的创伤用材料 |
| CN102178980A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-09-14 | 东南大学 | 天然高分子复合多孔纤维支架及其制备方法 |
| CN103225126B (zh) * | 2013-05-14 | 2014-10-22 | 浙江大学 | 丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法 |
| CN103469351B (zh) * | 2013-07-18 | 2016-03-02 | 嘉兴学院 | 负载维生素c的丝素蛋白/透明质酸复合纳米纤维的制备方法 |
| CN105521525B (zh) * | 2015-12-16 | 2019-01-25 | 广州创赛生物医用材料有限公司 | 一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法 |
-
2016
- 2016-08-24 CN CN201610715160.3A patent/CN106166308B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106166308A (zh) | 2016-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9555164B2 (en) | Method for preparing porous scaffold for tissue engineering | |
| Zhang et al. | Silk fibroin microfibers and chitosan modified poly (glycerol sebacate) composite scaffolds for skin tissue engineering | |
| CN109999227B (zh) | 一种基于丝素蛋白和甲壳素混纺纳米纤维嵌入式水凝胶软骨仿生支架的制备方法及应用 | |
| CN102277737A (zh) | 聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用 | |
| CN101084025A (zh) | 多孔生物材料－填充物复合物及其制造方法 | |
| CN106860915B (zh) | 一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料及其制备方法 | |
| Xie et al. | Adult stem cells seeded on electrospinning silk fibroin nanofiberous scaffold enhance wound repair and regeneration | |
| CN103083723B (zh) | 胶原/纳米纤维素皮肤再生材料及其制备方法与应用 | |
| CN104001208B (zh) | 一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法 | |
| CN102218160A (zh) | 神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用 | |
| CN104984393B (zh) | 一种骨组织工程支架材料及其制备方法 | |
| CN114225116B (zh) | 一种可缓释透明质酸和生长因子的人工骨膜及其制备方法 | |
| CN109381732A (zh) | 负载生长因子小分子抑制剂的静电纺丝敷料、其制备方法及应用 | |
| CN106166308B (zh) | 一种三维多孔复合支架及其制备方法 | |
| CN108744061B (zh) | 一种负载bmp-2的掺锶羟基磷灰石/丝素蛋白/肝素复合支架及其制备方法和应用 | |
| He et al. | Silk fibroin/chitosan/TGF-β1-loaded microsphere scaffolds for cartilage reparation | |
| CN110975009B (zh) | 静电纺丝纤维支架材料的制备方法 | |
| CN112494712A (zh) | 一种具有止血和促骨愈合功能的可吸收海绵状骨蜡及其制备方法 | |
| CN112870429A (zh) | 一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵、制备方法和应用 | |
| CN113952512B (zh) | 一种复合多孔凝胶微球及其制备方法和应用 | |
| CN114053486B (zh) | 一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途 | |
| CN110624129B (zh) | 一种耐溶蚀的骨诱导性丝素蛋白/羟基磷灰石/氧化镁凝胶海绵及制备方法 | |
| CN113018517A (zh) | 一种3d打印皮肤支架及其制备方法和应用 | |
| CN117339013B (zh) | 一种能提高软骨修复能力的水凝胶复合支架 | |
| CN116747355B (zh) | 一种复合人工皮肤及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 510663 floor 2, building C, building 1, No. 2, Ruitai Road, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee after: Guangzhou bioscience Co.,Ltd. Address before: High tech Industrial Development Zone, Guangzhou City, Guangdong province 510663 Science City skim Springs Road No. 3, Guangzhou international business incubator A A506 Patentee before: GUANGZHOU BEOGENE BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200417 Address after: 510663 floor 2, building C, building 1, No. 2, Ruitai Road, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Co-patentee after: GUANGZHOU CHUANGSEED BIOMATERIALS CO.,LTD. Patentee after: Guangzhou bioscience Co.,Ltd. Address before: 510663 floor 2, building C, building 1, No. 2, Ruitai Road, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee before: Guangzhou bioscience Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A three dimensional porous composite scaffold and its preparation method Effective date of registration: 20210407 Granted publication date: 20190118 Pledgee: Zhongda sub branch of Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Pledgor: GUANGZHOU CHUANGSEED BIOMATERIALS Co.,Ltd.|Guangzhou bioscience Co.,Ltd. Registration number: Y2021440000120 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220713 Granted publication date: 20190118 Pledgee: Zhongda sub branch of Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Pledgor: GUANGZHOU CHUANGSEED BIOMATERIALS CO.,LTD.|Guangzhou bioscience Co.,Ltd. Registration number: Y2021440000120 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A three-dimensional porous composite scaffold and its preparation method Effective date of registration: 20220713 Granted publication date: 20190118 Pledgee: Zhongda sub branch of Bank of Guangzhou Co.,Ltd. Pledgor: GUANGZHOU CHUANGSEED BIOMATERIALS CO.,LTD.|Guangzhou bioscience Co.,Ltd. Registration number: Y2022980010456 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |