CN114324897A - 生产western-blot实验用人内参蛋白的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测western‑blot实验是否成功的方法，在实验中，设置人内参蛋白作为阳性对照组，人内参蛋白具体设置为人GAPDH、β‑Actin或者是β‑Tubulin蛋白。本发明还通过实验确定了人GAPDH、β‑Actin、β‑Tubulin在大肠杆菌中最佳表达条件，并通过后期实验获得大量纯度高的人GAPDH、β‑Actin、β‑Tubulin蛋白。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于western-blot实验用人内参蛋白作为检测阳性对照的制备方法。
背景技术
内参蛋白由于在各组织和细胞中的表达的相对稳定性和广谱性，而被广泛应用于western-blot实验体系的内部参照，校正实验过程中的误差，保证实验结果的准确性，作为空白对照，检测western-blot实验过程中是否正常，并可作为半定量分析的标准。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，β-肌动蛋白(β-Actin),β-微管蛋白(β-Tubulin)为应用最广泛的内参蛋白。
蛋白表达是工业、医疗和基础研究领域的重要技术，按照表达宿主的性质分为原核表达***和真核表达***。原核表达***以大肠杆菌表达***为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后加工机制缺乏如二硫键的形成、蛋白糖基化、蛋白正确折叠。pET***是大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白引用最多的***，其基础表达水平最低，能提供各种不同融合标签和表达***配置。在pET载体中，目的基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号位点之下，通过宿主细胞提供T7 RNA聚合酶来诱导表达。
在做western-blot实验用，所涉及的蛋白质样品，由于样本提取或试剂保存不当原因，可能导致western-blot实验的为阴性，包括内参蛋白的结果都是阴性。而导致内参蛋白结果为阴性的原因，可能是样品中蛋白质由于保存不当而导致降解，或者是实验中所使用的内参蛋白的抗体失效。因此，目前还没有办法确定到底是何种原因导致western-blot实验的为阴性。
发明内容
一种用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，在实验中，设置人内参蛋白作为阳性对照组。
进一步，人内参蛋白具体设置为人GAPDH、β-Actin或者是β-Tubulin蛋白。
进一步，所述人GAPDH基因序列如SEQ ID NO.1所示，β-Actin基因序列如SEQ IDNO.2所示，β-Tubulin基因序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述人内参蛋白采用原核表达***进行表达。
进一步，所述人内参蛋白采用原核表达载体pET-28a(+)作为表达载体。
一种生产western-blot实验用内参蛋白的方法，人内参蛋白为人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin蛋白中的一种，采用原核表达***进行表达。
进一步，所述人内参蛋白采用原核表达载体pET-28a(+)作为表达载体。
进一步，人内参蛋白具体设置为人GAPDH、β-Actin或者是β-Tubulin蛋白。
进一步，所述人GAPDH基因序列如SEQ ID NO.1所示，β-Actin基因序列如SEQ IDNO.2所示，β-Tubulin基因序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，具体步骤包括：
1)分别合成人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin蛋白的基因序列。
2)将人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin基因连接至原核表达载体pET-28a(+)，得到重组质粒pET-28a-hGAPDH、pET-28a-hβ-Actin、pET-28a-β-Tubulin。
3)将上述重组质粒转化感受态大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)，得到含有人内参基因的重组工程菌E.coli Rosetta-gami 2(DE3)/pET-28a-hGAPDH、E.coli Rosetta-gami2(DE3)/pET-28a-hβ-Actin、E.coli Rosetta-gami2(DE3)/pET-28a-hβ-Tubulin；
4)基因工程菌的诱导表达及纯化。
进一步，所述基因工程菌的诱导表达及纯化的步骤如下：
(1)重组人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin的表达：
将上述基因工程菌接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中，37℃200r/min过夜培养活化，将活化后的菌种转接于新鲜的含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中培养，当OD600为0.4-0.6时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，16℃200r/min诱导18h。
(2)重组人GAPDH、β-Actin的纯化：
将发酵人GAPDH、β-Actin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用Binding Buffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次，4℃8000r/min离心30min收集上清，经Ni2+柱纯化收集含目的蛋白的梯度，用超滤管超滤除去咪唑。得到纯化后的人GAPDH、β-Actin蛋白。
(3)重组人β-Tubulin的纯化：
将发酵人β-Tubulin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用Binding Buffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次，4℃8000r/min离心30min收集沉淀，经变性复性纯化蛋白，用超滤管超滤除去复性液。得到纯化后的人β-Tubulin蛋白。
有益效果
一般在western-blot实验用，仅会设置实验组、对照组。若实验组和对照组中的内参单位均未显色，那么就无法知晓是样品蛋白被降解，还是抗体失效。在设置人内参蛋白作为阳性对照组之后，若是样品蛋白被降解，则内参蛋白还能显色。若是内参蛋白的抗体失效，则样品的内参蛋白及单独设置的内参蛋白对照也无法显色。因此，可以快速查明实验失败的原因。原核表达***以大肠杆菌表达***为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点。由于人GAPDH、β-Actin或者是β-Tubulin蛋白与其他物种的内参蛋白具有较高的同源性，因此，通用性好。
本发明通过实验确定人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin在大肠杆菌中最佳表达条件，并通过后期实验获得大量纯度高的人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin蛋白
附图说明
图1为人、小鼠、大鼠、猴、犬、鸡的GAPDH、β-Actin、β-Tubulin氨基酸序列相似性分析。其中，1对应的物种是人，2对应的物种是小鼠，3对应的物种是大鼠，4对应的物种是猴，5对应的物种是犬，6对应的物种是鸡。
图2为GAPDH诱导表达结果图，其中M代表Marker，1代表pET28a(+)未诱导，2代表pET28a(+)诱导，3代表β-Actin1未诱导，4代表β-Actin1诱导全菌37℃，5代表β-Actin1上清37℃，6代表β-Actin1沉淀37℃，7代表β-Actin1上清16℃，8代表β-Actin1沉淀16℃，9代表β-Actin2未诱导，10代表β-Actin2诱导全菌37℃，11代表β-Actin2上清37℃，12代表β-Actin2沉淀37℃，13代表β-Actin2上清16℃，14代表β-Actin2沉淀16℃。
图3为β-Actin诱导表达结果图。其中M代表Marker，1代表pET28a(+)未诱导，2代表pET28a(+)诱导，3代表GAPDH未诱导，4代表GAPDH诱导全菌37℃，5代表GAPDH上清37℃，6代表GAPDH沉淀37℃，7代表GAPDH上清16℃，8代表GAPDH沉淀16℃，9代表GAPDH未诱导，10代表GAPDH诱导全菌37℃，11代表GAPDH上清37℃，12代表GAPDH沉淀37℃，13代表GAPDH上清16℃，14代表GAPDH沉淀16℃。
图4为β-Tubulin诱导表达结果图。其中，M代表Marker，1代表pET28a(+)诱导，2代表β-Tubulin未诱导，3代表β-Tubulin诱导全菌，4代表β-Tubulin上清，5代表β-Tubulin沉淀，6代表β-Tubulin未诱导，7代表β-Tubulin诱导全菌，8代表β-Tubulin上清，9代表β-Tubulin沉淀，10代表β-Tubulin未诱导，11代表β-Tubulin诱导全菌，12代表β-Tubulin上清，13代表β-Tubulin沉淀。
图5为GAPDH纯化结果图。其中，从左到右，各样品分别为M代表Marker，1代表诱导全菌，2代表破碎后上清，3代表流穿液，4代表20mM咪唑洗杂，5代表250mM咪唑第1管，6代表250mM咪唑第3管，7代表250mM咪唑第5管，8代表250mM咪唑第7管，9代表250mM咪唑第9管，10代表250mM咪唑第11管，11代表250mM咪唑第13管，12代表250mM咪唑第15管，13代表500mM咪唑第19管，14代表500mM咪唑第1管。
图6为β-Actin纯化结果图。其中，从左到右，各样品分别为：M代表Marker，1代表诱导全菌，2代表破碎后上清，3代表流穿液，4代表20mM咪唑洗杂，5代表250mM咪唑第1管，6代表250mM咪唑第3管，7代表250mM咪唑第5管，8代表250mM咪唑第7管，9代表250mM咪唑第9管，10代表250mM咪唑第11管，11代表250mM咪唑第13管，12代表250mM咪唑第15管，13代表500mM咪唑第19管，14代表500mM咪唑第1管。
图7为β-Tubulin纯化。其中，M代表Marker，1代表β-Tubulin变性沉淀，2代表β-Tubulin复性。
图8为GAPDH，β-Actin，β-Tubulin纯化效果图。其中1代表β-Aubulin变性沉淀，2代表GAPDH，3代表β-Tubulin。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例一
1、不同物种的内参蛋白序列分析。
分别将人、小鼠、大鼠、猴、犬、鸡的GAPDH、β-Actin、β-Tubulin蛋白质的氨基酸序列相似性进行比较分析，分析结果如图1所示。其中1对应的物种是人，2对应的物种是小鼠，3对应的物种是大鼠，4对应的物种是猴，5对应的物种是犬，6对应的物种是鸡。
通过比对分析发现，人与其他物种内参蛋白序列均有较高的同源性。
2、重组人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin基因的合成
参照NCBI公布的GAPDH(ACCESSION NUMBER:NM_002046.7)、β-Actin(ACCESSIONNUMBER:X00351.1)、β-Tubulin编码序列(ACCESSION NUMBER:U83668.1)，将该优化的基因序列交给南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并克隆至原核表达载体pET-28a(+)。
其中人GAPDH基因序列如SEQ ID NO.1所示，β-Actin基因序列如SEQ ID NO.2所示，β-Tubulin基因序列如SEQ ID NO.3所示。
3、基因工程菌株的构建
以原核表达载体pET-28a(+)作为表达载体，分别将人工合成的人的GAPDH、β-Actin、β-Tubulin基因片段用限制性内切酶进行酶切后，连接至采用相同酶切处理后的pET-28a(+)载体中，分别获得重组质粒pET-28a-hGAPDH、pET-28a-hβ-Actin、pET-28a-β-Tubulin。再将上述连接产物(即重组表达质粒)转化感受态大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)，得到含有人内参基因的重组工程菌E.coli Rosetta-gami 2(DE3)/pET-28a-hGAPDH、E.coli Rosetta-gami 2(DE3)/pET-28a-hβ-Actin、E.coli Rosetta-gami2(DE3)/pET-28a-hβ-Tubulin。
4、基因工程菌的诱导表达及纯化
(1)重组人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin的表达：
将上述基因工程菌接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中，37℃200r/min过夜培养活化。将活化后的菌种转接于新鲜的含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中培养。当OD600为0.4-0.6时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，16℃200r/min诱导18h。
为摸索出最佳的诱导表达的温度，同时设置37℃的诱导温度。
(2)重组人GAPDH、β-Actin的纯化：
将发酵人GAPDH、β-Actin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用Binding Buffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次。4℃8000r/min离心30min收集上清，经Ni2+柱纯化收集含目的蛋白的梯度，用超滤管超滤除去咪唑。得到纯化后的人GAPDH、β-Actin蛋白。
(3)重组人β-Tubulin的纯化：
将发酵人β-Tubulin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用Binding Buffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次。4℃8000r/min离心30min收集沉淀，经变性复性纯化蛋白，用超滤管超滤除去复性液。得到纯化后的人β-Tubulin蛋白。
从图2、3、4可以看出，诱导表达中设置了16℃、37℃等多个诱导温度，对诱导表达的产物分为沉淀物和上清液，分配进行SDS-PAGE分析，对比不同诱导温度下的表达效率，及表达产物在沉淀物和上清液中的分布情况。
从图中的表达结果可以看出，本发明中所选择的条件下，GAPDH、β-Actin、β-Tubulin的表达效率最高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，在实验中，设置人内参蛋白作为阳性对照组。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，人内参蛋白具体设置为人GAPDH、人β-Actin或者是人β-Tubulin蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，所述人GAPDH基因序列如SEQ ID NO.1所示，人β-Actin基因序列如SEQ ID NO.2所示，人β-Tubulin基因序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，所述人内参蛋白采用原核表达***进行表达。
5.根据权利要求4所述的用于检测western-blot实验是否成功的方法，其特征在于，所述人内参蛋白采用原核表达载体pET-28a(+)作为表达载体。
6.一种生产western-blot实验用人内参蛋白的方法，其特征在于，重组人内参蛋白为人GAPDH、人β-Actin、人β-Tubulin蛋白中的一种，采用原核表达***进行表达，所述内参蛋白采用原核表达载体pET-28a(+)作为表达载体。
7.根据权利要求6所述的生产western-blot实验用人内参蛋白的方法，其特征在于，人内参蛋白具体设置为人GAPDH、人β-Actin或者是人β-Tubulin蛋白。
8.根据权利要求6所述的生产western-blot实验用人内参蛋白的方法，其特征在于，所述人GAPDH基因序列如SEQ ID NO.1所示，人β-Actin基因序列如s SEQ ID NO.2所示，人β-Tubulin基因序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求6所述的生产western-blot实验用人内参蛋白的方法，其特征在于，具体步骤包括：
1)分别合成人GAPDH、人β-Actin、人β-Tubulin蛋白的基因序列；
2)将人GAPDH、人β-Actin、人β-Tubulin基因连接至原核表达载体pET-28a(+)，得到重组质粒pET-28a-hGAPDH、pET-28a-hβ-Actin、pET-28a-β-Tubulin；
3)将上述重组质粒转化感受态大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)，得到含有人内参基因的重组工程菌E.coli Rosetta-gami 2(DE3)/pET-28a-hGAPDH、E.coli Rosetta-gami 2(DE3)/pET-28a-hβ-Actin、E.coli Rosetta-gami2(DE3)/pET-28a-hβ-Tubulin；
4)基因工程菌的诱导表达及纯化。
10.根据权利要求6所述的生产western-blot实验用人内参蛋白的方法，其特征在于，
所述基因工程菌的诱导表达及纯化的步骤如下：
(1)重组人GAPDH、β-Actin、β-Tubulin的表达：
将上述基因工程菌接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中，37℃200r/min过夜培养活化，将活化后的菌种转接于新鲜的含卡那霉素浓度为50μg/mL的液体LB培养基中培养，当OD600为0.4-0.6时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，16℃200r/min诱导18h；
(2)重组人GAPDH、β-Actin的纯化：
将发酵人GAPDH、β-Actin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用BindingBuffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次，4℃8000/min离心30min收集上清，经Ni2+柱纯化收集含目的蛋白的梯度，用超滤管超滤除去咪唑，得到纯化后的人GAPDH、β-Actin蛋白；
(3)重组人β-Tubulin的纯化：
将发酵人β-Tubulin融合蛋白的菌液离心，收集菌体用Binding Buffer重悬，4℃1000bar高压破碎菌体，重复破碎2次，4℃8000r/min离心30min收集沉淀，经变性复性纯化蛋白，用超滤管超滤除去复性液，得到纯化后的人β-Tubulin蛋白。
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