CN112469406A - 硬脂酸用于预防或治疗肺纤维化的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的组合物，所述组合物包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药作为活性成分。此外，本发明涉及用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，所述组合物包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药以及肺纤维化抑制剂作为活性成分。根据本发明，可以通过共施用常规肺纤维化抑制剂和硬脂酸来诱导更优异的治疗效果，以及通过使用硬脂酸，可以增强对所述常规肺纤维化抑制剂的敏感性，并且可以降低患者中发生的药物副作用，并且甚至对于显示出对所述常规肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化，也预期可以实现优异的治疗效果。

Description

硬脂酸用于预防或治疗肺纤维化的用途
技术领域
本发明涉及包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药；以及肺纤维化抑制剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗肺纤维化的用途。
背景技术
纤维化是指器官的一部分由于某种原因而硬化的现象，并且肺纤维化和肝纤维化被认为是代表性疾病。当慢性炎症在肝脏中反复时，肝脏变成肝硬化，它硬化，并且正如肝脏失去其功能一样，肺也受到除炎症和纤维化发生以外的其它因素的极大影响，并且由于肺的功能逐渐丧失，供给到全身的氧减少，因此其它器官的功能也降低。在肺纤维化的特征中，通常提出TGF-β将肺成纤维细胞改变为肌成纤维细胞表型的机制，并且如由细胞外基质(ECM)的过度累积所定义的组织纤维化是在由于各种原因导致的肺病中也观察到的常见病理学发现(European Respiratory Journal 2013-1271:1207-120)。
各种类型的肝病导致肝纤维化，最终导致肝硬化。尽管刺激的类型是不同的，例如乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病和非酒精性肝病，但对肝脏的慢性损伤导致炎症反应，并且通过细胞外基质的累积，正常的肝实质转化为诸如再生性结节和疤痕的组织，导致纤维化。以前，肝纤维化和肝硬化被称为不可逆反应，但最近有许多报道表明，当消除肝损伤的原因或治疗肝损伤时，肝硬化也可以得到改善。
相比之下，在诸如特发性肺纤维化的疾病中发现的肺纤维化是由于受损的正常伤口愈合过程引起的细胞外基质的过度累积导致的。也就是说，与由炎症反应导致的肝纤维化和肝硬化不同，即使在肺纤维化中没有证实的炎症反应，也会发生纤维化。目前，有两种FDA批准的用于特发性肺纤维化的治疗剂(吡非尼酮和尼达尼布)，并且已经证实这些药物可减缓肺纤维化的进展，但没有证据表明该药物将改善肺纤维化，并且中断或改善疾病本身进展的治疗剂尚未商业化。此外，在吡非尼酮和尼达尼布的情况下，90％或更多的服用药物的患者经历副作用，并且20％至30％的患者在一年后停止使用药物。因此，迫切需要开发具有很少副作用同时中断或改善肺纤维化进展的药物。
上述背景技术中描述的内容仅用于改进对本发明背景的理解的目的，并且不应被认为是承认它们对应于本领域技术人员已知的相关技术。
公开内容
技术问题
由于克服现有肺纤维化抑制剂作为治疗剂的局限性和副作用的大量努力，本申请的发明人证实了当作为内源性脂肪酸的硬脂酸与现有的肺纤维化抑制剂在体内共施用时，可以改善现有的副作用，例如体重减轻，并且可以显著改善各种纤维化指标，从而完成本发明。
因此，本发明的一个目的是提供用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及肺纤维化抑制剂作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于预防或改善肺纤维化的食品组合物，所述组合物包含：硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及肺纤维化抑制剂作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供对肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化的治疗助剂，所述助剂包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于抑制肺纤维化抑制剂的副作用的药物组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于提供关于是否共施用硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药的信息的方法。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可以根据以下描述清楚地理解未提及的其它问题。
技术方案
为了实现本发明的目的，本发明提供了用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
作为本发明的示例性实施方案，所述肺纤维化抑制剂可以选自：吡非尼酮、尼达尼布、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(复方新诺明)、重组人正五聚蛋白-2蛋白(PRM-151)、若奇单抗(SAR156597)、潘瑞鲁单抗(pamrevlumab)、BG00011、曲前列环素、TD139、CC-90001、2-((2-乙基-6-(4-(2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)-8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-4-(4-氟苯基)噻唑-5-甲腈)(GLPG1690)、氯沙坦、四硫代钼酸盐、来瑞组单抗、齐留通、癸酸诺龙、雷帕霉素、依维莫司、维莫德吉、非苏木单抗、奥米利塞(GSK2126458)、(3S)-3-[3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]-4-{(3S)-3-[2-(5,6,7,8-四氢-1,8-二氮杂萘-2-基]乙基]-1-吡咯烷基}丁酸(GSK3008348)、利妥昔单抗、奥曲肽、2-[3-[4-(1H-吲唑-5-基氨基)-2-喹唑啉基]苯氧基]-N-(1-甲基乙基)-乙酰胺(KD025)、泰鲁司特(MN-001)、BBT-877、OLX201、DWN12088以及它们的盐。
作为本发明的另一个示例性实施方案，所述肺纤维化可以是特发性肺纤维化(IPF)。
作为本发明的另一个示例性实施方案，与没有肺纤维化的情况相比，上述肺纤维化可以由于TGF-β而具有增加的肺成纤维细胞活化和增加的肺上皮细胞损失。
作为本发明的另一个示例性实施方案，与没有肺纤维化的情况相比，肺纤维化可以在肺成纤维细胞中具有增加的两种纤维化标志物：胶原1(COL-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。
此外，本发明提供了用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，所述组合物包含(i)硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂作为活性成分。
作为本发明的示例性实施方案，硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药与吡非尼酮可以以1:0.5至1:25的摩尔浓度比包含在所述组合物中。
作为本发明的另一个示例性实施方案，硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药与尼达尼布可以以1:0.01至1:5的摩尔浓度比包含在所述组合物中。
另外，本发明提供了对肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化的治疗助剂，所述助剂包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
此外，本发明提供了用于抑制肺纤维化抑制剂的副作用的药物组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
此外，本发明提供了用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括：向个体施用包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分的组合物。
另外，本发明提供了用于预防或治疗肺纤维化的方法，所述方法包括：向个体施用(i)硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂。
此外，本发明提供了用于抑制肺纤维化抑制剂的副作用的方法，所述方法包括：向个体施用包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分的组合物。
有益效果
本申请的发明人证实了硬脂酸作为肺纤维化的诊断标志物和治疗靶标的抗纤维化作用，并且证实了与上述单独的抑制剂相比，通过基于抗纤维化作用共施用肺纤维化抑制剂吡非尼酮或尼达尼布与硬脂酸，发生了更优异的抗纤维化作用。因此，根据本发明，可以通过共施用常规肺纤维化抑制剂和硬脂酸来诱导更优异的治疗效果，以及通过使用硬脂酸，可以增强对所述常规肺纤维化抑制剂的敏感性，并且可以降低患者中发生的药物副作用，并且甚至对于显示出对所述常规肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化，也预期可以实现优异的治疗效果。
附图说明
图1示出了人肺组织(正常：来源于正常组患者的肺组织，n＝10；IPF：来自特发性肺纤维化患者的肺组织，n＝10)。
图2示出了表现出基于图1的人肺组织中的游离脂肪酸的定量结果，通过将硬脂酸的量除以具有14个至18个碳原子的游离脂肪酸的量而获得的值的结果(正常：来源于正常组患者的肺组织，n＝10；IPF：来自特发性肺纤维化患者的肺组织，n＝10)。
图3A示出了当用TGF-β和硬脂酸(SA)一起处理细胞时硬脂酸对通过TGF-β导致的成纤维细胞活化表现出效果的结果。
图3B示出了当用TGF-β和硬脂酸(SA)一起处理细胞时硬脂酸对通过TGF-β导致的上皮细胞损失表现出效果的结果。
图4A示出了表现出由硬脂酸导致的胶原1(胶原1/肌动蛋白)(其是成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果(此处，胶原1/肌动蛋白表示通过用肌动蛋白(其是细胞内对照蛋白)校正胶原1蛋白的量而获得的值)。
图4B示出了表现出由硬脂酸导致的α-SMA(α-SMA/肌动蛋白)(其是成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果(此处，α-SMA/肌动蛋白表示通过用肌动蛋白(其是细胞内对照蛋白)校正α-SMA蛋白的量而获得的值)。
图5A示出了当用不同浓度的棕榈酸(PA)处理细胞时对成纤维细胞活化表现出效果的结果。
图5B示出了当用不同浓度的棕榈酸(PA)处理细胞时对上皮细胞损失表现出效果的结果。
图6A示出了表现出由棕榈酸(PA)导致的胶原1(胶原1/肌动蛋白)(其是成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果。
图6B示出了表现出由棕榈酸(PA)导致的α-SMA(α-SMA/肌动蛋白)(其是成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果。
图7A示出了当用TGF-β处理、用棕榈酸处理、用硬脂酸处理、用TGF-β和硬脂酸共处理以及用棕榈酸和硬脂酸共处理肺成纤维细胞(CTL：对照，TGF-b:TGF-β5ng/mL处理组，PA：棕榈酸10uM/mL处理组，SA：硬脂酸40uM/mL处理组，TGF-b+SA：TGF-β5ng/mL+硬脂酸40uM/mL组合的处理组，PA+SA：棕榈酸10uM/mL+硬脂酸40uM/mL组合的处理组)时，表现出胶原1(胶原1/肌动蛋白)(其是肺成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果。
图7B示出了当在与图7A相同的条件下，用TGF-β处理、用棕榈酸处理、以及用硬脂酸处理、用TGF-β和硬脂酸共处理以及用棕榈酸和硬脂酸共处理肺成纤维细胞时，表现出α-SMA(α-SMA/肌动蛋白)(其是肺成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果。
图8A示出了当用TGF-β处理、用油酸(OA)处理、以及用硬脂酸处理、用TGF-β和硬脂酸共处理以及用油酸和硬脂酸共处理肺成纤维细胞(CTL：对照，TGF-b:TGF-β5ng/mL处理组，OA：油酸40uM/mL处理组，SA：硬脂酸40uM/mL处理组，TGF-b+SA：TGF-β5ng/mL+硬脂酸40uM/mL组合的处理组，OA+SA：油酸40uM/mL+硬脂酸40uM/mL组合的处理组)时，胶原1(胶原1/肌动蛋白)(其是肺成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化。
图8B示出了当在与图8A相同的条件下，用TGF-β处理、用油酸(OA)处理、以及用硬脂酸处理、用TGF-β和硬脂酸共处理以及用油酸和硬脂酸共处理肺成纤维细胞时，表现出α-SMA(α-SMA/肌动蛋白)(其是肺成纤维细胞中纤维化的标志物)作为与对照(CTL)的相对值的变化的结果。
图9A示出了在由博来霉素(正常对照(Con,n＝4)、博来霉素单次施用组(Bleo,n＝5)、硬脂酸施用组(SA,n＝4)、博来霉素+硬脂酸施用组(Bleo+SA,n＝6)诱导的肺纤维化动物模型中，在施用硬脂酸后测量小鼠体重变化的结果。(**p<0.01和*p<0.05是当与对照比较时的p值。#p<0.05是当与博来霉素处理组比较时的p值)。
图9B示出了在与图9A相同的肺纤维化动物模型中施用硬脂酸后小鼠的肺组织染色(H&E)的结果。
图9C示出了在与图9A相同的肺纤维化动物模型中施用硬脂酸后测量和比较羟脯氨酸含量的结果。
图9D示出了在与图9A相同的纤维化肺纤维化动物模型中施用硬脂酸后测量肺组织中α-SMA表达水平的结果。
图9E示出了在与图9A相同的纤维化肺纤维化动物模型中施用硬脂酸后测量肺组织中p-Smad2/3表达水平的结果。
图9F示出了在与图9A相同的纤维化肺纤维化动物模型中施用硬脂酸后测量血清中TGF-β1变化的结果。
图10A示出了通过免疫印迹，根据增加人原代成纤维细胞中硬脂酸的处理浓度，表现出抑制作为纤维化标志物的胶原1和α-SMA的表达效果的结果。
图10B示出了通过倍数诱导(fold induction)，根据增加人原代成纤维细胞中硬脂酸的处理浓度，比较抑制作为纤维化标志物的胶原1和α-SMA的表达效果的结果。
图10C示出了根据从4名患者获得的原代成纤维细胞中用硬脂酸处理，表现出对作为纤维化标志物的胶原1和α-SMA的抑制效果的结果。
图10D示出了通过免疫印迹，根据针对TGF-β刺激的硬脂酸处理，表现出对作为纤维化标志物的胶原1和α-SMA的抑制效果的结果。
图10E示出了通过倍数诱导，根据针对TGF-β刺激的硬脂酸处理，比较作为纤维化标志物的胶原1和α-SMA的抑制效果的结果(*p<0.05是当与对照相比时的p值，以及#p<0.05是与博来霉素处理组相比时的p值)。
图11A示出了通过免疫印迹测量上皮细胞中由硬脂酸引起的E-钙粘蛋白表达变化的结果。
图11B示出了在上皮细胞中由硬脂酸引起的E-钙粘蛋白作为与对照(CTL)的相对值(E-钙粘蛋白/肌动蛋白)表达的变化(*p<0.05是当与对照相比时的p值，以及#p<0.05是当与博来霉素处理组相比时的p值)。
图12A示出了通过免疫印迹根据在成纤维细胞中用硬脂酸处理测量p-Smad2/3和Smad7蛋白表达的结果。
图12B示出了通过倍数诱导根据在成纤维细胞中用硬脂酸处理比较p-Smad2/3和Smad7蛋白表达的结果。
图12C示出了在用硬脂酸和/或TGF-β1处理后测量ROS变化的结果。
图12D示出了根据用TGF-β1和/或抗氧化剂(NAC)处理测量p-Smad2/3表达变化的结果。
图13示出了由于根据在人来源的原代成纤维细胞中用硬脂酸和吡非尼酮的组合处理证实了抗纤维化效果的结果，用TGF-β(5ng/ml)、硬脂酸(40μM)和/或吡非尼酮(400或800μM)处理细胞，然后测量作为纤维化标志物的胶原1(COL-1)和α-SMA的表达水平，以及定量分析胶原1(COL-1)和α-SMA中每一种的抑制效率的结果。(TGF：TGF-β单一处理组，TGF+PIR：TGF-β和吡非尼酮处理组，TGF+Combi：TGF-β和吡非尼酮+硬脂酸组合处理组)。
图14示出了按照与图13相同的方式，根据用硬脂酸和吡非尼酮的组合处理，证实了对人成纤维细胞系MRC-5的抗纤维化效果的结果。
图15示出了由于根据在人肺上皮细胞系BEAS-2B中用硬脂酸和吡非尼酮的组合处理证实了抗纤维化效果的结果，用TGF-β(5ng/ml)、硬脂酸(40μM)和/或吡非尼酮(800μM)处理细胞，然后用EMT标志物测量作为肺纤维化指标之一的纤连蛋白的表达，以及定量分析其抑制作用的结果(TGF：TGF-β单一处理组，TGF+PIR：TGF-β和吡非尼酮处理组，TGF+Combi：TGF-β和吡非尼酮+硬脂酸组合处理组)。
图16A示出了通过在施用硬脂酸和吡非尼酮中的每一种或共施用硬脂酸和吡非尼酮后测量体重变化以及在施用后第21天定量分析结果而表现出的结果，以证实在通过施用博来霉素诱导肺纤维化的动物模型中硬脂酸和吡非尼酮的组合施用的抗纤维化效果(Ctrl：正常对照，Bleo：博来霉素单一施用组，Bleo+PIR(P)：博来霉素和吡非尼酮施用组，Bleo+SA：博来霉素和硬脂酸施用组，Bleo+P+SA(或Bleo+combi)：博来霉素和吡非尼酮+硬脂酸组合施用组)。
图16B示出了测量在施用硬脂酸和/或吡非尼酮的上述动物模型中的羟基脯氨酸水平以及定量分析和比较羟脯氨酸水平的结果(Ctrl：正常对照，Bleo：博来霉素单一施用组，Bleo+PIR：博来霉素和吡非尼酮施用组，Bleo+SA：博来霉素和硬脂酸施用组，Bleo+P+S(或Bleo+combi)：博来霉素和吡非尼酮+硬脂酸组合施用组)。
图17A示出了用TGF-β(5ng/ml)、硬脂酸(40μM)和/或尼达尼布(1.5μM或2μM)处理人来源的原代成纤维细胞以及测量作为纤维化标志物的胶原1(COL-1)和α-SMA的表达水平的结果，以证实根据在人来源的原代成纤维细胞中硬脂酸和尼达尼布的组合处理的抗纤维化效果。
图17B示出了用TGF-β(5ng/ml)、硬脂酸(40μM)和/或尼达尼布(2μM)处理人来源的原代成纤维细胞，测量胶原1(COL-1)和α-SMA的表达水平，以及定量分析COL-1的抑制效率的结果。(TGF：TGF-β单一处理组，TGF+NIN：TGF-β和尼达尼布处理组，TGF+Combi：TGF-β和尼达尼布+硬脂酸组合处理组)。
发明模式
本申请的发明人已经努力寻求一种方法，该方法能够克服作为现有肺纤维化抑制剂的治疗剂的局限性(其减慢纤维化的进展，但没有实质的治疗效果)以及各种副作用例如体重减轻，结果本申请的发明人已经发现当在体内施用硬脂酸(其是内源性脂肪酸)时克服上述现有治疗剂的局限性的可能性。
如本发明中所用的，术语“肺纤维化”可以用于意指以下的任何疾病，其中肺组织是纤维化，从而诱导呼吸障碍，但可以是例如以肺纤维化为特征的特发性肺纤维化(IPF)、间质性肺病例如特发性间质性肺炎和***疾病相关的间质性肺病、或过敏性肺炎，更优选特发性肺纤维化(IPF)。
根据本发明的优选示例性实施方案，与不存在肺纤维化的情况相比，肺纤维化具有由TGF-β引起的增加的肺成纤维细胞活化和增加的肺上皮细胞损失，或者肺成纤维细胞中增加的胶原1(COL-1)和α-SMA，并且可以一起表现出上述特征。
特发性肺纤维化也被称为特发性肺纤维化，并且是指这样的疾病，其是在没有已知原因的情况下由于肺泡壁的反复损伤和伤口恢复过程中的异常而导致的成纤维细胞和胶原的沉积增加而引起的肺组织结构变化，并且逐渐加重肺功能障碍，因此在症状严重的情况下导致死亡。
在本发明的示例性实施方案中，如图1中可以看到的，证实了与正常组织中的那些含量相比，纤维化组织中具有16至18个碳原子的饱和或不饱和游离脂肪酸(例如棕榈烯酸、棕榈酸、亚麻酸、油酸、硬脂酸等)，例如硬脂酸的含量表现出显著的差异。特别地，证实了与正常组织相比，纤维化组织中硬脂酸的含量显著降低，并且与正常组织中的那些含量相比，纤维化组织中亚麻酸和油酸，优选棕榈烯酸、棕榈酸、亚麻酸和油酸的含量增加。
此外，本申请的发明人着眼于如上所述的纤维化组织中硬脂酸含量的降低(缺乏)，并证实了通过施用硬脂酸可以获得纤维化治疗效果(参见图3至12)。因此，基于这些结果，本申请的发明人提出使用硬脂酸作为肺纤维化，例如特发性肺纤维化的治疗剂。
具体地，本发明提供了用于治疗、改善和/或预防纤维化的组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。活性成分意指发挥期望效果，例如用于治疗、改善和/或预防纤维化的效果的成分。
在本发明中，硬脂酸可以包括具有18个碳链的式C17H35CO2H的十八烷酸和其中上式的一个或多个氢原子被取代的衍生物或前药。
如本文所用，术语前药是指物理和化学特性通过化学改变药物来调节的药物，并且意指尽管前药本身不显示出生理活性，但施用后的前药化学地或通过体内的酶的作用变为原始药物以发挥其药物作用，并且本发明中的前药可以包括硬脂酸的前药，其能够表现出与体内的硬脂酸相同或非常相似的作用。
硬脂酸可以通过根据预期用途通过本领域已知的各种方法引入取代基来制备为衍生物或前药，并且应理解为包括在本发明的范围内。衍生物或前药的实例包括硬脂酸甲酯、硬脂酸乙酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸乙烯酯、硬脂酸十八醇脂、三乙醇胺硬脂酸酯、三硬脂酸甘油酯、异硬脂酸异丙酯、乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、PEG化硬脂酸酯、L-抗坏血酸6-硬脂酸酯、硬脂酸2-丁氧基乙酯、硬脂酸4-硝基苯基酯、硬脂酸月桂酯、硬脂酸异辛酯、硬脂酸胆甾醇酯等，但不限于此。
根据本发明的方面，本发明提供了用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
在本发明中，术语肺纤维化抑制剂用于意指包括肺纤维化的治疗剂，是指中断、延迟、预防、改善或治疗肺纤维化进展的药物，并且可以优选地选自：吡非尼酮、尼达尼布、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(复方新诺明)、重组人正五聚蛋白-2蛋白(PRM-151)、若奇单抗(SAR156597)、潘瑞鲁单抗、BG00011、曲前列环素、TD139、CC-90001、2-((2-乙基-6-(4-(2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)-8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-4-(4-氟苯基)噻唑-5-甲腈)(GLPG1690)、氯沙坦、四硫代钼酸盐、来瑞组单抗、齐留通、癸酸诺龙、雷帕霉素、依维莫司、维莫德吉、非苏木单抗、奥米利塞(GSK2126458)、(3S)-3-[3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]-4-{(3S)-3-[2-(5,6,7,8-四氢-1,8-二氮杂萘-2-基]乙基]-1-吡咯烷基}丁酸(GSK3008348)、利妥昔单抗、奥曲肽、2-[3-[4-(1H-吲唑-5-基氨基)-2-喹唑啉基]苯氧基]-N-(1-甲基乙基)-乙酰胺(KD025)、泰鲁司特(MN-001)、BBT-877、OLX201、DWN12088以及它们的盐。
根据本发明的示例性实施方案，本申请的发明人通过使用其中纤维化标志物指标(COL-1和/或α-SMA)被抑制、EMT被抑制和/或肺纤维化被诱导的动物模型实验式地证实了与用现有的肺纤维化抑制剂，例如，单独的吡非尼酮或尼达尼布处理细胞相比，当共施用硬脂酸时，抗纤维化作用显著增加(参见图13至17)。
因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，所述组合物包含(i)硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；和(ii)肺纤维化抑制剂作为活性成分。
在本发明中，硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药与吡非尼酮可以以1:0.5至1:25，优选1:1至1:23，更优选1:5至1:22，甚至更优选1:8至1:21，最优选1:10至1:20的摩尔浓度比包含在组合物中。
在本发明中，硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药与尼布尼达可以以1:0.01至1:5，优选1:0.02至1:1，更优选1:0.025至1:0.5，甚至更优选1:0.03至1:0.1，最优选1:0.03至1:0.05的摩尔浓度比包含在组合物中。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物来抑制肺纤维化或延迟肺纤维化发作的所有作用。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物来改善或有益地改变由肺纤维化导致的症状的所有作用。
如本文所用，术语“盐”或“药学上可接受的盐”是指化合物的形成，其不会在施用了所述化合物的有机体中引起严重的刺激并且不会损害所述化合物的生物活性和物理特性。可以通过使本发明的化合物与无机酸，例如盐酸、溴酸、硫酸、硝酸和磷酸、磺酸(例如甲磺酸、乙磺酸和对甲苯磺酸)和有机碳酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、癸酸、异丁酸、丙二酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸和水杨酸反应来获得药用盐。此外，还可以通过使本发明的化合物与碱反应以形成铵盐，碱金属盐例如钠盐或钾盐，盐例如碱土金属盐例如钙盐或镁盐，有机碱的盐例如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺和三(羟甲基)甲胺以及氨基酸盐，例如精氨酸和赖氨酸来获得药用盐，并且更优选地，硬脂酸盐的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸锂、硬脂酸锡(II)等，但不限于此。
药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于药物制剂中，并且可以是选自以下的一种或多种：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。除了上述成分外，药物组合物还可以包含选自通常用于制备药物组合物的稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等中的一种或多种。
药物组合物、或活性成分硬脂酸、或硬脂酸的盐、或硬脂酸的前药可以口服或肠胃外施用。在肠胃外施用的情况下，药物组合物或活性成分可以通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用等施用。
如本文所用，术语“药学上有效的量”是指能够发挥药学上有意义作用的活性成分的量。用于单剂量的活性成分的药学上有效的量可以根据因素以各种方式规定，所述因素例如配制方法，施用方法，患者的年龄、体重、性别或疾病状况，饮食，施用时间，施用间隔、施用途径、***速率和反应敏感性。例如，用于单剂量的硬脂酸的药学上的有效量的范围可以是0.0001mg/kg至200mg/kg、0.001mg/kg至100mg/kg或0.02mg/kg至10mg/kg，但不限于此，先前许可的药物吡非尼酮和尼达尼布或其他众所周知的肺纤维化抑制剂可以以先前许可或本领域已知的有效量一起使用，并且对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明中公开的使用实例和比例，可以比单独施用时更多或更少地调节剂量。
药物组合物、或活性成分硬脂酸、或硬脂酸的盐、或硬脂酸的前药、或肺纤维化抑制剂可以配制成在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液的形式，或者配制成提取物、酸、粉末、颗粒、片剂、胶囊等的形式，并且还可以包含用于配制的分散剂或稳定剂。
另外，本发明提供了用于预防或治疗肺纤维化的方法，所述方法包括：向个体施用(i)硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂。
在本发明中，多种成分例如硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及肺纤维化抑制剂可以一起或单独配制，并且还可以同时地、依次地或单独地施用至个体。
进行预防和/或治疗的个体可以是哺乳动物，例如灵长类动物，包括人、猴子等；啮齿动物，包括小鼠，大鼠等，或者从其活的有机体中分离的细胞或组织。在实例中，对象是罹患肺纤维化的哺乳动物，例如特发性肺纤维化，例如灵长类动物，包括人、猴子等；啮齿动物，包括小鼠、大鼠等，或者从其活的有机体中分离的细胞或组织。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或治疗肺纤维化的食品组合物，所述组合物包含(i)硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂作为活性成分。
当本发明的组合物被制备成食品组合物时，本发明的组合物可以包含通常在食品生产期间添加的成分，并且可以包括例如蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养物、调味品和调味剂。上述碳水化合物的实例包括典型的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，例如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇。作为调味剂，可以使用天然调味剂(索马甜、甜叶菊提取物[例如，莱苞迪甙A、甘草甜素等])和/或合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
例如，当本发明的食品组合物被制备成饮料时，所述组合物还可以包含柠檬酸、液体果糖、糖、蔗糖、乙酸、苹果酸、果汁、豆类提取物、大枣提取物、甘草提取物等。
如本文所用，术语“盐”是指活性成分的形成，其不会在施用了所述活性成分的有机体中引起严重的刺激并且不会损害所述活性成分的生物活性和物理特性。可以通过使本发明的活性成分与无机酸，例如盐酸、溴酸、硫酸、硝酸和磷酸、磺酸(例如甲磺酸、乙磺酸和对甲苯磺酸)和有机碳酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、癸酸、异丁酸、丙二酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸和水杨酸反应来获得所述盐。此外，还可以通过使本发明的活性成分与碱反应以形成铵盐，碱金属盐例如钠盐或钾盐，盐例如碱土金属盐例如钙盐或镁盐，有机碱的盐例如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺和三(羟甲基)甲胺以及氨基酸盐，例如精氨酸和赖氨酸来获得所述盐，但不限于此。
本发明的食品组合物可以用作人类食品、动物饲料、饲料添加剂等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了对肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化的治疗助剂，所述助剂包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
尽管持续施用，但现有的肺纤维化抑制剂(例如吡非尼酮或尼达尼布)可能不显示出纤维化的期望延迟、改善或治疗效果。此外，作为本发明的示例性实施方案，尽管施用上述肺纤维化抑制剂，但纤维化指标的显著改善可能是不显著的。如上所述，当本发明的硬脂酸或其盐用作治疗助剂时，其对纤维化指标如COL-1和α-SMA显示出显著的改善效果，因此可对纤维化显示出期望的改善和/或治疗效果。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于提供关于是否共施用硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药的信息的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)证实从施用了肺纤维化抑制剂的患者中分离出的肺成纤维细胞中纤维化标志物胶原1(COL-1)和α-SMA的表达水平；
(b)通过用肺纤维化抑制剂和硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药共处理肺成纤维细胞来证实胶原1和α-SMA的表达水平；以及
(c)确定在将肺纤维化抑制剂与硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药组合处理的情况下，当胶原1和α-SMA的表达水平降低时，可以施用硬脂酸或其盐。
在本发明中，患者不受限制，并且优选为哺乳动物，更优选为选自人、大鼠、猴子、狗、猫、牛、马、猪、绵羊和山羊的哺乳动物，最优选人。
包括在本发明方法中的肺成纤维细胞不受限制，只要它们是从患者中天然分离的或人工分离的并且包括患者的纤维化标志物相关遗传信息即可。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于抑制肺纤维化抑制剂的副作用的药物组合物，所述组合物包含硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药作为活性成分。
根据本发明，包含本发明的硬脂酸、硬脂酸的盐或硬脂酸的前药的组合物可以表现出抑制现有肺纤维化抑制剂所表现出的副作用(例如体重减轻)的效果。
在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易地理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例
实施例1.实验准备和实验方法
1-1.肺组织样品的制备
使用TissueLyzer(Qiagen)均质化50mg或更少(约50mg)的患有人类特发性肺纤维化的患者(n＝10)和正常人(n＝10)的每个肺组织(肺组织购自首尔的首尔峨山医院(AsanMedical Center)的生物资源中心(Bio-Resource Center)，或者由临床研究人员根据伦理委员会(Institutional Review Board(IRB))程序收集)，向其中加入少量盐酸，使得浓度为25mM，然后使用异辛烷提取样品。此外，将50μl 0.1mg/mL内标脂肪酸(内标；针对游离脂肪酸的二十一烷酸(C21:0)加入到样品中，然后提取游离脂肪酸，在提取脂质后将获得的样品真空离心并干燥。然后，将游离脂肪酸衍生化用于气相色谱质谱(GC/MS)分析。在游离脂肪酸与BCl3-MeOH在60℃下反应30分钟后，游离脂肪酸是甲酯化的。
1-2.GC/MS分析
使用Agilent 7890/5975GCMSD***(Agilent Technology)和HP-5MS 30m x250um(微米)x 0.25um柱(Agilent 19091S-433)分析脂肪酸甲酯，并将He(99.999％)用作载气。将初始温度设定为50℃，并且在2分钟的保持时间后，以10℃/min的速率将温度升高至120℃。此后，以10℃/min的速率将温度升高至250℃并保持15分钟。最后，在300℃下清洗GC柱，并应用5分钟溶剂延迟和扫描模式。此后，使用对应于特定脂肪酸的提取离子色谱图进行定量，测定各脂肪酸甲酯/二十一烷甲酯的峰区域的比率，并进行脂肪酸之间的相对比较。
1-3.用硬脂酸预处理
在将上皮细胞和成纤维细胞以2×104个细胞/孔等分到6孔板中并给予24小时的稳定化时间，并且在缺乏后15小时，将细胞用硬脂酸(40uM/mL)、TGF-β(5ng/mL)以及硬脂酸(40uM/mL)+TGF-β(5ng/mL)以此顺序处理。在处理后，将细胞在培养箱中培养24小时后，进行下一步实验。
1-4.细胞活力分析
在通过实施例1-3中的方法完成24小时细胞刺激后，用一般培养基替换上皮细胞和成纤维细胞的培养基，进一步添加10μl的MTT溶液(20mg/ml)，然后将板的外部用铝箔包裹并将细胞在培养箱中培养2小时。2小时后，去除细胞内的所有培养基，向其中加入100μl二甲亚砜(DMSO)，然后将细胞在培养箱中再培养1小时以破坏细胞。2小时后，使用ELISA读数器在595nm的吸光度值处测量细胞活化。
1-5.胶原1和α-SMA的测量
在通过实施例1-3的方法刺激细胞24小时后，将细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，将蛋白裂解物溶液放入其中，刮出细胞并收集在1.5ml EP管中，然后将细胞在研磨机中裂解30秒。然后，在4℃下以14,000rpm的速度进行20分钟离心，并使用BCA分析方法定量蛋白质。此后，将蛋白量相同的蛋白质样品在95℃下煮沸10分钟，然后通过免疫印迹测量胶原1型和α-SMA的表达水平。在证实了蛋白质的表达水平后，使用统计程序进行样品之间的显著性检验。
实施例2.硬脂酸对特发性肺纤维化的治疗效果
实施例2-1.特发性肺纤维化的诊断标志物的选择
为了选择特发性肺纤维化(IPF)患者的诊断标志物，对来自正常组(正常)和来自特发性肺纤维化(IPF)患者组的肺组织中的游离脂肪酸进行定量，肺组织中测量的游离脂肪酸含量的平均值示于图1中。
如图1所示，证实了在棕榈烯酸(C16:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)和油酸(C18:1)的情况下，特发性肺纤维化患者组的肺组织中的含量与正常组相比显著增加，而在硬脂酸(C18:0)的情况下，特发性肺纤维化患者组的肺组织中的含量与正常组相比显著减少(p＝0.017)。同时，在肉豆蔻酸(C14:0)(其是具有14个碳原子的饱和脂肪酸)、花生四烯酸(C20:4)(其是具有20个碳原子的不饱和脂肪酸)、二十碳五烯酸(EPA；C20:5)和二十二碳六烯酸(DHA；C22:6)的情况下，特发性肺纤维化患者组与正常组的肺组织中的含量无明显差异。基于这些结果，本申请的发明人选择硬脂酸作为特发性肺纤维化患者的诊断标志物。
另外，如图1中可以看到的，发现与正常组的肺组织相比，通过定量特发性肺纤维化患者组的肺组织中的游离脂肪酸获得的除硬脂酸外的具有18个或更少碳原子的饱和和不饱和游离脂肪酸的总量增加。因此，通过将肺组织中硬脂酸(C18:0)的含量除以具有14个至18个碳的饱和和不饱和游离脂肪酸(肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈烯酸(C16:1)、棕榈酸(C16:0)、亚麻酸(C18:2)、油酸(C18:1)和硬脂酸(C18:0))的总和获得的值(硬脂酸的含量/C14-C18的总量)示于图2中。
如图2所示，证实了与正常组肺组织相比，特发性肺纤维化患者组的肺组织中(硬脂酸含量/C14-C18总量)的比显著降低(p＝0.007)。因此，这些结果表明，肺组织中(硬脂酸的含量/C14-C18的总量)的比以及肺组织中硬脂酸的含量可以被提议作为特发性肺纤维化患者的诊断指标。
实施例2-2.硬脂酸对特发性肺纤维化的治疗效果
如实施例2-1的结果所证实的，着眼于特发性肺纤维化患者的肺组织中硬脂酸含量的降低，本申请的发明人尝试通过验证在对特发性肺纤维化患者施用硬脂酸期间是否出现治疗效果来研究硬脂酸作为特发性肺纤维化的治疗剂以及诊断标志物的功效。
已知特发性肺纤维化患者中肺细胞的特征是通过转化生长因子(TGF)-β活化成纤维细胞和损失上皮细胞。基于这些事实，通过用TGF-β处理肺成纤维细胞和肺上皮细胞以产生类似于特发性肺纤维化的环境来测试用硬脂酸处理的效果。
为此目的，在人肺成纤维细胞(MRC-5；
Figure BDA0002905824340000191
CCL-171TM)和人肺上皮细胞(BEAS-2B；
Figure BDA0002905824340000192
CRL-9609TM)的每种培养物(在MRC-5的情况下为BEGM(Lonza)以及在BEAS-2B的情况下为BMEM(ATCC))用硬脂酸(40uM/mL)、TGF-β(5ng/mL；Sigma)或者硬脂酸(40uM/mL)+TGF-β(5ng/mL)通过实施例1-3中所述的方法处理24小时后，通过实施例1-4中的方法测量细胞活力。在这种情况下，作为用于比较的阴性对照，通过与上述相同的方法测量未经硬脂酸和TGF-β处理的细胞培养物(仅培养基)中的细胞活力。以上获得的结果示于图3中(CTL：对照(仅培养基)，SA：硬脂酸40uM/mL处理组，TGF-b：TGF-β5ng/mL处理组，SA+TGF-b；硬脂酸40uM/mL和TGF-β5ng/mL处理组)，图3A示出了肺成纤维细胞的细胞活力(％)，以及图3B示出了肺上皮细胞的细胞活力(％)。此外，在上述结果中，每个测试组中的细胞活力显示为与对照(CTL)中100％细胞活力的相对值。
结果，如图3A所示，在肺成纤维细胞的情况下，当用单独的TGF-β处理肺成纤维细胞时，细胞活力增加，而当用硬脂酸和TGF-β共处理肺成纤维细胞时，细胞活力降低。相反，如图3B所示，在肺上皮细胞的情况下，当用单独的TGF-β处理肺上皮细胞时，细胞活力降低，而当用硬脂酸和TGF-β共处理肺上皮细胞时，细胞活力增加。这些结果显示，硬脂酸能抑制TGF-β对肺成纤维细胞的活化和肺上皮细胞的损失，显示了硬脂酸对特发性肺纤维化的治疗效果，其可以通过TGF-β对肺成纤维细胞的活化和肺上皮细胞的损失来表征。
此外，在肺成纤维细胞中观察到由硬脂酸引起的作为纤维化标志物的胶原1(图4A)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(图4B)的变化。在图4A和4B的y轴上指示的胶原1/肌动蛋白或α-SMA/肌动蛋白意指通过用肌动蛋白(其为细胞内对照蛋白)的量校正胶原1或α-SMA的蛋白量而获得的值。结果，如图4A和4B中的每一个所示，证实了当与未用硬脂酸或TGF-β处理的肺成纤维细胞对照(CTL)相比时，当仅用已知为肺纤维化的机制材料的TGF-β处理时，胶原1和α-SMA显著增加，而用硬脂酸处理抑制这种变化。结果显示硬脂酸对肺纤维化的抑制效果。
此外，由于观察到在特发性肺纤维化患者的肺组织中硬脂酸减少，而在实施例2-1中包括C14至C18碳原子的其它饱和和不饱和脂肪酸(例如棕榈酸)增加，在用不同浓度(10μM/mL、20μM/mL和40μM/mL)的在肺纤维化患者中观察到增加的棕榈酸(PA)处理后测量细胞活力，以验证硬脂酸在治疗肺纤维化中的治疗效果。结果，如图5A中可以看到的，当用棕榈酸处理肺成纤维细胞时，细胞活力根据棕榈酸的浓度而增加，并且通过图5B显示，肺上皮细胞的细胞活力根据棕榈酸的处理浓度而降低。这些结果显示在用高浓度的棕榈酸处理期间，诱导了与TGF-β相同水平的结果。
此外，参照获得图4中的结果的测试方法，在用不同浓度(10μM/mL、20μM/mL和40μM/mL)的棕榈酸处理肺成纤维细胞后，测量作为细胞内纤维化标志物的胶原1(胶原1/肌动蛋白；图6A)和α-SMA(α-SMA/肌动蛋白；图6b)的水平，并显示为与对照(CTL；仅培养基)的相对值。结果，如图6A和6B所示，证实了当用棕榈酸处理肺成纤维细胞时，胶原1和α-SMA都以与仅用TGF-β(已知是特发性肺纤维化的机制材料)处理肺成纤维细胞的情况类似的水平增加，这与图4A和4B中用单独的硬脂酸处理期间不同。
本申请的发明人测量了胶原1((胶原1/肌动蛋白)；图7A)和α-SMA(α-SMA/肌动蛋白；图7B)的水平，并显示作为与对照(CTL；仅培养基)的相对值的水平以验证硬脂酸(SA)对由在图5和6中显示活化肺纤维化的棕榈酸(PA)引起的肺纤维化的抑制作用。在实验中分别使用40uM/mL硬脂酸、10uM/mL棕榈酸和5ng/mL TGF-β。作为实验的结果，如图7A和7B所示，证实了分别通过棕榈酸和TGF-β增加的纤维化被用硬脂酸的组合处理显著抑制。
另外，参照获得图7中的结果的测试方法，使用油酸(OA)代替棕榈酸进行实验，测量胶原1(胶原1/肌动蛋白；图8A)和α-SMA(α-SMA/肌动蛋白；图8B)的水平并显示为与对照(CTL；仅培养基)的相对值。在实验中分别使用40μM/mL硬脂酸、40μM/mL油酸和5ng/mL TGF-β。作为实验的结果，如图8A和8B所示，可以看出，与棕榈酸的结果相似，油酸也以与TGF-β相同的水平活化肺纤维化，并且如上所述，证实了分别用TGF-β和油酸处理增加的肺纤维化通过用硬脂酸处理显著抑制。
实施例2-3.硬脂酸在博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型中的抗纤维化作用
基于实施例2-2的结果，本申请的发明人尝试验证硬脂酸在由博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中的抗纤维化作用。为此目的，将6周龄小鼠(C57BL6J)分别分为以下4组，每组4只或5只小鼠：用(1)气管内盐水+媒介物，(2)气管内盐水+硬脂酸，(3)气管内4单位/kg博来霉素+媒介物，和(4)气管内博来霉素+硬脂酸处理各组。随后，用50mg/kg Alfaxan和5mg/kg正隆朋(Rompun)麻醉小鼠，然后向气管中输注博来霉素和盐水。用3mg/kg硬脂酸使用口服灌胃(zonde)处理小鼠，每周三次，持续3周。此后，在第21天，从小鼠收集肺组织和血液并用于研究。
作为实验的结果，如9A所示，证实了硬脂酸表现出抑制由于博来霉素引起的体重减轻的效果。更具体地，在第7天在博来霉素处理组(Bleo)中观察到体重的急剧降低，然后观察到体重增加的模式，但与对照相比，持续观察到体重的显著降低。相比之下，证实了当将硬脂酸(SA)一起施用时，在第7天由于博来霉素引起的体重的急剧降低被显著抑制。
另外，作为观察硬脂酸是否减轻由博来霉素诱导的纤维化引起的组织病理学特征的结果，如9B所示，在对照(盐水)中良好地观察到正常肺组织的特征，但观察到在博来霉素处理组(博来霉素)中出现肺纤维化的组织病理学特征，例如细胞致密、肺泡壁增厚和肺泡腔重构。相比之下，证实了在用博来霉素和硬脂酸处理的组中，肺纤维化的组织病理学特征显著降低。
另外，如在图9C至9F中可以看到的，证实了硬脂酸表现出抑制由于博来霉素引起的羟脯氨酸(其是组织中胶原中的主要组分)的累积的作用(图9C)，表现出抑制由于肺组织中的博来霉素引起的α-SMA表达增加的作用(图9D)，抑制由于博来霉素引起的Smad信号传导(抑制p-Smad2/3表达的增加)(图9E)，以及抑制博来霉素诱导的TGF-β1血液水平的增加(图9F)。
结果表明，硬脂酸通过抑制TGF-β增加的p-Smad2/3的表达而显示出抗纤维化作用。
实施例2-4.硬脂酸在人原代成纤维细胞中的抗纤维化作用
除了实施例中的结果外，本申请的发明人试图验证硬脂酸对来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的肺组织的成纤维细胞的抗纤维化作用。为此目的，在从患者的肺组织中分离原代成纤维细胞后，然后用不同浓度的硬脂酸处理细胞24小时，测量胶原1和α-SMA的表达水平(图10A和10B)，将从4名患者获得的成纤维细胞用80μM硬脂酸处理24小时，然后测量胶原1和α-SMA的表达水平(图10C)。另外，通过诱导患者来源的成纤维细胞中由TGF-β1引起的纤维化，胶原1型和α-SMA的表达增加后，验证了硬脂酸的抗纤维化作用(图10D和10E)。
作为实验的结果，如图10A和10B所示，证实了当用80μM硬脂酸处理时，胶原1和α-SMA的基础水平表达在人来源的原代成纤维细胞中显著降低，以及如在图10C中可以看到的，显示了当用80μM硬脂酸处理从4名IPF患者获得的原代成纤维细胞时，胶原1和α-SMA的基础水平表达均显著降低，以及如图10D和10E所示，证实了即使当在患者来源的成纤维细胞中诱导了TGF-β1引起的纤维化时，通过用80μM硬脂酸处理，胶原1和α-SMA的表达显著降低。
实施例2-5.证实硬脂酸在上皮细胞中的作用
本申请的发明人在用TGF-β1和/或40μM硬脂酸处理人肺上皮细胞系Beas-2B 24小时后，检查E-钙粘蛋白的表达水平，以检查硬脂酸对上皮细胞的作用。结果，如图11A和11B所示，证实了当用40μM硬脂酸处理Beas-2B时，在Beas-2B细胞中恢复了由TGF-β1减少的E-钙粘蛋白的表达。已知当用TGF-β1处理上皮细胞时，上皮细胞的数量减少，而上皮细胞由于EMT而分化成成纤维细胞，并且当EMT发生时，用于维持上皮细胞功能的E-钙粘蛋白的表达水平也降低。因此，通过结果可以看出，当用硬脂酸处理上皮细胞时，由于用TGF-β1处理而导致的EMT增加被抑制，并且E-钙粘蛋白的表达水平显著增加。在图3B中证实了当用TGF-β1处理上皮细胞时，抑制上皮细胞的增殖并通过硬脂酸恢复上皮细胞的增殖。
实施例2-6.阐明硬脂酸在成纤维细胞中的抗纤维化机制
本申请的发明人用40μM硬脂酸预处理人肺成纤维细胞系MRC-516小时，用TGF-β1处理MRC-5细胞1小时，然后检查p-Smad2/3和Smad7的表达水平，以阐明硬脂酸在人肺成纤维细胞中的抗纤维化机制(图12A和12B)。此外，为了研究硬脂酸对活性氧物质(ROS)产生的影响，将MRC-5细胞用40μM硬脂酸预处理16小时，将用TGF-β1处理1小时的细胞用DCF-DA染色并通过FACS分析(图12C)。此外，将MRC-5细胞用作为抗氧化剂的5mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理1小时，并用TGF-β1处理1小时，然后检查p-Smad2/3的表达(图12D)。
作为实验的结果，如图12A和12B所示，证实了硬脂酸抑制MRC-5细胞中由TGF-β1诱导的p-Smad2/3的表达并恢复由TGF-β1降低的Smad7的表达，并且如图12C中可以看到的，证实了硬脂酸显著降低MRC-5细胞中由TGF-β1诱导的活性氧物质的水平。此外，如图12D所示，证实了抗氧化剂NAC抑制MRC-5细胞中由TGF-β1诱导的p-Smad2/3的表达。
通过这些结果，可以看出硬脂酸通过抑制TGF-β1诱导的p-Smad2/3的表达来阻抑ROS的产生。
实施例3：通过组合施用硬脂酸和现有的肺纤维化抑制剂药物对特发性肺纤维化 的治疗效果
本申请的发明人通过实施例2证实了硬脂酸表现出抗纤维化作用，因此，此外，本申请的发明人试图观察当硬脂酸与用作肺纤维化的现有治疗剂的药物共施用时，是否能够对特发性肺纤维化表现出协同治疗效果。
在将来自特发性肺纤维化患者的肺组织切成1×1mm2切片时，将以下实验中使用的患者的原代成纤维细胞在5％CO2和37℃的条件下培养7至10天，然后定期更换补充有100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(FBS)的细胞培养液(伊格尔氏最小必需培养基(Eagle’s minimal essential medium)；EMEM)，以及将传代2至5次的细胞用于实验。
3-1.验证硬脂酸与吡非尼酮的组合处理的抗纤维化作用
3-1-1.人肺成纤维细胞中组合处理的抗纤维化作用
为了验证硬脂酸和吡非尼酮(其是特发性肺纤维化的治疗剂)的组合处理的抗纤维化作用，将通过上述方法分离的人原代成纤维细胞分别或同时用5ng/ml TGF-β、40μM硬脂酸和400或800μM吡非尼酮处理24小时，然后通过蛋白质印迹测量作为纤维化标志物的胶原1型(COL-1)和α-SMA的表达水平，并通过用肌动蛋白(其是细胞内对照蛋白)的量校正每种蛋白的量来定量分析抑制率。
结果，如图13所示，当与用单独的TGF-β处理细胞的情况(泳道3)相比时，观察到与400μM吡非尼酮单一处理组(泳道7)相比，在用硬脂酸和吡非尼酮共处理细胞的情况(泳道8)中清楚地表现出COL-1和α-SMA蛋白的减少。证实了即使当用800μM吡非尼酮处理细胞时，与用单独的吡非尼酮处理细胞时(泳道11)相比，当用硬脂酸和吡非尼酮共处理细胞(泳道12)时，COL-1和α-SMA蛋白也以与上述相同的方式减少。相比之下，在硬脂酸单一处理组(泳道4)的情况下，α-SMA减少，但作为纤维化的另一标志物的COL-1的变化不显著。此外，作为定量分析的结果，证实了当将TGF-β单一处理组(TGF)设定为100％时，吡非尼酮单一处理组(TGF+PIR)的COL-1抑制率增加至157％，而与硬脂酸的组合处理组(TGF+Combi)的COL-1抑制率显著增加至187％。
另外，作为以与人肺成纤维细胞系MRC-5相同的方式进行实验的结果，如图14中可以看到的，证实了当用800μM吡非尼酮处理细胞时，与单一吡非尼酮处理组(泳道11)相比，在用硬脂酸和吡非尼酮共处理的组(泳道12)中清楚地显示了COL-1和α-SMA的减少。
3-1-2.人肺上皮细胞中组合处理的抗纤维化作用
除了实施例3-1-1的结果外，本申请的发明人尝试通过用800μM处理人肺上皮细胞系Beas-2B来分析在用硬脂酸和吡非尼酮组合处理期间上皮间质转化(EMT)(其是肺纤维化的指标之一)的程度，并且为此目的，测量了作为EMT标志物之一的纤连蛋白的表达水平。
结果，如图15所示，与用单独的吡非尼酮处理的组(泳道5)相比，在用硬脂酸和吡非尼酮共处理的组(泳道6)中观察到纤连蛋白的显著减少。此外，通过定量分析结果，在吡非尼酮单一处理组(TGF+PIR)中纤连蛋白的表达降低至约120％，而在组合处理组(TGF+Combi)中纤连蛋白的表达抑制167％，证实了优异的抑制作用。
3-1-3.肺纤维化动物模型中组合处理的抗纤维化作用
除了上述实施例的结果外，本申请的发明人试图在肺纤维化动物模型中通过硬脂酸和吡非尼酮的组合处理来证实抗纤维化作用。为此目的，用50mg/kg Alfaxan和5mg/kg正隆朋麻醉8周龄小鼠(C57BL/6J)，然后向气管中注入博来霉素和盐水。从施用博来霉素后的第7天，口服施用3mg/kg硬脂酸、300mg/kg吡非尼酮或同时口服施用这两种药物，每2天一次，持续2周，并且在施用博来霉素后长达21天测量小鼠体重的变化。
作为实验的结果，如图16A所示，证实了与正常对照(Ctrl)相比，在通过施用博来霉素(Bleo)诱导肺纤维化的组中，体重降低，并且在用单独的吡非尼酮(Bleo+PIR)处理的组中，体重进一步降低，然而，与博来霉素施用组相比，在用硬脂酸和吡非尼酮(Bleo+P+SA)共施用的组中，体重增加，并且这些结果也可以通过定量比较在第21天的体重的结果来证实。
此外，如图16B所示，作为测量羟脯氨酸水平的结果以证实组织中累积的胶原的量(其通常用作纤维化的主要标志物)，证实了与正常对照(Ctrl)相比，在诱导肺纤维化的博来霉素施用组(Bleo)的情况下，羟脯氨酸水平显著增加，在单独施用吡非尼酮或硬脂酸的组的情况下，羟基脯氨酸的水平部分降低，并且在共施用吡非尼酮和硬脂酸的组的情况下，羟基脯氨酸的水平显著降低至正常对照的水平。此外，即使通过定量分析结果也能够证实与吡非尼酮单一施用组(Bleo+PIR)(105％)相比，在组合施用组(Bleo+Combi)(128％)中羟脯氨酸抑制水平非常优异。
3-2.硬脂酸与尼达尼布组合处理的抗纤维化作用
为了验证硬脂酸和作为特发性肺纤维化的另一种治疗剂尼达尼布的组合处理的抗纤维化作用，将人原代成纤维细胞分别或同时用5ng/ml TGF-β、40μM硬脂酸和1.5或2μM尼达尼布处理24小时，然后分别测量胶原1型(COL-1)和α-SMA的表达水平。
结果，如图17A所示，观察到当用浓度为1.5μM的尼达尼布处理人原代成纤维细胞时，与单一处理组(泳道7)相比，在具有硬脂酸的组合处理组(泳道8)中COL-1和α-SMA没有显著减少，而当用浓度为2μM的尼达尼布处理人原代成纤维细胞时，与单一处理组(泳道11)相比，在具有硬脂酸的组合处理组(泳道12)中COL-1和α-SMA减少，并且COL-1降低到非常显著的水平。如可在泳道3、4、7和11中看到的，可以看到，当与TGF-β单一处理组(泳道3)相比时，在硬脂酸单一处理组(泳道4)以及1.5μM和2μM尼达尼布单一处理组(泳道7和11)中，COL-1和α-SMA的表达水平没有变化，但是当用硬脂酸和尼达尼布共处理人原代成纤维细胞时，示出了纤维化标志物的减少，并且尼达尼布的浓度越高，组合处理的抗纤维化作用越大。
参照上述结果，如图17B中可以看到的，作为进行相同实验并定量分析仅针对COL-1的抑制率的结果(当用2μM尼达尼布处理人原代成纤维细胞时)，通过证实当假定由TGF引起的COL-1基因的表达水平为100％时，尼达尼布单一处理(TGF+NIN)使COL-1的表达被抑制110％，而在具有硬脂酸的组合处理(TGF+Combi)期间COL-1的表达被抑制183％，可以看出，通过组合处理，COL-1被非常优异地抑制。
本发明的上述描述是为了说明的目的而提供的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改成其它特定形式。因此，应理解，上述实施方案在所有方面仅是示例性的，而不是限制性的。
[工业实用性]
根据本发明，证实了与用治疗剂进行单一治疗相比，通过将硬脂酸与用于肺纤维化的常规治疗剂共处理，表现出更优异的抗纤维化作用。因此，认为上述用于肺纤维化的常规治疗剂和硬脂酸的共施用可以增强治疗效果并改善据报道由肺纤维化的治疗剂在患者中出现的各种药物副作用，因此预期本发明可有效地用于治疗相关疾病，包括特发性肺纤维化。

Claims (13)

1.用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的组合物，所述组合物包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药作为活性成分。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述肺纤维化抑制剂选自：吡非尼酮、尼达尼布、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(复方新诺明)、重组人正五聚蛋白-2蛋白(PRM-151)、若奇单抗(SAR156597)、潘瑞鲁单抗()、BG00011、曲前列环素、TD139、CC-90001、2-((2-乙基-6-(4-(2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)-8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-4-(4-氟苯基)噻唑-5-甲腈)(GLPG1690)、氯沙坦、四硫代钼酸盐、来瑞组单抗、齐留通、癸酸诺龙、雷帕霉素、依维莫司、维莫德吉、非苏木单抗、奥米利塞(GSK2126458)、(3S)-3-[3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]-4-{(3S)-3-[2-(5,6,7,8-四氢-1,8-二氮杂萘-2-基]乙基]-1-吡咯烷基}丁酸(GSK3008348)、利妥昔单抗、奥曲肽、2-[3-[4-(1H-吲唑-5-基氨基)-2-喹唑啉基]苯氧基]-N-(1-甲基乙基)-乙酰胺(KD025)、泰鲁司特(MN-001)、BBT-877、OLX201、DWN12088以及它们的盐。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
4.如权利要求1所述的组合物，其中与没有肺纤维化的情况相比，所述肺纤维化由于TGF-β而具有增加的肺成纤维细胞活化和增加的肺上皮细胞损失。
5.如权利要求1所述的组合物，其中与没有肺纤维化的情况相比，所述肺纤维化在肺成纤维细胞中具有增加的两种纤维化标志物：胶原1(COL-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。
6.用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，所述组合物包含(i)硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂作为活性成分。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述肺纤维化抑制剂选自：吡非尼酮、尼达尼布、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(复方新诺明)、重组人正五聚蛋白-2蛋白(PRM-151)、若奇单抗(SAR156597)、潘瑞鲁单抗、BG00011、曲前列环素、TD139、CC-90001、2-((2-乙基-6-(4-(2-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-基)-8-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-4-(4-氟苯基)噻唑-5-甲腈)(GLPG1690)、氯沙坦、四硫代钼酸盐、来瑞组单抗、齐留通、癸酸诺龙、雷帕霉素、依维莫司、维莫德吉、非苏木单抗、奥米利塞(GSK2126458)、(3S)-3-[3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]-4-{(3S)-3-[2-(5,6,7,8-四氢-1,8-二氮杂萘-2-基]乙基]-1-吡咯烷基}丁酸(GSK3008348)、利妥昔单抗、奥曲肽、2-[3-[4-(1H-吲唑-5-基氨基)-2-喹唑啉基]苯氧基]-N-(1-甲基乙基)-乙酰胺(KD025)、泰鲁司特(MN-001)、BBT-877、OLX201、DWN12088以及它们的盐。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药与吡非尼酮以1:0.5至1:25的摩尔浓度比包含在所述组合物中。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其中硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药与尼达尼布以1:0.01至1:5的摩尔浓度比包含在所述组合物中。
10.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
11.对肺纤维化抑制剂具有抗性的肺纤维化的治疗助剂，所述助剂包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药作为活性成分。
12.用于增强对肺纤维化抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括：向个体施用包含硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药作为活性成分的组合物。
13.用于预防或治疗肺纤维化的方法，所述方法包括：向个体施用(i)硬脂酸、所述硬脂酸的盐或所述硬脂酸的前药；以及(ii)肺纤维化抑制剂。
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