KR101478304B1 - 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 명세서 내에 정의된 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating or preventing neuroinflammatory disease}

본 발명은 명세서 내에 정의된 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다.

이 중, 소교세포는 분화된 대식세포(specialized macrophage)의 일종으로, 뇌에 널리 분포한다. 소교세포는 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어활동에 참여하는 역할을 한다. 또한, 소교세포는 만성뇌질환에 있어서 다양한 신경 독소 및 전염증 매개체를 분비함으로써 신경염증을 증가시켜 신경세포사 및 탈수초의 원인이 된다. 뇌손상 또는 신경성염증 자극에 대한 반응으로, 소교세포는 산화질소(nitric oxide, NO), 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하며 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다.

그러나 염증세포로서의 소교세포의 역할이 항상 유익한 것은 아니며, 현재 조절되지 않은 소교세포의 활성화는 지속적으로 과도한 신경염증을 유발하여 퇴행성 신경질환을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있다(Gonzalez-Scarano and Baltuch, Annu Rev Nerosci 22:219-240, 1999). 즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하며, 이러한 소교세포의 활성화 및 신경염증과 관련된 질환으로는 뇌허혈, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 및 근위축성 측색경화증 등의 다양한 신경학적 및 신경퇴행성 질환이 알려져 있다(Allan SM, Rothwell NJ, Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev neurosci. 2001;2;734-744). 따라서, 소교세포의 염증성 활성화는 엄격하게 조절되어야 할 필요가 있다.

신경염증 질환 치료제에 관한 종래 기술로, 한국등록특허 제1143382호에는 피리미딜이미다졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 약학 조성물을 제공하고 있고, 한국공개특허 제2013-0037236호에는 신규 화합물 피롤로[3,2-d]피리미딘-4-온 유도체를 제공하며, 이 화합물이 신경염증성 장애의 치료에도 효과가 있음을 개시하고 있다. 또한 미국공개특허 제 2008-0027031호에는 소교세포의 활성을 억제하는 조성물로서 레티노이드를 제공하고 있다. 그러나, 아직까지 광범위한 신경염증 질환에 적용 가능하도록 그 효과가 명확히 검증되고 상용화된 물질은 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 소교세포의 활성화 및 신경염증 관련 반응을 다각적으로 저해함으로써 광범위한 신경염증 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 연구한 결과, 본 발명에서 화학식 1로 정의된 화합물이 염증자극에 의해 활성화된 소교세포에서 IL-10, IL-1β 및 TNF-α의 발현을 억제하고, NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합을 약화시키며, ERK와 JNK의 활성을 억제함을 확인하였으며, 나아가 다양한 신경염증 동물모델을 통하여 상기 화합물이 신경염증을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 화합물이 신경염증과 관련된 소교세포의 활성을 효과적으로 억제하여 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 루게릭 질환, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증 등과 같은 다양한 신경염증 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 화합물명이 "(3R)-(+)-[2-(4-메톡시벤젠설포닐)-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-하이드록사메이트"이며, 종래 MMP-8 억제제로서 실험용으로 시판되던 물질로, 질환 치료와 관련한 활성이 알려진 바 없다. 본 발명에 이르러 상기 화합물이 소교세포 활성화 및 신경염증 반응을 억제하는 활성을 가지며, 이를 통하여 종국적으로 신경염증 질환 치료에 사용할 수 있다는 것이 처음 규명되었다.

본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 신경염증 질환 치료의 유효성분으로서, 결정다형체, 수화물, 무수물 또는 용매화물 등 다양한 형태로 존재할 수 있다. 상기 화합물은 당업계에 알려진 다양한 유기합성법에 의하여 화학적으로 제조될 수 있고, 또는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, ‘약학적으로 허용 가능한 염’이란 상기 화합물과 부가염을 형성한 것이라면 한정되지 않으며, 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산 부가염의 예로는 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 과염소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 옥살산, 구연산, 숙신산, 타타르산, 포름산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글리콜산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔-p-설폰산, 나프탈렌-2-설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염을 포함한다.

적합한 염기 부가염의 예로는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등에 의해 형성된 염기 부가염을 포함한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식 1 의 구조를 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 신경염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 제공됨을 특징으로 한다.

본 발명에서 "예방"이라 함은, 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 "치료"라 함은 질환 또는 질병의 발전의 억제, 질환 또는 질병의 경감, 및 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명에서는 본원 화합물의 신경염증 억제 활성을 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통하여 검증하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 화합물이 LPS 염증 자극에 의하여 활성화된 소교세포(microglia)에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 의 분비를 감소시키고, 산화질소(NO) 및 활성산소종의 생성을 감소시키는 반면, 항염증 인자인 IL-10의 생성은 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 상기 화합물이 활성화된 소교세포에서 신경염증과 관련된 MAP 인산화효소 신호전달에 관여하는 인자들을 감소시킬 뿐만 아니라, 염증 관련 전사인자인 NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합활성을 감소시켜 항염증 효과 및 소교세포 활성화 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 1 내지 도 4).

또한, LPS 염증 자극에 의하여 전신염증이 유발된 생쥐에 본 발명의 화합물을 처리한 경우, 혈액과 뇌척수액, 뇌피질 내의 TNF-α 및 IL-1β의 발현이 억제됨을 확인하였으며, 소교세포의 활성화 역시 감소됨을 확인하였다 (도 5 내지 도8).

또한, MCAo/Rep 자극을 이용하여 허혈성 뇌졸중을 유발한 후, 본 발명의 화합물을 처리하였을 때, TNF-α의 발현 감소, 소교세포의 활성화 감소 뿐만 아니라 뇌졸중에 의한 뇌세포 손상이 극명하게 감소되었음을 알 수 있었다 (도 9 내지 도 14).

따라서, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 다양한 신경염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 신경염증 질환은, 신경계의 과도한 염증 반응에 의하여 발생되는 질환이라면 제한 없이 적용될 수 있다. 예를 들어, 소교세포의 활성화 및 신경염증이 매개된 질환으로 알려져 있는, 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증을 예시할 수 있으나, 본 발명의 범위가 상기 질환에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체, 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 안정화제, 보존제, 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액 등이 있으며, 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약, 에멀젼, 시럽 및 캡슐 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경염증 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 질환의 치료를 필요로하는 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 투여 대상인 개체는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물이 될 수 있으며, 경구, 경피, 피하, 정맥, 또는 뇌혈관내 주사를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경염증 질환의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

상기 본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 각종 건강보조 식품류 등에 첨가될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용될 수 있다.

또한 상기 본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 이외에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 이 외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 증진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 상기 식품에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 염의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 소교세포(microglia)에서 TNF-α, IL-6, 산화질소(NO) 및 활성산소종의 생성 감소, IL-10의 생성 증가, 및 MAP 인산화효소 신호전달 감소를 통하여 활성화된 소교세포를 억제함으로써, 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명 명세서 '화학식 1의 화합물'은 도면 내에서 '화합물'로 표기하였다.
도 1은 LPS 로 활성화된 BV2 소교세포로부터 유리되는 TNF-α, 산화질소 및 IL-6의 생성이 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 2는 LPS 자극으로 활성화된 BV2 소교 세포에서 생성되는 세포 내 활성 산소종의 억제를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS에 의해 활성화된 JNK, ERK, p38, MK2가 본 발명의 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 NF-κB 또는 AP-1 복합체 형성이 본 발명의 화합물에 의하여 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 전신염증 모델 쥐에서 본 발명의 화합물의 신경염증 억제효과를 나타낸 것으로서 혈청(serum)내에서 TNF-α가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 6은 전신염증 모델 쥐에서 본 발명의 화합물의 신경염증 억제효과를 나타낸 것으로서 뇌척수액(CSF)내에서 TNF-α가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 7은 뇌피질에서 TNF-α, IL-1β 단백질 발현이 감소된 것을 나타낸 것이다.
도 8은 Iba1 염색을 통해서 소교세포의 활성화가 감소되었음을 나타낸 것이다.
도 9는 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, TTC염색법을 통해 뇌경색 부위가 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 10은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, 뇌경색의 부피가 감소한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 신경보호효과를 관찰한 것으로서, 신경학적 사항들의 점수가 감소하였음을 나타낸 것이다.
도 12는 허혈성 뇌졸중 모델의 선조체(striatum) 및 뇌피질(cortex) 부위에서 본 발명의 화합물에 의해 뇌세포의 사멸이 감소되었음을 나타낸다.
도 13은 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 효과를 관찰한 것으로서, 소교세포의 활성화가 감소된 것을 나타낸 것이다.
도 14는 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명의 화합물의 효과를 관찰한 것으로서, TNF-α의 생성이 감소된 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 활성화된 소교세포주에서 본 발명 화합물의 항염증 효과

1-1. 소교세포( microglia )의 배양

생쥐 유래 소교세포주인 BV2 세포는 미국세포주 은행 (ATCC)에서 그 스톡(stock)을 구입하였으며, 질소탱크에 얼려두었다가 실험하기 전에 녹여서 계대배양 후 사용하였다. BV2세포의 배양을 위하여 10% 우태아 혈청(fetal Bovine Serum, Welgene, Korea) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Welgene, Korea)을 포함하는 둘베코 개량 이글 배지 (dulbeccos modified Eagle? medium, Welgene, Korea)을 사용하였으며, 5% CO₂를 포함하는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다.

1-2. 소교세포의 활성화

상기 실시예 1-1의 방법으로 준비한 마우스 유래의 BV2 소교세포를 48-웰 (48-well) 플레이트에 1.0 X 10⁵ 세포수/ml의 농도로 분주한 후, 실험군의 웰에 본 발명의 화합물을 전처리하고, 1시간 후 LPS (lipopolysaccharide) 100ng/ml을 처리하여 소교세포 활성화를 유발한 후 6시간 또는 18시간 배양하였다. 이 배양배지의 상등액을 수집하여, 실험을 위해 -70℃에 보관하였다. 또한 정상세포 및 활성화된 세포를 수합하여 -70℃에 보관하였다.

1-3. 활성화 된 소교세포 배지 내 산화질소 및 사이토카인 농도 측정

본 발명의 화합물의 소교세포 활성화 억제 효과를 측정하기 위해, 활성화된 소교세포의 염증성 또는 항염증성 물질의 배지 내 유리 정도를 알아보는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 화합물은 켈바이오켐(Calbiochem, 미국)에서 구입하여 사용하였다.

상기 실시예 1-1의 방법으로 수득한 마우스 유래의 BV2 소교세포의 배양 상등액 내 산화질소 농도는 그리스(Griess) 반응법을 사용하여 측정하였으며 (Woo et al., Mol. Brain Res., 113, pp86-96, 2003), 종양괴사인자-알파(TNF-α 및 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10)의 농도는 각 사이토카인의 효소 면역측정 키트 (Pharmingen사, San Diego, USA)를 이용하여 샌드위치 효소면역측정법 (sandwich ELISA)을 이용하여 측정하였다 (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243-252, 2004).

실험결과, 본 발명의 화합물에 의해 LPS 로 활성화된 BV2 소교세포로부터 유리되는 TNF-α의 생성이 현저하게 감소됨을 확인하였고, 산화질소 및 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 또한 본 발명의 화합물을 처리할 경우, 항염증 인자인 IL-10의 생성을 증가시키는 것을 알 수 있었다 (도 1).

1-4. 활성화 된 소교세포 내 활성산소종 측정

본 발명의 화합물이 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 상위인자인 세포내 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS)에 미치는 영향을 측정하기 위해, 상기 실시예 1-1의 방법으로 수득한 마우스 유래의 BV2 소교세포에 50μM H₂DCF-DA (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)를 처리한 후, 빛을 차단한 상태로 37℃에서 30분간 방치하였으며, 세포 내 활성산소(ROS) 생성정도를 나타내는 DCF 형광 정도를 형광 광도계 또는 공초점 현미경 (confocal microscope)을 이용하여 측정하였다.

실험결과, 본 발명의 화합물이 LPS 자극으로 활성화된 BV2 소교 세포에서 생성되는 세포 내 활성 산소종을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었고, 특히 본 발명의 화합물 10μM 이상에서는 대조군과 유사한 수준으로 감소됨을 알 수 있었다(도 2).

1-5. 활성화 된 소교세포 내 MAP 인산화효소의 활성화 정도 측정

본 발명의 화합물이 LPS에 의하여 활성화된 소교세포에 미치는 효과를 확인하기 위해 다양한 신경염증 질환에서 중요한 역할을 하는 MAP 인산화효소 (MAP kinase) 신호전달 체계의 인자에 대한 웨스턴 블라팅법 (western blotting)을 수행하였다.

LPS (100ng/ml)만을 3시간동안 단독 처리한 BV2 소교세포 및 LPS 처리 1시간 전 본 발명의 화합물을 처리한 BV2 소교세포로부터 세포 추출물 (cell extract)을 분리하였다(Woo et al., Mol. Brain Res., 113, pp86-96, 2003). 세포 (1.0 X 10⁵ 세포수)에 1ml 용해 완충액 [lysis buffer; 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 30mM NaCl, 1% Triton x-100, 0.1% SDS, 0.1% Sodium Deoxycholate, 1mM EDTA]을 첨가한 후, 얼음에서 15분간 방치한 후 13200 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻었다. 세포 추출물의 단백질 양은 바이오라드사 (Bio-rad, CA, USA)의 단백질 정량 키트를 이용하여 측정하였다.

단백질 활성을 확인하기 위하여 50μg의 세포 추출물을 12% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리 아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮겨주었다. 분리된 단백질이 옮겨진 막은 항체와의 비특이적인 결합을 막기 위해 TBST 완충액[10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5% Tween-20]에 10%로 녹인 탈지유(skim milk)로 블라킹(blocking)하고, 각각의 인산화된 단백질(p-JNK, p-ERK, p-p38, p-MK2)을 인지하는 1차 항체 (Cell Signaling Technology, USA)를 3% BSA (Bovine Serum Albumin) 용액을 이용하여 1:1000의 비율로 희석하여 반응시켰다. 1차 항체를 인지하는 Horseradish peroxidase-conjugated-2차 항체 (Bio-rad, CA, USA)는 TBST 완충액에 5%로 녹인 skim milk에 1:1000의 비율로 희석하여 반응시킨 후 Enhanced chemiluminescence detection 키트를 사용하여 관찰하였다.

실험 결과, LPS에 의해 활성화된 JNK, ERK, p38, MK2는 본 발명의 화합물에 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(도 3). 이를 통해 본 발명의 화합물이 MAP 인산화효소를 조절함으로써 항염증 효과를 낸다는 것을 알 수 있었다.

1-6. 활성화 된 소교세포 내 NF -κB 및 AP -1 활성 측정

본 발명의 화합물이 소교세포 활성화를 조절하는데 중요한 역할을 하는 전사인자(transcription factor)인 NF-κB, AP-1에 대하여 억제 효과를 나타내는지 여부를 측정하기 위하여 겔 지연 어세이 (Electrophoretic Mobility Shift Assay; EMSA)를 실시하였다(Park et al., J. Neuroimmunol ., 168, pp 56-64, 2005).

LPS (100ng/ml)만을 3시간동안 단독 처리한 BV2 소교세포 및 LPS 처리 1시간 전 본 발명의 화합물을 처리한 BV2 소교세포로부터 핵추출물 (nuclear extract)을 분리하였다(Woo et al., Mol . Brain Res., 113, pp 86-96, 2003). 세포 (1.0 X 10⁵ 세포수)에 1ml 용해 완충액 [lysis buffer; 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 10mM NaCl, 3mM MgCl₂, 1% NP-40]을 첨가한 후, 얼음에서 4분간 방치하고 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 추출 완충액 [extraction buffer; 20mM HEPES, 20% Glycerol, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM EDTA, 300mM NaCl, 1mM DTT, 1mM PMSF]을 첨가한 후, 얼음에서 30분간 방치한 후, 13200 rpm에서 20분간 원심분리하여 핵추출물을 얻었다. 핵추출물의 단백질 양은 바이오라드사 (Bio-rad, CA, USA)의 단백질 정량 키트를 이용하여 측정하였다. 5μg의 핵추출물을 γ-³²P-ATP로 표지된 NF-κB 올리고뉴클레오타이드 탐침(oligonucleotide probe: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3' 또는 γ-³²P-ATP로 표지된 AP-1 올리고뉴클레오타이드 탐침(oligonucleotide probe: 5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3')과 섞어 얼음 위에서 30분간 방치하여 DNA-단백질 복합체 (DNA-protein complex)를 생성하였다. 생성된 DNA-단백질 복합체를 확인하기 위하여 5% 아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동한 후 자기방사법 (autoradiography)을 실시하였다.

실험 결과, LPS 에 의하여 증가된 NF-κB 또는 AP-1 복합체 형성이 본 발명의 화합물에 의하여 감소됨을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 화합물은 NF-κB 또는 AP-1의 DNA 결합활성을 감소시켜 항염증 효과를 나타내고, 이로 인해 소교세포의 활성을 억제함을 알 수 있었다(도 4).

실시예 2. 전신염증모델 생쥐에서 본 발명 화합물의 신경염증 억제 효과 관찰

2-1. 전신염증모델 생쥐에 본 발명 화합물의 투여

생후 10주된 C57BL6 수컷 마우스를 무작위로 대조군(control)과 LPS (5mg/kg 복강내 투여)처리군으로 나누고, LPS 처리군은 다시 본 발명의 화합물이 함유되지 않은 비이클(vehicle) 투여군과 본 발명의 화합물 투여군(1mg/kg 또는 5mg/kg 복강내 투여)으로 나누어 실험하였다. 본 발명의 화합물은 1% DMSO가 포함된 정상 식염수에 녹였으며 비이클과 본 발명의 화합물은 LPS 처리 4일전부터 매일 투여하여 관찰하였다.

2-2. 혈청과 뇌척수액 내 TNF -α단백질 수준 측정

실시예 2-1에 의해 LPS 투여 후 3시간에 pentobarbital (120 mg/kg, 복강내 투여) 마취하에 하대정맥에서 혈액을 얻어 혈청을 분리하였다. 뇌척수액은 Fleming 등의 방법 (J. Neuroimmunol., 4, pp129-140, 1983)을 이용하여 isoflurane 마취하에 배측 제1경추 부위 절개 후, 큰수조(cistern magna) 부위에서 유리모세관을 이용하여 추출하였다. 혈액과 뇌척수액 내 TNF-α 수준은 효소 면역측정 키트 (Pharmingen사, San Diego, USA)를 이용하여 샌드위치 효소면역측정법 (sandwich ELISA)을 이용하여 측정하였다 (Kim et al., Neruopharmacology , 47, pp243-252, 2004).

LPS 를 처리하여 전신염증을 유발한 경우 대조군에 비하여 말초혈액의 혈청과 뇌척수액내 TNF-α수준이 현저히 증가하였다(각각 6.7배 및 6.55배, 도 5 및 도 6). 본 발명의 화합물을 투여한 경우 혈청 내에서는 용량의존적으로 TNF-α수준이 감소하였고 5mg/kg 투여군에서 현저히 감소하였다(도 5). 반면 뇌척수액에서는 본 발명의 화합물 1mg/kg과 5mg/kg 투여한 경우 모두 비이클 투여군에 비해 통계적으로 의미있는 TNF-α발현 감소를 보였다(도 6). 이러한 결과를 통하여 본 발명의 화합물의 전신투여가 전신염증에 의한 말초혈액 및 뇌내 염증성 사이토카인 TNF-α발현 증가를 억제함을 의미한다.

2-3. 본 발명의 화합물에 의한 뇌조직내 염증성 사이토카인 TNF -α와 IL -1β단백질 발현 감소

본 발명의 화합물의 뇌내 염증억제 반응 여부를 확인하기 위하여 LPS 투여 후 3시간에 마우스를 희생시켜 뇌피질을 분리, Park 등의 방법 (J. Pharmacol. Exp. Ther., 341, pp59-67, 2012)을 이용하여 단백질을 얻고 웨스턴 블롯을 이용하여 뇌피질의 TNF-α와 IL-1β 발현 정도를 측정하였다. 대조군에 비하여 LPS 투여 후 TNF-α가 3.9배 증가하였으며 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 TNF-α 발현의 변화가 비이클 투여와 차이가 없었으나 본 발명의 화합물을 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비하여 현저하게 감소하였다(40% 감소, 도 7). 또한, LPS 투여 후 대조군에 비하여 IL-1β가 3.7배 증가하였으며, 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 IL-1β발현의 변화가 비이클 투여와 차이가 없었으나 본 발명의 화합물을 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비하여 IL-1β의 발현이 현저하게 감소하였다(50% 감소, 도 7). 이러한 결과는 뇌척수액내 TNF-α발현과 유사하게 본 발명의 화합물이 뇌피질내 염증성 사이토카인의 발현 증가를 억제함을 의미한다.

2-4. 본 발명의 화합물에 의한 소교세포 활성화 감소

뇌염증반응 중 하나인 소교세포 활성화 정도를 확인하기 위하여, 소교세포 표지자인 Iba1항체를 이용하여 뇌피질 조직의 면역형광염색을 하기의 방법대로 실시하였다.

LPS 투여 후 3시간에 pentobarbital (120 mg/kg, 복강내 투여)로 마취하고 식염수를 심장에 관류시켜 혈액 제거 후 0.1M phosphate buffer로 만든 4% paraformaldehyde로 뇌를 고정하여 적출한 뇌를 30% sucrose용액에 넣어 저장시켰다. Cryostat에서 뇌의 배측해마(bregma에서 -2.0과 -0.3 mm사이)를 포함한 부위를 30μm두께로 관상방향의 뇌절편을 얻어 젤라틴으로 코팅된 유리 슬라이드에 붙여 슬라이드 면역형광염색을 수행하였다. 뇌절편의 슬라이드를 Iba1 (1:500) 항체가 포함된 TBS에 하룻밤 반응시키고 다음날 1차 항체를 씻어내고 fluorescein isothiocyanate (1:1000)가 붙은 2차 항체와 1시간 반응시켰다. 2차 항체를 씻어낸 후 슬라이드를 Vectashield로 마운팅하고 형광현미경을 이용하여 Iba1표지된 세포를 관찰하였다. 활성화된 소교세포(진하고 둥근 모양)의 정량화를 위하여 마우스 1마리당 2개의 연속적인 뇌절편에서 뇌피질의 면적 500 μm² 3개의 부분에서 Iba1 표지세포 수를 계산, 평균값을 구하였다.

염색결과, 대조군에 비하여 LPS 투여 후 활성화된 Iba1 표지세포의 수가 증가하였다(10.12±1.45 대 41.17±2.95, p<0.01). 또한 본 발명의 화합물을 1mg/kg 투여한 경우 활성화된 소교세포의 수가 비이클 투여와 차이가 없었으나 5mg/kg 투여한 경우 비이클 투여에 비해 그 수가 현저히 감소하였다(20.0±3.82, p<0.01; 도 8). 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 뇌 내 TNF-α와 IL-1β 발현 감소와 더불어 소교세포의 활성화를 억제함으로써 염증 반응을 감소시키는 것을 의미한다.

실시예 3. 허혈성 뇌졸중 모델에서 본 발명 화합물의 신경보호 및 항염증 효과

본 발명의 화합물의 허혈성 뇌졸중 모델에서의 신경보호효과는, 관련 약 개발에 널리 사용되고 있는 국소뇌허혈 동물 시험법인 middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAo/Rep)을 이용한 생체 내 시험법에서 그 효과를 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 화합물의 신경보호효과의 기전을 탐색하기 위해 기존에 확립되어 시행되어 온 소교세포 활성화 정도와 염증성 사이토카인인 TNF-α 수준을 측정하였다. 특히, TNF-α는 허혈성 뇌졸중에서 나타나는 신경세포손상의 매개체이며, 본 발명의 화합물에 의해서도 감소할 수 있으므로 유의한 지표라 할 수 있다.

3-1. 허혈성 뇌졸중 모델 구축 및 본 발명의 화합물 투여

MCAo/Rep 자극은 일시적인 국소 허혈성 뇌졸중을 유발하는 것이다. 이를 위해 몸무게가 28-32 g 나가는 ICR 수컷 흰쥐 (7주령, Orientbio, korea)를 사용하고, 실험동물은 전 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며 낮밤주기는 12시간 (light/dark cycle)으로 조절되는 실험실 환경에서 유지하였다. 본 연구의 모든 실험동물 연구방법은 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)의 승인을 받은 가천대학교 암당뇨연구원의 실험동물위원회의 지침을 준수하였다. 국소 혈류를 막기 위한 MCAo는 산소와 질소 혼합기체 (70%/30%)와 2% isoflurane으로 동물을 흡입 마취시킨 후에, 목의 중앙 절개로 동물의 오른쪽 총경동맥 (CCA, common carotid artery)을 노출시킨 뒤, 총경동맥의 분기점을 찾아 내경동맥 (ICA, internal carotid artery)과 외경동맥 (ECA, external carotid artery)를 조심스럽게 분리 한 후에 총경동맥과 외경동맥을 봉합사로 묶었다. 분기점에서 나일론 봉합사를 삽입해 중간대뇌동맥 (MCA, middle cerebral artery)의 근위부를 막히게 한 다음 내경동맥을 봉합사로 단단히 묶어 준 후, 목 절개 부위는 봉합사로 봉합하고 90분간 동물을 방치하였다. 90분 MCAo 자극 후 수술한 쥐를 다시 흡입마취를 시킨 후 국소 혈류를 막기 위해 내경동맥에 삽입한 나일론 봉합사를 제거하고 목 절개 부위를 재 봉합하여 혈액을 재관류 (reperfusion) 시킨 후, 본 발명의 화합물을 중간대뇌동맥 재관류 후에 즉시 5 mg/kg으로 복강으로 일 회 주사하였다.

3-2. 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌손상 측정

허혈성 뇌졸중에 의한 뇌손상은 뇌 절편을 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St.Louis, MO) 용액으로 염색하여 뇌경색 크기를 측정/분석함으로써 손상 정도를 판단하였다. 뇌경색 크기 측정을 위해 재관류 22시간 후에 쥐를 희생시켜 조심스럽게 뇌를 적출한 후에 뇌를 brain matrix을 이용하여 2 mm 두께의 관상절편 (coronal slices)으로 자른 후, 관상절편을 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC; Sigma, St.Louis, MO) 용액에 넣고 37℃에서 30분간 염색한 후 10% 포르말린으로 고정하였다. 뇌경색 부위를 측정하기 위해서 카메라로 염색된 관상절편을 촬영하고, Image J 프로그램을 사용하여 뇌의 부피와 뇌경색 부피 (TTC로 염색되지 않은 부위)를 측정한 후에 뇌경색 정도는 다음과 같은 계산법으로 산출하였다.

[뇌경색 정도 (infarct volume, %)=전체 뇌경색의 부피/전체 뇌 부피×100]

TTC 염색 결과 MCAo/Rep 실험군 (대조군)과 재관류 후 본 발명의 화합물을 투여한 실험군 (약물투여군)의 손상 정도는 확연한 차이를 보였다(도 9). 계산식에 의해 도출된 대조군과 약물투여군의 뇌경색 부피는 각각 29.17%과 18.90% 이며, 본 발명의 화합물의 처리로 인해 뇌경색 크기는 대조군에 비해 약 35.21%의 통계학적으로 유의한 수준의 감소를 보였다 (P=0.0452) (도 10).

3-3. 허혈성 뇌졸중에 의한 신경행동학적 변화 측정

TTC 염색법 의한 결과와 유사한 결과가 대조군과 약물처리군의 신경학적인 행동변화 시험법에서도 도출되었다. 뇌졸중 모델의 신경학적 행동변화 시험법은 기확립된 방법을 사용하였으며, 평가는 motor test, sensory test, beam balance test, relfex absent and abnormal movement의 4가지 항목으로 분류하여 실시하였다. 평가에서 도출된 점수 (neurological score)는 총 18점을 만점으로 하여 산출하였으며, 꼬리를 들었을 때 앞발과 뒷발의 굴곡, 머리 각도를 각각 1점으로 측정하고, 바닥 위에 올려 놓았을 때 운동신경, 반사신경, 감각신경, 균형감각 등의 손상 정도를 기 확립된 기준법에 의해 점수를 부여하였다. 신경학적 행동변화 시험 결과, 약물투여군에서 대조군 대비 유의적 감소를 관찰하였다 (P=0.0047) (도 11).

3-4. 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌세포 사멸 측정

본 발명의 화합물의 신경보호효과 기전을 확인하기 위해 조직학적 방법을 활용하였고, 이를 통해, 각 실험군의 조직절편에서 뇌세포 사멸, 소교세포 활성화, TNF-α 생성 정도를 측정하고 대조군과 비교분석하였다.

조직학적 방법에 사용하는 조직 절편은 모든 실험이 끝난 후 획득하였고, 상세한 실험법은 다음과 같다. 재관류 22시간 후에 실험동물을 마취제 (Zoletil50 10 mg/kg + Rompun 3 mg/kg) 근육주사로 마취 한 후에, 심장을 통한 관류고정을 진행하였다. 심장의 좌심실에서 대동맥방향으로 바늘을 삽입하고 연동펌프를 사용해 phosphate buffer saline (PBS)를 관류시킨 뒤 혈액이 완전히 제거되면 4% paraformaldehyde를 관류시켜 조직을 고정하였다. 고정 과정 후 뇌를 제거하고 4% paraformaldehyde 용액에 담가 4 ℃에서 16시간 보관하여 추가고정을 한 후, PBS로 세척하고 동결과정에서 조직 손상을 방지하기 위해 30% sucrose 용액에 하루 이상 방치하였다. Sucrose에 완전히 잠긴 뇌는 OCT 용액을 사용하여 동결조직 샘플을 만들고, 이후 microtome을 이용해 20 ㎛ 두께의 동결조직 절편을 gelatin coating 된 slide에 붙여서 말린 후 실험에 사용하였다.

약물처리에 의한 뇌세포의 생존여부를 확인하기 위하여 모든 니슬소체 (Nissl body)를 염색하는 니슬 염색 (Nissl staining)을 시행하였다. 먼저 슬라이드에 부착된 동결조직 절편을 ethyl alcohol 용액을 활용하여 rehydration 시킨 후에 0.2% cresyl violet acetate (Sigma, St.Louis, MO) 용액으로 조직을 염색하고, 염색된 조직절편을 증류수로 세척하고 dehydration 과정을 거친 뒤 xylene으로 투명화하고 mounting 용액 (Merck KGaA, Germany)을 이용하여 봉입하였다. 니슬 염색법 결과, 정상군에 비해 뇌졸중 자극이 가해진 실험군 (대조군)의 뇌피질(cortex)

과 선조체(striatum)에서 많은 뇌세포 손상이 유발됨을 확인하였고, 본 발명의 화합물을 처리함으로써 뇌졸중에 의한 뇌세포 손상이 극명하게 감소되었음을 확인하였다 (도 12).

3-5. 허혈성 뇌졸중에 의한 소교세포 활성화와 TNF -α 측정

소교세포 활성화 및 TNF-α 생성 여부는 동결조직 절편을 특이적 항체를 활용하는 면역조직화학 염색법에 적용하여 확인하였다. 소교세포 활성화 및 TNF-α 생성 측정을 위해 사용된 특이적 항체는 anti-Iba-1 (소교세포 활성화 확인 지표) 및 anti-TNF-α (TNF-α 생성 확인 지표) 이며, 면역조직화학 염색법은 다음과 같이 진행되었다. 동결조직절편이 부착된 슬라이드를 0.05M PBS로 세척한 뒤에 4% paraformaldehyde 용액으로 재고정하고, 조직 내의 과산화수소의 비특이적 반응을 차단하기 위해 1% H₂O₂로 15분 동안 반응시켰다. 이 후 5% normal donkey serum을 가하고 1시간 동안 실온에서 반응시킴으로써 비특이적 면역반응을 제거한 뒤에 1차 항체 goat polyclonal anti-Iba1 (Iba1 1:500, Abcam plc, UK)과 rabbit polyclonal anti-TNF-α (TNF-α 1:100, Abcam plc, UK)를 가하고 4 ℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 다시 조직을 세척한 후 바이오틴(biotin)이 붙은 2차 항체를 2시간 동안 가한 후에 세척하였다. Avidin-biotin peroxidase complex (Vector Laboratories)을 90분 동안 조직에 가한 후에 세척하고, 0.01% H₂O₂를 포함하는 0.02% 3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Sigma, St.Louis, MO, USA)로 발색하고, 발색된 조직 절편을 dehydration 한 후, xylene으로 투명화하고 mounting 용액을 이용하여 봉입하였다. 염색된 조직을 현미경으로 관찰하여 사진을 촬영한 후 뇌졸중 자극이 가해진 반구를 기준으로 염색된 세포 수를 산출하여 통계처리 하였다.

허혈성 뇌졸중 자극에 의해 자극에 가해진 뇌의 반구에서 활성화된 소교세포 수가 증가하였고 (138.8±7.4개), 본 발명의 화합물을 처리함으로써 그 수가 감소되었으며 (47.67±10.73개), 감소 정도는 통계적으로 유의함 (P＜0.01)을 확인하였다 (도 13).

또한, 허혈성 뇌졸중 자극에 의해 자극에 가해진 뇌의 반구에서 염증성 사이토카인인 TNF-α를 생성하는 세포 수가 증가하였고 (648.3±64.70개), 본 발명의 화합물을 처리함으로써 그 수가 감소되었으며 (402.8±74.73개), 감소 정도는 통계적으로 유의함 (P＜0.05)을 확인하였다 (도 14).

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는,
   허혈성 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 산 부가염 또는 염기 부가염인 약학 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
   
5. 삭제
6. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는,
   허혈성 뇌졸중의 개선용 식품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
7. 삭제

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