CN112462063A - 神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂及其制备方法 - Google Patents

神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂及其制备方法，属于体外诊断技术领域，试剂由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成；所述包被膜通过下述方法制备：稀释PGP9.5抗原至浓度为5～20μg/mL，喷涂或涂覆在包被膜上，晾干后封闭、烘干、封袋备用；所述金标抗体通过下述方法制备：按9～11μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀洗涤、溶解备用。本发明解决了目前测定PGP9.5蛋白抗体测定样本的时间长，操作费时费力的技术问题，操作方便快捷，无需大型仪器及耗材，节约设备和人力成本，做到现场检测，抗干扰能力强，可以对患者的健康状况作出判断及监测。

Description

神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂及其制备 方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种借助胶体金标记显色的 免疫检测神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体检测试剂及其制备方法。
背景技术
肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一。在肿瘤发病早期，机体的 免疫***可识别肿瘤细胞内表达异常的蛋白，即肿瘤相关抗原(TAAs)。 TAAs的过表达、突变、错误折叠、异常退化等改变可导致癌症患者产生自 身反应性免疫应答，并产生针对这些抗原的自身抗体，少量TAAs刺激即 可引起B细胞产生大量的自身抗体。因此，检测TAAs的自身抗体可作为 肺癌早期诊断的分子标记物。
目前针对肺癌的筛查，主要为联合胸部低剂量计算机断层扫描 (low-dosecomputed tomography，LDCT)技术、血液分子标志物的检测、 痰细胞学检测、纤维支气管镜等多种检测手段，但对早期肺癌的诊断效果 欠佳。
神经元胞质蛋白基因产物9.5(PGP9.5)其表达不依赖于神经的分化而 独立存在，与肿瘤的病理分期密切相关，在原发性肺癌中有大量表达。 PGP9.5是一种神经特异性肽，是泛素水解酶，广泛表达于神经元分化的各 个阶段，细胞蛋白泛素化并通过泛素介导的蛋白水解酶将其靶向降解是调 控细胞周期基因的重要机制。在肿瘤中，PGP9.5增加细胞周期蛋白的去泛 素化可能导致体细胞的不可控生长。
目前测定PGP9.5蛋白抗体的方法是酶联免疫法，酶联免疫法测定样本 的时间长，操作费时费力，虽然可以做到定量测定，但无法做到POCT试 剂的现场检测，互不干扰。因此，急需一种方便、快捷的PGP9.5蛋白抗体 检测试剂，做到现场检测，对患者的健康状况作出判断及监测。
发明内容
本发明针对目前测定PGP9.5蛋白抗体测定样本的时间长，操作费时费 力的技术问题，提供一种适胶体金层析法检测PGP9.5抗体的试剂，做到现 场检测，无需大型仪器及耗材，抗干扰能力强，可以对患者的健康状况作 出判断及监测。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明首先提供了神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂， 由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成；
所述包被膜通过下述方法制备：稀释PGP9.5抗原至浓度为5～20μg/mL， 喷涂或涂覆在包被膜上，晾干后封闭、烘干、封袋备用；
所述金标抗体通过下述方法制备：按9～11μg/mL胶体金加入PGP9.5 抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀洗涤、溶解备用。
优选地，所述PGP9.5抗原为纯化的PGP9.5基因工程重组抗原、或合 成多肽、或亲和纯化抗原。
优选地，所述PGP9.5抗原的纯度≥95％。
优选地，所述PGP9.5抗原稀释至浓度为8μg/mL，喷涂或涂覆在包被 膜上。
优选地，所述金标抗体按10μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体中。
优选地，所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜通过下述方法得到：将制备 好的金标抗体均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，冷 冻干燥，封袋，置4℃备用。
本发明还提供了上述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测 试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备包被膜：用包被缓冲液稀释包被抗原至浓度为5～20μg/mL， 喷涂或涂覆在包被膜上，喷液量为20微升//35厘米，晾干后在37℃封闭液 中浸泡60分钟，取出后于37℃烘干2小时，封袋备用；所述包被缓冲液 为0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液；所述封闭液为含2％BSA、2％脱脂奶的0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液；
S2、制备涂覆金标抗体的玻璃纤维膜：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH 值至7.5，按9～11μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体，混匀后静置，离心处 理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用10％初始胶体金体积 的金标抗体保存液溶解，得到金标抗体；将制备好的金标抗体均匀地铺在 玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备 用；所述标记洗涤液为含2％BSA的0.01M pH7.0 PBS溶液；所述金标抗体 保存液为含1％BSA、0.5％脱脂奶、5/万NaN3、0.1％Tween-20的0.01M pH7.0 PBS溶液；
S3、将包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜裁切后粘贴在塑 料底板上，组成大板，再将大板切成单个人份试剂。
优选地，所述PGP9.5抗原为纯度95％以上的PGP9.5基因工程重组抗 原、或合成多肽、或亲和纯化抗原。
优选地，所述胶体金的烧制方法为：用双蒸水将1％氯金酸稀释成 0.01％，置电炉煮沸，按每100毫升0.01％氯金酸加入4毫升1％柠檬酸三 钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。
优选地，步骤S2离心处理的条件是13000rpm离心30-35分钟。
与现有技术相比，本发明提供的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶 体金检测试剂的有益效果为：
1、诊断快速，10分钟内可完成检测，灵敏度高、抗干扰能力强；
2、不需任何仪器设备，节约仪器设备成本；
3、操作简便，不需由专业人员操作，节约人力成本。
具体实施方式
本发明提供的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，由包 被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成。为了使本领域的 技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步 的详细介绍。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例采用纯化的PGP9.5基因工程重组抗原作为固相物，利用间接 法原理检测血清中是否含有PGP9.5抗体。本实施例的制造方法如下：
a、抗原选择
采用纯度>95％的基因工程表达的PGP9.5重组抗原。
b、抗原膜的制备
1、包被缓冲液的配制：0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液为包被溶液，0.22μ 膜滤过，置4℃备用，效期一周。
2、封闭液的配制：配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜滤 过，置4℃备用，效期一周。配制封闭工作液：2％BSA，2％脱脂奶，0.01M pH7.0 PBS，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期三天。
3、包被膜制备：调试喷膜机，喷液量为20微升//35厘米，用包被缓 冲液稀释包被抗原，浓度为8μg/mL，机器划线，两线间隔5mm，应细致 均匀，室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟，取出后置37℃烘 干处理两小时，封袋备用。
c、胶体金、胶体金标记抗体的制备
1、氯金酸的配制：用双蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用， 效期三天。1000mL 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸；1000mL双蒸水。
2、柠檬酸三钠的配制：用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，置 4℃备用，效期三天。1000mL 1％柠檬酸三钠溶液配方：l0g柠檬酸三钠； 1000mL双蒸水。
3、0.1M碳酸钾的配制：用双蒸水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用， 效期一周。1000mL 0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；1000na1双蒸水。
4.3％PEG-20000的配制：用双蒸水配制，0.22μ膜滤过，置4℃备用， 效期一周。1000mL3％PEG溶液配方：30g PEG-20000；1000mL双蒸水。
5、标记洗涤液的配制：2％BSA，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜滤 过，置4℃备用，效期两周。1000mL标记洗涤液配方：20gBSA；1000mL 0.01M pH7.0 PBS溶液。
6、金标抗体保存液的配制：1％BSA，0.5％脱脂奶，5/万NaN3，0.1％Tween-20，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，效期 十五天。1000mL金标抗体保存液配方：10g BSA；5g脱脂奶；0.5g NaN3； lmL Tween-20；1000mL 0.01M pH7.0 PBS溶液。
7、胶体金的烧制：用双蒸水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸， 按每100毫升0.01％氯金酸加入4毫升1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液 体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无 沉淀和漂浮物。
8、金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按10微 克抗体/毫升胶体金加入PGP9.5抗体，混匀，静置30分钟，13000rpm离心 34分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉 淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4℃备用，效期 一周。
d、金标抗体的冻干
将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺6平方厘 米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用。
e、试纸板的生产
1、金标抗体玻璃纤维膜的裁切：根据滴配实验确定的宽度，将金标抗 体玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备用。
2、吸水纸的裁切：用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置 干燥房间备用。
3、玻璃纤维膜的裁切：将玻璃纤维膜切成长35厘米，宽2厘米的长 条，置干燥房间备用。
4、大板的粘贴：按要求把包被膜、吸水纸、冻干金标抗体、玻璃纤维 膜粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25℃，湿度20％-30％。
f.切条
用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度2.5毫米，随机抽检，灵 敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带， 能够通过***Panel。
g、组装、包装
将50人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，放入试 剂盒，
每盒一份说明书。于4-25℃避光保存，不得冻存。
采用实施例1的试剂检测100例肺癌可疑患者的血清样本，用酶联免 疫法(ELISA)作对照，对本发明进行敏感性检测(见表1)和抗干扰检测(见 表2)。结果显示，本发明的灵敏性达98.6％(75/76)，抗干扰能力强。
表1 100例肺癌可疑患者血清样本PGP9.5抗体检测结果
Figure BDA0002600173930000061
表2 抗干扰结果
Figure BDA0002600173930000062
实施例2
本实施例采用PGP9.5合成多肽作为固相物，利用间接法原理检测血清 中是否含有PGP9.5抗体。本实施例的制造方法与实施例1基本相同，不同 点如下：
1、采用PGP9.5合成多肽作为包被抗原。
2、包被膜的制备：调试喷膜机，喷液量为20微升//35厘米，用包被 缓冲液稀释包被抗原，浓度为5μg/mL，机器划线，两线间隔5mm，应细 致均匀，室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟，取出后置37℃ 烘干处理两小时，封袋备用。
3、金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按11微 克抗体/毫升胶体金加入PGP9.5抗体，混匀，静置30分钟，13000rpm离心 30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉 淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4℃备用，效期一 周。
4、金标抗体的冻干：将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每 毫升溶液铺4平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用。
采用实施例2制备的试剂检测100例肺癌可疑患者的血清样本，用酶 联免疫法(ELISA)作对照，对本发明进行敏感性检测(见表3)和抗干扰检测 (见表4)。结果显示，本发明的灵敏性达100.0％(76/76)，抗干扰能力 强。
表3 100例肺癌可疑患者血清样本PGP9.5抗体检测结果
Figure BDA0002600173930000071
表4 抗干扰结果
Figure BDA0002600173930000072
实施例3
本实施例采用PGP9.5亲和纯化抗原作为固相物，利用间接法原理检测 血清中是否含有PGP9.5抗体。本实施例的制造方法与实施例1基本相同， 不同点如下：
1、采用PGP9.5亲和纯化抗原作为包被抗原。
2、包被膜的制备：调试喷膜机，喷液量为20微升/35厘米，用包被缓 冲液稀释包被抗原，浓度为20μg/mL，机器划线，两线间隔5mm，应细致 均匀，室温晾干20分钟。37℃在封闭液浸泡中60分钟，取出后置37℃烘 干处理两小时，封袋备用。
3、金标抗体的制备：用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按9μg抗 体/毫升胶体金加入PGP9.5抗体，混匀，静置30分钟，13000rpm离心30 分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀 用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置4℃备用，效期一周。
4、金标抗体的冻干：将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每 毫升溶液铺8平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用。
采用实施例3制备的试剂检测100例肺癌可疑患者的血清样本，用酶 联免疫法(ELISA)作对照，对本发明进行敏感性检测(见表5)和抗干扰检测 (见表6)。结果显示，本发明的灵敏性达98.6％(75/76)，抗干扰能力 强。
表5 100例肺癌可疑患者血清样本PGP9.5抗体检测结果
Figure BDA0002600173930000081
表6 抗干扰结果
Figure BDA0002600173930000082
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分 技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本 质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成；
所述包被膜通过下述方法制备：稀释PGP9.5抗原至浓度为5～20μg/mL，喷涂或涂覆在包被膜上，晾干后封闭、烘干、封袋备用；
所述金标抗体通过下述方法制备：按9～11μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀洗涤、溶解备用。
2.根据权利要求1所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，所述PGP9.5抗原为纯化的PGP9.5基因工程重组抗原、或合成多肽、或亲和纯化抗原。
3.根据权利要求1或2所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，所述PGP9.5抗原的纯度≥95％。
4.根据权利要求1所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，所述PGP9.5抗原稀释至浓度为8μg/mL，喷涂或涂覆在包被膜上。
5.根据权利要求1所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，所述金标抗体按10μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体中。
6.根据权利要求1或5所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂，其特征在于，所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜通过下述方法得到：将制备好的金标抗体均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用。
7.根据权利要求1-6任一项所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备包被膜：用包被缓冲液稀释包被抗原至浓度为5～20μg/mL，喷涂或涂覆在包被膜上，喷液量为20微升//35厘米，晾干后在37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于37℃烘干2小时，封袋备用；所述包被缓冲液为0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液；所述封闭液为含2％BSA、2％脱脂奶的0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液；
S2、制备涂覆金标抗体的玻璃纤维膜：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.5，按9～11μg/mL胶体金加入PGP9.5抗体，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用10％初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，得到金标抗体；将制备好的金标抗体均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，冷冻干燥，封袋，置4℃备用；所述标记洗涤液为含2％BSA的0.01M pH7.0 PBS溶液；所述金标抗体保存液为含1％BSA、0.5％脱脂奶、5/万NaN3、0.1％Tween-20的0.01M pH7.0PBS溶液；
S3、将包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜裁切后粘贴在塑料底板上，组成大板，再将大板切成单个人份试剂。
8.根据权利要求7所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂的制备方法，其特征在于，所述PGP9.5抗原为纯度95％以上的PGP9.5基因工程重组抗原、或合成多肽、或亲和纯化抗原。
9.根据权利要求7所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂的制备方法，其特征在于，所述胶体金的烧制方法为：用双蒸水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100毫升0.01％氯金酸加入4毫升1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。
10.根据权利要求7所述的神经元胞质蛋白基因产物9.5抗体胶体金检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤S2离心处理的条件是13000rpm离心30-35分钟。
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