CN105004865A - 一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸 - Google Patents

Abstract

一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，它包括依次相互搭接的样品垫、金标垫、醋酸纤维素膜和吸水垫，醋酸纤维素膜上设有测试带和质控带，所述金标垫包被有金标抗体，测试带包被有烯醇化酶重组抗原，质控带包被有羊抗小鼠IgG抗体。上述试纸能够及时、明确地判断待测样品是否抗白念珠菌烯醇化酶抗体，从而诊断患者是否遭受侵袭性念珠菌的感染，具有特异性、灵敏性高，操作简单快捷的特点。

Description

一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸

技术领域

本发明涉及抗体检测技术领域，特别是一种白念珠菌抗体的检测试纸。

背景技术

念珠菌为条件致病性真菌，正常情况下可定植于宿主的皮肤、口腔、上呼吸道、***和肠道等部位，不引起疾病。当某些因素如广谱抗生素大量使用、放疗与化疗、免疫抑制剂使用等破坏了宿主免疫***与念珠菌之间的平衡，念珠菌可侵入组织、血液并生长繁殖，导致宿主的组织损害、器官功能障碍和炎症反应等病理改变，此类感染为侵袭性念珠菌病 (invasive candidiasis, IC)，致病菌多为白念珠菌。

烯醇化酶 (enolase, eno1) 又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸转化，是糖酵解过程的限速酶。一直以来认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白，然而随着分子生物学对有免疫原性蛋白的研究日趋发展，发现该酶是IC血清学检测最重要的靶标分子，检测人血清中抗白念珠菌烯醇化酶抗体（IgG型）并且以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病原体抗血清，采用以上技术用于诊断侵袭性念珠菌病的ELISA方法已被报道，但这一方法存在操作复杂，技术门槛较高的缺点，使其推广和应用受到一定程度的限制。

发明内容  

本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，利用重组白念珠菌烯醇化酶蛋白作为抗原制备胶体金免疫层析试纸，用于检测抗烯醇化酶IgG抗体，能够及时、明确地判断待测样品中是否含有抗白念珠菌烯醇化酶抗体，并具有特异性、灵敏性高，操作简单快捷的特点。

本发明所述技术问题是以下述技术方案实现的：

一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，它包括依次相互搭接的样品垫、金标垫、醋酸纤维素膜和吸水垫，醋酸纤维素膜上设有测试带和质控带，所述金标垫包被有金标抗体，测试带包被有烯醇化酶重组抗原，质控带包被有羊抗小鼠IgG抗体。

上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述金标抗体为在金溶液中加入小鼠抗人IgG抗体，抗体的终浓度为8ug/ml，制成标金溶液；将标金溶液混合牛血清蛋白后以点膜浓度10ul/cm喷涂金标垫。

上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述羊抗小鼠IgG抗体为在浓度为0.01mol/L的PB缓冲液中加入羊抗小鼠IgG抗体，抗体终浓度为1.0mg/ml。

上述白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，所述烯醇化酶重组抗原的制备包括步骤如下：

A、重组烯醇化酶蛋白：在白念珠菌烯醇化酶基因的核酸序列中设计引物，以PCR技术扩增目的基因，扩增产物经纯化后以内切酶进行双酶切，得到重组基因转入表达载体质粒pET30a，将构建好的表达质粒pET30a-eno1转染感受态细胞，以诱导剂IPTG诱导重组蛋白表达，经收集纯化得到白念珠菌烯醇化酶重组蛋白；

B、制备烯醇化酶蛋白：将步骤A制得的白念珠菌烯醇化酶重组蛋白在室温融化后，经12000r/min高速离心机离心10min，取上清液用0.01mol/L的PB缓冲液稀释，烯醇化酶蛋白的终浓度为0.8~1.0 mg/ml。

本发明采用胶体金免疫层析技术（gold immunochromagraphy assay，GICA）用重组的白念珠菌烯醇化酶制备免疫层析检测试纸，可以检测人血清样品中是否存在抗烯醇化酶IgG抗体，作为筛查和诊断侵袭性念珠菌的辅助指标。用胶体金层析试纸进行检测，操作简单，诊断速度快，结果清晰易于判断，可直接、定性地检测待测样品中的IgG抗体，无需复杂的实验技能和特殊设备，同时检测试纸具有试剂稳定、易于保存的特点。这种无创伤、简易的检测手段可用于临床侵袭性念珠菌高危患者和可疑患者的快速诊断筛查，特别适于在基层卫生单位和野外条件使用。本发明具有如下突出优点：

1、敏感性好，特异性较高，待测样品如血清或血浆的用量只需100μL即可进行检测。利用胶体金层析试纸条对侵袭性念珠菌患者及健康人群的血清样品进行实际检测显示，在具有统计学意义的条件下，侵袭性念珠菌病患者的检出率可达到65％以上，检测特异性95%以上。

2、操作简便快捷，检测速度快，成本低，可由无专业背景人员直接进行操作，并可在30分钟内得出检测结果。

胶体金免疫层析试纸的测试效果依赖于烯醇化酶蛋白的工作浓度和金标垫的包被浓度等参数，而且念珠菌为正常的人体寄生菌，健康个体未发生感染时血液中亦存在少量的抗念珠菌烯醇化酶抗体，而发生感染时，该抗体滴度大幅度升高，因此确定烯醇化酶蛋白的工作（包被）浓度是层析试纸测试效果的关键参数，过高的工作浓度可引起假阳性率增高，从健康人血清中检出烯醇化酶抗体；而工作浓度过低可能引起假阴性率增高，无法从念珠菌感染患者血清中检测出烯醇化酶抗体。本发明经过不断试验反复摸索得出上述关键参数的浓度范围，从而减少了产生假阳性信号和假阴性信号而造成误判的可能性，提高了测试的灵敏性和准确度。

附图说明

图1是本发明胶体金试纸结构示意图；

图2是本发明白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳及WB验证图。

图中各标号清单为：1、吸水垫，2、硝酸纤维素膜，3、金标垫，4、样品垫，5、样品，6、测试带，7、质控带。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明将重组白念珠菌烯醇化酶蛋白为抗原的胶体金免疫层析试纸用于检测烯醇化酶IgG抗体，制备的过程包括白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的获得和胶体金免疫层析试纸的制备。其中烯醇化酶重组蛋白是通过构建原核表达质粒pET30a-eno1、转化并发酵培养、蛋白纯化而获得的；将纯化的蛋白以磷酸盐缓冲液（PBS）充分透析，用 Western blot 分析验证获得的蛋白与IC小鼠血清发生强烈的免疫反应。在确定重组烯醇化酶蛋白工作浓度、羊抗小鼠免疫球蛋白的包被浓度及金标垫的包被参数后，制备胶体金免疫层析试纸。

一、白念珠菌烯醇化酶重组蛋白的获得

1.1 菌株和质粒

菌株：白念珠菌ATCC MYA-2876 (SC5314)，美国标准生物品收藏中心；

质粒：pET30a表达质粒，德国merckmillipore公司；

表达宿主菌：大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)，北京全式金生物公司。

1.2 引物设计

根据白念珠菌SC5314的烯醇化酶基因序列eno1 (GenBank登录号：NW_139596)，利用Primer Premier5.0软件设计特异性引物，并在引物中加入限制性内切酶酶切位点及若干保护碱基。

引物Eno1_F：CCGGATCCATGTCTTACGCCACTAAAATC (下划线为内切酶BamHⅠ酶切位点)，

引物Eno1_R：GCCTCGAGTTACAATTGAGAAGCCTTTTG(下划线为内切酶XholⅠ酶切位点)。

合成的引物以适量灭菌去离子水溶解，浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

1.3 白念珠菌SC5314的培养与基因组DNA提取

将冻存的白念珠菌SC5314经科马嘉真菌鉴定培养基培养后，挑取单个绿色菌落于酵母膏胨葡萄糖液体培养基（YPD培养基）扩大培养，培养条件为温度35℃，通入5%CO₂进行培养12小时。

将扩大培养后的菌液离心，将菌体沉淀以山梨醇缓冲液重新悬浮（重悬），在室温下孵育10min，离心去上清液。通过溶细胞酶处理后用真菌DNA提取试剂盒（OMEGA公司）提取白念珠菌DNA。提取方法为：用470μL山梨醇缓冲液重悬沉淀，加入25 μL真菌破壁酶（北京Solarbio公司）和5 μL b-巯基乙醇，30℃水浴4h，离心分别收集沉淀，用DNA提取试剂盒提取DNA。用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度。

1.4 聚合酶链式反应（PCR）扩增eno1基因

以提取的白念珠菌DNA为模板，进行PCR扩增（无细胞分子克隆，模拟天然DNA复制的过程，在体外扩增特异性DNA片段），得到白念珠菌烯醇化酶的全长基因。PCR 反应体系为 ：

2×PCR mix                   25 μL

（为DNA聚合酶、dNTP及电泳时所需loading buffer的成分）

白念珠菌SC5314DNA           1μL

引物Eno1_F (20mmol/L)         1.5μL

引物Eno1_R(20mmol/L)         1.5μL

去离子水                      21μL

Total volume                   50μL

使用PCR mix反应体系的试剂盒为大连TaKaRa公司Prime-STAR                                               Max DNA polymerase PCR mix，反应参数为95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min，扩增产物于4℃保存备用，并用琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物（PCR产物）片段长度和纯度。

1.5表达载体pET30a-eno1的构建和鉴定

对PCR产物进行回收纯化后，用BamHⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶（Fermentas公司）对pET30a质粒和纯化回收的eno1 PCR产物进行双酶切，经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根公司）回收双酶切产物，双酶切产物用T4连接酶（Fermentas公司）连接，转化感受态大肠埃希菌E. coli BL21（DE3）。以50 μg/mL卡那霉素LB平板筛选阳性克隆，经PCR与酶切鉴定后测序。上述DNA的回收、酶切、连接反应、细胞转化和阳性细胞克隆的筛选与鉴定均参照《分子克隆实验指南》中所述的条件或按照试剂盒制造厂商所建议的条件进行。

1.6 Eno1重组蛋白的诱导表达纯化、鉴定

诱导：挑取鉴定后含重组质粒pET30a-eno1单个菌落，37℃活化过夜。转移至50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，35℃温度下180rpm震荡培养，待其A600=0.4～0.6时，在菌液中加入的诱导剂0.1mol/L IPTG诱导培养5h，加入的诱导剂终浓度为0.1 mM/L。离心弃上清液收集菌体。

纯化：为保证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，纯化重组烯醇化酶蛋白。将收集的菌体以1/10体积的冰预冷超声缓冲液（0.1mol/L NaH₂PO₄，0.01 mol/L Tris，pH8.0）重悬，超声破碎。收集上清液，按照His-trap HP镍离子亲和层析柱（美国GE公司）说明书操作，纯化后收集白念珠菌烯醇化酶重组蛋白。将重组蛋白置于-80℃冰箱，备用。

鉴定：用12%的SDS-PAGE凝胶电泳观察纯化后重组蛋白的分子量大小，理论上重组烯醇化酶蛋白eno1分子量约为48kD，如图2中A所示，重组蛋白分子量与预期基本一致。将纯化的重组蛋白电转印至PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）上，继而将PVDF膜浸入30 g/L BSA-TBST（牛血清蛋白-TBST缓冲液）中37℃封闭2h，抗体为1:5000稀释的HRP标记的小鼠His-tag mAb。洗膜后放入DAB显色液中显色，待条带清晰放入蒸馏水中终止反应，分析重组蛋白与His-tag mAb的反应情况。如图2中B所示，获得的重组烯醇化酶蛋白可以与His标签单克隆抗体反应，确认该蛋白由重组得来。

二、胶体金免疫层析试纸的制备。

试剂：氯金酸（HAuCl₄.H₂O）为上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇2H₂O）为北京北化精细化学品有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA）为Sigma公司产品；小鼠抗人IgG抗体，抗小鼠IgG抗体均为北京鼎国公司产品。制备胶体金所用的容器应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用超纯水冲洗晾干备用。

1、胶体金颗粒的制备（烧金）

三角烧瓶酸洗后用超纯水冲洗五遍，加入99毫升超纯水，电子天平称重。将三角烧瓶放置于磁力搅拌器上，加热至水沸腾，开搅拌加入1毫升1%氯金酸溶液（w/v，1g/100mL），搅拌均匀并加热至沸腾后降低转速和温度，微沸后再快速加入1.5毫升的1%(w/v)的柠檬酸钠溶液，打开加热并继续搅拌，溶液颜色由淡黄色逐渐变为紫色、紫黑色最后呈亮红色。待颜色不再变化后，关掉加热，继续搅拌5分钟。三角烧瓶放入冷水中冷却至室温，制得金溶液中金颗粒直径约为30nm。将金溶液保存在玻璃瓶内用封口膜封口放入4℃冰箱。

2、胶体金复合物的制备（标金）

取一定体积的胶体金溶液，按2ul/ml 的比例用移液枪加入浓度为0.2mol/L的碳酸钾溶液至胶体金溶液中，碳酸钾溶液需逐滴加入并不断搅拌，混匀后按8ug/ml的比例加入浓度为1.0mg/ml的小鼠抗人IgG，逐滴加入并不断搅拌，混匀后在4℃冰箱中静置12小时。

取出上述溶液后平衡至室温，加入浓度为10%牛血清白蛋白（BSA）(w/v)，使BSA的浓度为1%(w/v)，加入过程中不断搅拌，加完后继续搅拌20min，4℃冰箱中静置4小时。取出溶液在4℃温度下，高速低温离心机中离心20分钟（转速为10000转/分钟）。离心后弃去上清，将沉淀以浓缩十倍的比例加入复溶液中复溶（复溶液的体积为原溶液的十分之一），制成胶体金复合物。复溶液为0.01mol/L的TRIS缓冲液+5%蔗糖(w/v)+1%海藻糖(w/v)，用盐酸调节pH至8.5。

3、金标垫的制备（喷金）

在喷金点膜仪上设置点膜浓度为10ul/cm，金标垫（材料为奥斯龙9864的玻璃纤维）的宽度为5mm，长30cm，在金标垫上喷胶体金复合物，喷金完成后，金标垫置于烘箱37℃烘干，密封保存。

4、硝酸纤维素膜的制备（划膜）

制备C/T工作液，C工作液：往浓度为0.01mol/L的PB缓冲液（磷酸缓冲液）中加入羊抗小鼠IgG抗体，使抗体终浓度为1.0mg/ml，调节pH7.53。T工作液：将上步骤制成的重组烯醇化酶抗原在室温融化，经12000r/min高速离心机离心10min，取上清液用0.01mol/L的PB缓冲液（pH7.2）稀释，使烯醇化酶蛋白的终浓度为0.8-1.0 mg/ml，优选烯醇化酶蛋白的终浓度为1.0 mg/ml。

PVC板上粘贴硝酸纤维素膜（MILIPPO公司135膜），设置点膜仪的点膜浓度为1.0L/cm。经点样仪以dispenser线形按设置浓度包被T工作液在硝酸纤维素膜上，形成测试带（T线）为结果的测试反应区。距离测试带5mm处用dispenser线形按设置浓度包被C工作液，形成质控线（C线）。划膜后将硝酸纤维素膜37℃干燥2h，4℃密封保存。

5、样品垫处理

将样品垫在样品处理液中浸泡，样品处理液为浓度为0.02M 的TRIS缓冲液+0.75%S17（表面活性剂Rhodasurf）调节pH值至8.2。浸泡后将样品垫37℃烘箱烘干。

6、试纸组装：

如图1所示，在白色PVC底板上，将金标垫3的右侧压在硝酸纤维素膜2上，重叠1cm，样品垫4的右侧压在金标垫3上重叠1cm，吸水垫1的左侧压在硝酸纤维素膜上重叠2mm。组装后制成胶体金层析试纸。整个试纸条用双面胶贴附于PVC底板上。

免疫层析试纸分为3部分，上段为手持部位包括吸水垫1，能够吸收检测样品中多余液体，中段为实验反应区包括硝酸纤维素膜2，硝酸纤维素膜2上为判读结果的测试带6（T线）和指示试纸条质量的质控带7（C线），下段为样品区包括金标垫3和样品垫4，样品垫4用于接触待检测样品，在样品垫4和硝酸纤维素膜2之间放置浸有胶体金复合物的金标垫3。

三、烯醇化酶IgG抗体胶体金免疫层析试纸的检测及效能评价

检测方法：

取50～100L待检样品加到样品垫4上，在30分钟内观察并记录结果，最佳观察时间为10～15分钟。

结果判断：

阳性结果：在试纸条的测试带6和质控带7的位置上各出现一条***条带。

阴性结果：仅试纸条的质控带7位置上出现一条***条带。

无效结果：在试纸条的测试带6和质控带7位置上均未出现***条带

将待测样品滴加在试纸条的样品垫4上，样品向吸水垫1的方向流动，当流到金标垫3时，金标抗体溶解，与样品中的抗烯醇化酶IgG结合形成复合物。当金标鼠抗人IgG抗体–抗烯醇化酶IgG复合物继续前移时，在测试带6与包被抗原结合，形成金标鼠抗人IgG抗体–抗烯醇化酶IgG–重组烯醇化酶抗原复合物而凝聚显色，而在质控带7处形成金标鼠抗人IgG抗体-羊抗鼠二抗复合物而显色，如质控带未显色则表明该试剂无效。

效果实施例

按照欧洲肿瘤/真菌研究与治疗组织（European Organization for the Research and Treatment of Cancer/Mycoses Study Group, EORTC/MSG）的诊断标准与原则，收集临床确诊侵袭性念珠菌病患者血清为实验组，以健康体检者血清作为阴性对照组，共收集实验组血清38份，健康对照组血清45份。为保证检测的有效性，所有实验组样本均在患者血液或者无菌部位检测出念珠菌感染后一周之内收集。为尽量减少组间误差，收集样本时尽量使组间患者的年龄、性别分布一致。

用实施例中制备的胶体金免疫层析试纸检测各组血清抗烯醇化酶IgG抗体，分别记录各组阴性与阳性例数，以临床微生物实验室真菌培养结果为金标准计算抗烯醇化酶IgG抗体胶体金免疫层析试纸用于诊断侵袭性念珠菌病的敏感性 (sensitivity)、特异性 (specificity)。计算方法如下：

敏感性=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）*100%；

特异性=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）*100%；

在38例确认侵袭性念珠菌感染的患者血清中，检测出阳性26例，检测敏感性为68.4%；45例健康对照者血清中，仅检测出弱阳性2例，其检测特异性为95.6%，可见本发明具有较好的敏感性和很高的特异性。

Claims (4)

1.一种白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，它包括依次相互搭接的样品垫（4）、金标垫（3）、醋酸纤维素膜（2）和吸水垫（1），醋酸纤维素膜（2）上设有测试带（6）和质控带（7），其特征在于，所述金标垫（3）包被有金标抗体，测试带（6）包被有烯醇化酶重组抗原，质控带（7）包被有羊抗小鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，其特征在于，所述金标抗体为在金溶液中加入小鼠抗人IgG抗体，抗体的终浓度为8ug/ml，制成标金溶液；将标金溶液混合牛血清蛋白后以点膜浓度10ul/cm喷涂金标垫。

3.根据权利要求2所述的白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，其特征在于，所述羊抗小鼠IgG抗体为在浓度为0.01mol/L的PB缓冲液中加入羊抗小鼠IgG抗体，抗体终浓度为1.0mg/ml。

4.根据权利要求3所述的白念珠菌烯醇化酶抗体的检测试纸，其特征在于，所述烯醇化酶重组抗原的制备包括步骤如下：

A、重组烯醇化酶蛋白：在白念珠菌烯醇化酶基因的核酸序列中设计引物，以PCR技术扩增目的基因，扩增产物经纯化后以内切酶进行双酶切，得到重组基因转入表达载体质粒pET30a，将构建好的表达质粒pET30a-enol转染感受态细胞，以诱导剂IPTG诱导重组蛋白表达，经收集纯化得到白念珠菌烯醇化酶重组蛋白；

B、制备烯醇化酶蛋白：将步骤A制得的白念珠菌烯醇化酶重组蛋白在室温融化后，经12000r/min高速离心机离心10min，取上清液用0.01mol/L的PB缓冲液稀释，烯醇化酶蛋白的终浓度为0.8~1.0 mg/ml。