DK160108B - Fremgangsmaade og udstyr til direkte eller indirekte paavisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans - Google Patents
Fremgangsmaade og udstyr til direkte eller indirekte paavisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans Download PDFInfo
- Publication number
- DK160108B DK160108B DK557684A DK557684A DK160108B DK 160108 B DK160108 B DK 160108B DK 557684 A DK557684 A DK 557684A DK 557684 A DK557684 A DK 557684A DK 160108 B DK160108 B DK 160108B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- specific binding
- reaction
- colloidal metal
- binding agent
- labeled
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 22
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 55
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 55
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 17
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 14
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 13
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 7
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 6
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- -1 diazo-benzyloxymethyl Chemical group 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- LMEWRZSPCQHBOB-UHFFFAOYSA-M silver;2-hydroxypropanoate Chemical compound [Ag+].CC(O)C([O-])=O LMEWRZSPCQHBOB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WJWMRPDAOIYYRX-UHFFFAOYSA-N 4-(4-diazoniophenyl)sulfanylbenzenediazonium Chemical compound C1=CC([N+]#N)=CC=C1SC1=CC=C([N+]#N)C=C1 WJWMRPDAOIYYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052976 metal sulfide Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 description 1
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 244000024671 Brassica kaber Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QPLDLSVMHZLSFG-UHFFFAOYSA-N Copper oxide Chemical compound [Cu]=O QPLDLSVMHZLSFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005751 Copper oxide Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000585553 Homo sapiens Glycodelin Proteins 0.000 description 1
- 108091077621 MAPRE family Proteins 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N Trioxochromium Chemical compound O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHCLAFWTIXFWPH-UHFFFAOYSA-N [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[V+5].[V+5] Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[V+5].[V+5] XHCLAFWTIXFWPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108091000387 actin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- CUGMJFZCCDSABL-UHFFFAOYSA-N arsenic(3+);trisulfide Chemical compound [S-2].[S-2].[S-2].[As+3].[As+3] CUGMJFZCCDSABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229910000423 chromium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- VQWFNAGFNGABOH-UHFFFAOYSA-K chromium(iii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Cr+3] VQWFNAGFNGABOH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000431 copper oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229910052981 lead sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940056932 lead sulfide Drugs 0.000 description 1
- IPJKJLXEVHOKSE-UHFFFAOYSA-L manganese dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mn+2] IPJKJLXEVHOKSE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 1
- ADZWSOLPGZMUMY-UHFFFAOYSA-M silver bromide Chemical compound [Ag]Br ADZWSOLPGZMUMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N sulfanylidenemercury Chemical compound [Hg]=S QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019263 trisodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229910001935 vanadium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/559—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody through a gel, e.g. Ouchterlony technique
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Communication Control (AREA)
- Details Of Television Scanning (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Curing Cements, Concrete, And Artificial Stone (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
i
DK -00103 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af et agglomerat dannet af et bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved såkaldt "blot overlay assay", i det følgende kaldet aftryksanalyse. Sidstnævnte substans er sædvanligvis in-5 deholdt i en vandig testprøve og bliver på et senere trin af analysen adsorberet på og/eller bundet kovalent til en immobiliseringsmatrix. Eksempler på immobiliseringsmatrixer er nitrocellulose- (NC)-film (tynde plader af salpetersyreforestret cellulose med kendt porøsitet), diazo-benzyloxymethyl- (DBM)- og diazophenylthioether- (DPT)-modificeret cello lulosepapir, papir eller cel!uloseacetat aktiveret med cyanogenbromid og nylonbaserede membraner såsom "Gene Screen" og "Zetabind". Sidstnævnte er en nylonmatrix (en polyhexamethylenadipamin betegnet "Nylon 66"), der er modificeret ved indføring af talrige tertiære aminogrupper under fremstillingen. Disse immobiliseringsmatrixer omtales i almindelighed 15 som "blotting media", i det følgende betegnet aftryksmedier. (Se for eksempel J.M Gershoni og G.E. Pallade, Analytical Biochemistry 131, 1-15 (1983)).
Aftryksanalysemetoder kan generelt opdeles i to forskellige teknikker: 20 A. Ved sandwichanalysen knyttes det rensede eller berigede specifikke bindingsmiddel til immobiliseringmatrixen i henhold til B (se nedenfor), fortrinsvis som en lille plet, og acceptorsubstansen gives lejlighed til at binde til det, hvilket resulterer i, at der på matrixen sker en mobilisering af acceptorsubstansen, som derefter kan påvises. På 25 grund af det specifikke bindingsmiddels specificitet er det muligt at isolere acceptorsubstansen fra en kompleks testprøve såsom urin, plasma, serum, andre legemsfluider, cellefri translationssystemer, celle- og vævslysater, etc., og at anvende denne metode til semikvantitative og/-eller kvalitative (diagnostiske) analyser: den såkaldte "sandwich blot 30 overlay assay" (SBOA). Hidtil har den praktiske værdi af SBOA været ubetydelig, fordi man kun har haft forholdsvis komplekse påvisningsmetoder til rådighed. Den foreliggende opfindelse gør påvisningen meget enkel, og interessen i at anvende et SBOA til diagnotisk brug kan øges.
B. Ved den direkte aftryksanalyse knyttes acceptorsubstansen di-35 rekte til et aftryksmedium ved en procedure, der er kendt som "transferring", i det følgende kaldet overførsel, eller "blotting”, i det følgende kaldet aftrykning. Forskellige metoder dertil er velkendte fra litteraturen. For eksempel anbringes små dråber indeholdende en
DK 16C1G8 B
2 kendt eller ukendt mængde acceptorsubstans (renset eller ikke) i en vandig opløsning af størrelsesordenen 1 /al (men andre volumener kan også anvendes) som pletter på aftryksmediet for at give acceptorsubstansen mulighed for at blive knyttet til aftryksmediet. Sådanne pletaftryk har 5 potentiel anvendelighed til diagnostisk påvisning af tilstedeværelsen af specifikke bindingsmidler for den immobil i serede acceptorsubstans i forskellige legemsfluider. Hvis acceptorsubstansen indgår i en kompleks blanding, kan blandingen først adskilles ved forskellige kromatografiske teknikker såsom tyndtlagskromatografi eller elektroforeseteknikker, for 10 eksempel i polyacrylamidgeler såsom natriumdodecylsul fat- (SDS)-elektro-forese, isoelektrisk fokusering, 2-D-gel-elektroforese, gradient gel- og syre-urinstofgelelektroforese og ikke-denaturerende gelelektroforese for at lette identifikation af acceptorsubstansen. I nogle tilfælde som for eksempel til nukleinsyrer kan agargeler også anvendes. De elektroforets tisk opløste komponenter (såsom proteiner, peptider og nukleinsyrer) overføres derefter til immobiliseringsmatrixen ved procedurer kendt som kapillar-, vakuum- eller elektrooverførsel (eller -aftrykning). Komponenterne immobil i seres derefter på aftryksmediet under vidtgående bibeholdelse af det oprindelige elektroforetiske mønster. Dette færdige møn-20 ster kan gøres synligt ved kendte farvningsteknikker såsom ved hjælp af "amido black" og "coomassie blue" og komponenten, som er under undersøgelse (acceptorsubstansen), kan påvises (se senere) og dens placering sammenlignes med hele det elektroforetiske mønster.
Hidtil har de fleste af de anvendte specifikke bindingsmidler været 25 proteiner, som bindes til veldefinerede områder i acceptorsubstansen.
Lectiner anvendes til påvisning af glycoproteiner. Polyklonale og mono-klonale antistoffer til påvisning af de tilsvarende antigener eller hap-tener (for eksempel biotin eller biotinylerede DNA-prober med antibiotin, DNP på dinitrophenylerede proteiner med anti-DNP). Aftryksanalyser 30 anvendes allerede i vid udstrækning til påvisning af antistoffers specificitet og til screening af produktionen af monoklonale antistoffer. Ud over disse i vid udstrækning anvendte systemer kan mange andre indbyrdes protein-protein (for eksempel calmodulin- eller actinbindingsproteiner) eller protein-ligand (for eksempel avidin-biotin) reaktioner, hvor den 35 ene af komponenterne immobiliseres, analyseres. Blandt disse er DNA-pro-tein- og RNA-proteinreaktioner, receptor-ligandreaktioner og i almindelighed vilkårlige andre indbyrdes makromolekyle-makromolekylereaktioner af tilstrækkelig specificitet og affinitet.
DK 160108B
3
En væsentlig del af aftryksanalyserne er den metode, der anvendes til synliggøre!se af den immobil i serede acceptorsubstans. Der eksisterer både direkte og indirekte teknikker. Ved synliggøreisen benyttes markører: radioaktive isotoper (3H, 14C, 32P, 35S eller 5 125I) efterfulgt af autoradiografi sk fremkaldelse, enzymer som kan danne uopløselige farvede produkter eller fluorochromer. Ved direkte metoder bindes markøren til det specifikke bindingsmiddel. Ved indirekte metoder bindes det til et makromolekyle, som specifikt kan bindes til det første specifikke bindingsmiddel. Hvis sidstnævnte er et antistof, 10 kan makromolekylet være protein A eller et sekundært antistof. Fler-trinsteknikker, som avidinbi oti nyleret peberrodsperoxidasekompleks-(ABC)-metoden og umærket peroxidase-antiperoxidase- (PAP)-metoden kan også anvendes til antistoffer.
Det væsentlige punkt ved den foreliggende opfindelse er anvendelsen 15 af en dispersion af et metal eller en metalforbindelse eller en kerne, som er belagt med et metal eller en metalforbindelse til synliggøre!se og/eller påvisning ved aftryksanalyseteknikker. Som udtrykket "kolloida-le metal parti kl er" anvendes i den foreliggende sammenhæng, indbefatter det dispersioner af partikler, eventuelt en sol, bestående af et metal, 20 en metalforbindelse eller en kerne belagt med et metal eller en metalforbindelse.
Kolloidale metal parti kl er kan fremstilles ved hjælp af fremgangsmåder, som er kendte inden for området, for eksempel til fremstilling af kolloidalt guld, sølv eller jernoxid og lignende. Kolloidale metalpar-25 tikler kan knyttes direkte eller indirekte til det specifikke bindingsprotein eller acceptorsubstansen eller til et makromolekyle, som bindes specifikt til det første specifikke bindingsmiddel, for eksempel protein A, sekundært antistof (når der er tale om et primært antistof) eller streptavidin og avidin (når der er tale om, at en af komponenterne er 30 biotinyleret) under bibeholdelse af størsteparten af den oprindelige bindingsaktivitet ved at følge fremgangsmåder, som er kendte inden for området. Ved knytning forstås enhver kemisk eller fysisk binding såsom binding via kovalente bindinger, via hydrogenbroer, polær tiltrækning og adsorption.
35 Det har nu vist sig, at når et aftryksmedium, hvortil der enten in direkte (se A) eller direkte (se B) er knyttet en acceptorsubstans, inkuberes med en passende koncentration af et specifikt bindingsmiddel mærket med kolloidale metal parti kl er (direkte påvisningsmetode) eller 4
DK 16010B B
først med et umærket specifikt bindingsmiddel og derefter med et makro-molekyle mærket med kolloidale metal parti kl er (indirekte påvisningsmetode), vil akkumuleres kolloidale metal parti kl er på de specifikke bindingssteder, som overraskende bliver synlige som den karakteriske farve 5 for de anvendte kolloidale metal parti kl er. For eksempel opnås der en lyserød til mørkerød farve, når et metal som guld anvendes, og en gul til brun/sort farve, når sølv anvendes. Denne farve udgør et signal, som kan aflæses kvalitativt med det blotte øje eller eventuelt måles ved kendte spektrofotometriske metoder, såsom densitometri.
10 Partikelstørrelsen af de kolloidale metal parti kl er er fortrinsvis mellem 3 nm og 100 nm og mere foretrukket mellem 5 nm og 50 nm.
Som eksempler på kolloidale metal parti kl er, der kan knyttes til specifikke bindingsmidler, er metallerne platin, guld, sølv og kobber og metalforbindelserne søl vi odid, sølvbromid, hydrati seret kobberoxid, 15 jernoxid, jernhydroxid eller hydratiseret jernoxid, aluminiumhydroxid eller hydratiseret aluminiumoxid, chromhydroxid eller hydratiseret chromoxid, vanadinoxid, arsensulfid, manganhydroxid, blysulfid, kviksølvsulfid, bariumsulfat og titandioxid blevet beskrevet. Det er også kendt, at kolloider bestående af kerner belagt med ovennævnte metaller 20 eller metalforbindelser kan anvendes. Disse partikler har lignende egenskaber som metal- eller metalforbindelsekolloiderne, men størrelse, densitet og metalindhold kan kombineres optimalt. I almindelighed kan alle kolloidale metal parti kl er eller metalforbindelser, som kan bindes til specifikke bindingsmidler uden ødelæggelse af deres bindingsaktivitet, 25 og som vil give en farveintensitet ved aftryksanalyse, som er tilstrækkelig til at kunne ses med det blotte øje, anvendes. Sensitiviteten er fortrinsvis lig med eller bedre end den, der opnås med guld eller sølv.
Anvendelsen af kolloidale metal parti kl er, specielt guldsoler, som er dækket på overfladen med specifikke bindingsmidler såsom antistoffer, 30 lectiner, protein A, avidin og mange andre, eller selv acceptorproteiner såsom antigener er nu veletableret ved mange cytokemiske mærkningsteknikker inden for transmissions- og scanningelektronmikroskopi. Et eksempel på anvendelse af en kolloidal metal parti kel bestående af en polymer belagt med et metal er dextran belagt med jern, som, når det knyttes til 35 antistoffer, frembringer en meget værdifuld markør til transmissionselektronmikroskopi. Disse anvendelser udnytter imidlertid disse markørers typiske elektronopacitet (transmissions EM) eller deres kapacitet til at emittere sekundære elektroner eller give tilbagekastning af pri-
DK 1 60 1 08 B
5 røre elektroner (scanning EM).
Kolloidale metal parti kl er, navnlig partikler fremstillet af guld og sølv, anvendes også som markører ved cytokemiske rørkningsteknikker i forbindelse med lysmikroskopi, efter at det har vist sig, at akkumule-5 ring af sådanne kolloidale metal parti kl er på bindingssteder i vævspræparater eller på celleoverflader kan ses, forudsat at præparatet betragtes gennem et lysmikroskop.
Kolloidale metal parti kl er anvendes også til visse kvalitative og kvantitative in vitro bestemmelser af immunologiske komponenter såsom 10 haptener, antigener og antistoffer i vandigt medium. Disse teknikker er blevet kaldt sol parti kelimmunoanalyser og passiv guldagglutinering ("Geoghegan").
Den passive guldagglutineringsteknik er baseret på agglutinering af et guldmærket antigen (guldpartikler 18 til 20 nm) med umærket antistof 15 og indbefatter anvendelse af et standardmi krotitersæt, hvori ikke-aggre-geret guld flyder ned langs fordybningernes sider og danner en rød stribe. Denne teknik er analog med klassisk passiv hæmagglutinering og er ligeså følsom og er blevet hævdet muligvis at kunne anvendes til omvendt agglutinering, hvor det er antistoffet, som mærkes med guld.
20 Sol parti kelimmunoanalyser ligger inden for to kategorier. Den første kaldes homogen sol parti kelimmunoanalyse og er baseret på agglutinering af antistofmærkede kolloidale partikler med immunokemisk di- eller multi val ente antigener eller med haptener koblet til et bærerprotein. Agglutineringen resulterer i en farvereduktion målt kolorimetrisk med 25 puffer som blindprøve. Agglutineringen af de kolloidale metal parti kl er kan derefter inhiberes af frie haptenmolekyler fra prøven. Sådanne metoder beskrives i europæisk patentskrift nr. 0007654.
Den anden type sol parti kelimmunoanalyse er baseret på bundet/fri kolloidal metal parti kelkonjugatadski11 el sesmetoder, som er analoge med 30 radioimmunoanalyse og enzymimmunoanalyse. Sådanne metoder beskrives i europæisk patentskrift nr. 0007654. En sådan metode kaldes "Sandwich Sol Particle Immunoassay" (SSPIA) og er analog med en sandwich ELISA eller fastfasesandwichradioimmunoanalyse. Ved en typisk SSPIA adsorberes et antistof mod antigenet, som skal bestemmes, først på overfladen af en 35 mi krotitreringsplade (for eksempel fremstillet af polystyren). En prøve (antigenstandard eller blindprøve) opløst i et passende puffersystem af-pipetteres i fordybningerne, som er belagt med antistof, og inkuberes på passende måde. Guldmærket antistof tilsættes, og reaktionsblandingen in-
6 DK 160103 B
kuberes yderligere. Fordybningerne suges tomme og vaskes for at fjerne ubundet konjugat. Endelig frigøres det bundne immunkompleks sammen med de homogeniserede kolloidale metal parti kler. Enten inspiceres farvein-tensiteten af den opnåede dispersion visuelt, eller metal koncentrationen 5 måles ved hjælp af et kolorimeter. Den visuelle inspektionsmetode (for eksempel farven af det dispergerede guld) har kun kunnet anvendes ved højere antigenkoncentrationer.
Det bør bemærkes, at sol parti kel analyser også er blevet beskrevet som værende værdifulde til ikke-immunologiske analyser, i almindelighed 10 "til påvisning og/eller bestemmelse af én eller flere komponenter fra reaktionen mellem et specifikt bindingsprotein og den tilsvarende substans, som kan bindes, i en vandig testprøve under anvendelse af sådanne komponenters kendte bindingsaffinitet for hinanden, hvorved der anvendes én eller flere mærkede komponenter, som er opnået ved direkte eller in-15 direkte kobling af den ønskede komponent fra reaktionen til partikler af en vandig dispersion af et metal, en metalforbindelse eller en polymer kerne, som er belagt med et metal eller en metalforbindelse med en partikelstørrelse på mindst 5 nm, og der under reaktionen eller efter en passende reaktionstid eventuelt efter adskillelse af bundne og fri mær-20 kede komponenter foretages en bestemmelse af de fysiske egenskaber og/-eller af mængden af metallet og/eller af det dannede metalholdige agglo-merat i testprøven eller én af de opnåede fraktioner på kendt måde, hvilken bestemmelse giver en kvalitativ og/eller kvantitativ indikation for komponenten eller komponenterne, som skal påvises og/eller bestem-25 mes.
Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af kolloidale metal-partikler som markører ved aftryksanalysemetoder. Denne anvendelse er helt ny og har overraskende vist sig at være mulig.
Som udtrykket kolloidale metal parti kl er anvendes, indbefatter det 30 en dispersion af et metal, en metalforbindelse eller en kerne belagt med et metal eller en metalforbindelse.
Anvendelsen af kolloidale metal parti kl er som markører gælder alle former for aftryksanalyser og giver den fordel, at kolloidale metalpartikler, som akkumuleres på bindingsstederne ved aftryksmediets overfla-35 de, bliver direkte synlige for det blotte øje med en følsomhed, som i det mindste er sammenlignelig med den meget høje følsomhed af eksisterende teknikker, såsom enzymbaserede aftryksanalyser. Det understreges, at opfindelsen ikke ville have nogen praktisk værdi uden sidstnævnte
DK 160108 B
7 punkt. Det har den vigtige fordel, at analysen kan aflæses uden behov for en sekundær enzymatisk reaktion, autoradiografi eller et betragtningssystem for fluorescerende farver eller for en frigørelse af de bundne kolloidale metal parti kl er for efterfølgende måling med det blotte 5 øje (lav følsomhed), ved kolorimetri eller CRAAS (højere følsomhed) som ved sandwichsol parti kelimmunoanalyse. Den væsentligste fordel ved metoden er, at den er så enkel i kraft af, at farven fremkaldes under reaktionen. Dette gør det muligt at afbryde reaktionen, når det ønskede signal er frembragt, eller at kalibrere systemet for at opnå et forudbe-10 stemt resultat inden for en fastsat tidsgrænse.
Anvendelsen af guldmærkede antistoffer er meget enklere end og ligeså følsom som en efter den almindelige opfattelse meget følsomme im-munoperoxidasemetode. Denne simple analyse kan anvendes til et testudstyr til indirekte påvisning af tilstedeværelsen af specifikke bindings-15 midler for en acceptorsubstans, som er knyttet til aftryksmediet, og et med kolloidale metal parti kl er mærket specifikt bindingsmiddel for det første specifikke bindingsmiddel. Hvis det specifikke bindingsmiddel er et antistof, kan det være et med kolloidale metal parti kl er mærket sekundært antistof eller protein A. Den vil i praksis kunne anvendes som en 20 meget simpel dyppeprøve, for eksempel en pletaftryksanalyse til hurtig screening for tilstedeværelsen af antistoffer for et udvalgt antigen i en vandig testprøve, såsom serum.
Fremgangsmåden omfatter, at man i på hinanden følgende trin i. immobil i serer acceptorsubstansen til en immobil i serings- 25 matrix kendt som aftryksmedium i.i. enten ved direkte adsorption og/eller kovalent binding, i almindelighed kaldet aftrykning, eventuelt efter anvendelse af en procedure til elektroforetisk adskillelse og anvendelse af en procedure til overførsel eller aftrykning fra det elektroforetiske medium til aftryks-30 mediet og efterfølgende undertrykkelse af tilbageværende proteinbindingssteder på kendt måde såsom ved anvendelse af BSA, gelatine, PEG eller Tween 20, i. ii. eller ved at lade acceptorsubstansen blive bundet med et specifikt bindingsmiddel, som er blevet immobiliseret på aftryksmediet 35 ved, at aftryksmediet bringes i kontakt med en vandig opløsning, der indeholder acceptorsubstansen, ii. i et givet tidsrum bringer aftryksmediet fra i) i kontakt med
DK ", 6 Q10 8 B
8 i i.i. enten med kolloidale metal parti kl er mærkede specifikke bindingsmidler i en passende koncentation eller ii. ii. først umærket specifikt bindingsmiddel i en passende koncentration og derefter et med kolloidalt metal mærket protein, som er 5 specifikt for det umærkede specifikke bindingsmiddel, hvorefter aftryksmediet vaskes og lufttørres, og iii. aflæser det farvede signal, som er frembragt af og karak-terisk for de bundne kolloidale metal parti kl er ved overfladen af aftryksmediet med det blotte øje eller ved anvendelse af kendte spektrofo- 10 tometriske teknikker såsom densitometri.
Opfindelsen angår også testudstyr til anvendelse til den direkte eller indirekte bestemmelse af én af komponenterne i reaktionen mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved en aftryksanalyse, hvilket udstyr omfatter en med kolloidale metal parti kl er 15 mærket komponent, som er opnået ved at koble en komponent i reaktionen eller en komponent, som kan anvendes til indirekte at påvise denne reaktion, til kolloidale metal parti kl er, som defineret ovenfor, samt andre reagenser. Hvis reaktionen er af den immunologiske type, kan testudstyret anvendes til sandwichaftryksanalyser (se eksempel III) og til påvis-20 ning af tilstedeværelsen i serum af antistoffer for udvalgte antigener (se eksempel I).
I en udførelsesform af opfindelsen gøres der brug af den kendsgerning, at påvisningen af de kolloidale metal parti kl er, som er bundet til overfladen af aftryksmediet, som resultat af en aftryksanalyse også kan 25 synliggøres indirekte og/eller forbedres ved anvendelse af en fysisk fremkalder, som kan reduceres til de tilsvarende metaller. Egnede fysiske fremkaldere er for eksempel sølvlactat, sølvnitrat og lignende. Når for eksempel sølv anvendes som fysisk fremkalder, finder reaktionen fra start sted ved overfladen af metal parti kl erne, som katalyserer reduk-30 tionen, og bliver derefter autokatalytisk på disse podekorn. Det resulterer i dannelse af et sort, stærkt kontrastgivende signal, som er tilvejebragt ved akkumulering af metallisk sølv. Dette giver en betragtelig forøgelse af følsomheden. For at opnå lysufølsomme sølvpræcipitater har man også fundet ud af, at aftrykkene må fikseres med et fiksativ, som 35 anvendes til mi krograftryk.
Fysiske fremkaldere har været anvendt i mange år til synliggørelse af vanduopløselige metaller, navnlig metal sulfider i væv (se Danscher, Histochemistry 71, 1-16, 1981). Metal sulfiderne og metallisk sølv har en 9
DK ;6C ·ϋ3 B
katalytisk virkning på reduktionen af sølvioner. Kolloidalt guldmetal i væv kan også vises med en fysisk fremkalder, og dette er blevet udnyttet af Holgate et al. (J. Histochem. Cytochem. 31, 938-944, 1983)) til indføring af immunoguld/sølvfarvningsmetoden, som resulterer i en følsom-5 hed, som er langt bedre end den oprindelige immunoguldfarvningsmetodes. Hovedfordelen ved denne udførelsesform ligger i den meget store følsomhed, som overstiger følsomheden af alle andre eksisterende påvisningsmetoder til aftryksanalyse. Den kan også benyttes, når brugeren ønsker at økonomisere med mængden af reagenser, som anvendes, eller når 10 der er ekstremt små mængder acceptorsubstans og/eller specifikt bindingsmiddel til rådighed.
I en yderligere udførelsesform anvendes et fotografisk fiksativ, hvorved baggrunden mindskes, og stabiliteten af reaktionsproduktet af den fysiske fremkalder forbedres.
15 Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.
Eksempel I
En simpel pletaftryksimmunoanalyse til indirekte påvisning af anti-20 stoffer mod hundehjernetubulin og -calmodulin med guldmærkede sekundære antistoffer i serum fra immuniserede kaniner.
1.1 Fremstilling af antisera 25 1.1 Fremkaldelse af antisera 1 mg hundehjernetubulin (ekstraheret fra SDS-polyacrylamidgeler) i 1,0 ml puffer (0,1M PIPES, pH 6,9) eller 1 mg elektroforetisk rent hun-dehjernecalmodulin (i H20) blandedes med 1,0 ml komplet Freunds adju-vans (DIFCO). Efter homogenisering injiceredes antigenet intradermalt 5 30 steder langs rygsøjlen på hvide kaniner. Boosterinjektioner blev givet hver 4. uge. Antigen fremstilledes på samme måde, bortset fra at der anvendtes ukomplet Freunds adjuvans. 1 uge efter hver booster, tappedes der blod fra kaninerne (±60 ml blod), og serum fremstilledes og opbevaredes i portioner ved -20°C indtil brug.
35 1.2 Kolloidalt guldmærkede sekundære antistoffer
Disse blev leveret fra Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien. Kode: GAR G20. Der er tale om affinitetsrensede gedeantistoffer
10 DK 16 3108 B
mod kanin IgG, som er mærket med 20 nm kolloidale guldpartikler.
Fremstilling af nitrocellulosepapirstrimler med antigenholdige pletter Ti 10 /il dråber af 4-fold seriefortyndinger (begyndende med 250
5 ng//il) af ren tubulin i 0,1M PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,75 eller ren calmodulin i H20 anbragtes som pletter i en række på tørre nitrocellulosestrimler (6 cm x 0,6 cm). Når pletterne tørredes (ca. 5 minutter) undertryktes tilbageværende proteinbindingssteder på strimlerne ved inkubation med en opløsning af 5% okseserumalbumin (BSA) i 20 mM
10 Tris-pufret saltvand, pH 8,2 i 30 minutter ved 37eC.
1.3 Testprotokol for påvisning af tubulin- og calmodul inantistoffer. Sammenligning af anvendelsen af guldmærkede antistoffer med ABC-peroxidasepåvi sni ngsmetoden 15 Den under hele proceduren anvendte puffer var 0,1% BSA-Tris (0,1% BSA i 20 mM Tris-HCl, 0,9% NaCl pH 8,2, 20 mM NaN3), med mindre andet er anført.
20 a. Inkubation med primært antiserum 2 strimler inkuberedes med 1 ml kaninantitubulinserum, 1:1000 fortyndet i 0,1% BSA-Tris, i tilproppede 5 ml plastreagensglas ved stuetemperatur i 2 timer.
2 strimler inkuberedes som ovenfor med samme antiserum
25 absorberet på tubulin bundet kovalent til Sepharose^4B
for at tjene som kontrol for antigenspecificitet.
2 strimler inkuberedes som ovenfor med 1 ml kaninanticalmodulin serum, 1:1000 fortyndet i 0,1% BSA-Tris, ved stuetemperatur i 2 timer.
30 - 2 strimler inkuberedes som ovenfor med samme absorberet på calmodulin bundet kovalent til Sepharose-4B.
Efter inkubation med de absorberede og ikke-absorberede primære antisera vaskedes strimlerne 3 x 10 minutter i 0,1% BSA-Tris. 1 strimmel fra hvert par inkuberedes yderligere med GAR G20 (se 1.3.b).
35 Den anden inkuberedes med det meget følsomme Vectastain ABC immuno-peroxidaseudstyr fra Vector Laboratories anvendt i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner (se 1.3.c).
„ DK 160108 B
b. Inkubation med quldmærket sekundært antistof: GAR G20
De vaskede strimler (se 1.3.a) inkuberedes med GAR G20, fortyndet til O.D. 52omnm = 0,2 ^ 0,1% BSA_Tris + °»4% gelatine, i 2 timer. Efter denne inkubation vaskedes strimlerne i 0,1% BSA-Tris i 2 x 10 5 minutter og lufttørredes.
c. Inkubation med Vectastainudstyret
De vaskede strimler (se 1.3.a) inkuberedes med sekundær biotinyle-ret antistofopløsning (1:200 i 0,1% BSA-Tris) i 1 time. Strimlerne va-10 skedes i et overskud af 0,1% BSA-Tris i 3 x 10 minutter og inkuberedes derefter i avidin-biotinylperoxidasekomplekset i 1 time. Komplekset fremstilledes i henhold til fabrikantens instruktioner: 100 /il reagens A (avidin DH) sattes til 10 ml PBS (Dulbecco's, uden Mg2+ og Ca2+). 100 /il reagens B (biotinyleret peberrodsperoxidase) tilsattes under kontinuert 15 omrøring. Komplekset anvendtes efter 5 minutter. Strimlerne vaskedes i 0,1% BSA-Tris (2 x 10 minutter) og derefter i 100 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,6. Den immobil i serede peroxidase gjordes derefter synlig med 4-chlor- 1-naphtol som substrat: 20 mg 4-chlor-l-naphtol opløstes i 1 ml ethanol og fortyndedes yderligere med 20 ml 100 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,6, op-20 varmet til ca. 50°C. 200 /il 1% H202 tilsattes, og substratopløsningen anbragtes på strimlerne med en sprøjte gennem et mi krofil ter (0,2 /an, mil!i pore) monteret på sprøjten. Reaktionen fik lov til at forløbe i 5 minutter og blev afbrudt ved, at strimlerne vaskedes med Hz0 og lufttørredes.
25 1.4 Vurdering
Ved ABC-proceduren påvises positiv reaktion som en blå farve. Når kolloidalt guld anvendes, opnås der ved positiv reaktion en lyserød-rød-lig farve med den anvendte guldpartikelstørrelse (større guldpartikler, 30 for eksempel 40 nm giver en purpuragtig farve). Følsomheden er den samme for begge metoder og er i størrelsesordenen 5 ng//il for tubulin og 30 ng//il for calmodulin under de anvendte betingelser. Specificiteten vises ved den negative reaktion, når de pågældende antisera adsorberes af deres respektive antigen.
Eksempel II
Screening for tilstedeværelse af monoklonale museantistoffer for mikrotubulusassocierede proteiner i kultursupernatanter fra hybridomer i 35
DK 160108 B
12 vækst under anvendelse af guldmærkede gedeantistoffer mod muse IgG.
2.1 Immunisering af mus
Mus (Balb/C) fik injiceret en homogeniseret blanding (se eksempel 5 1.1) rottehjernemikrotubulusproteiner (100 øg/mus) (fremstillet ved to cykler af temperaturafhængig polymerisation-depolymerisation) og komplet Freunds adjuvans. Injektioner gives subkutant 5 steder på ryggen. Boo-sterinjektioner af antigen (100 jttg) fremstillet med ukomplet Freunds adjuvans blev givet 3 gange med 14 dages mellemrum. 3 dage før fusion af 10 miltcellerne med myelomcellelini en boostedes mus ved intravenøs injektion af 50 /tg antigen/mus i 100 μΐ PBS-puffer.
2.2 Fusion af miltceller med N5-1-myelomceller NS-l-celler fusioneredes med miltceller fra to immuniserede mus på 15 kendt måde, og de resulterende hybridomer dyrkedes i 5 plader med 96 fordybninger (Nunc) ved 374C i en vandmættet atmosfære indeholdende 7% C02. Efter ca, 2 ugers vækst udtoges 100 μΐ af kultursupernatanten fra fordybninger indeholdende hybridomer i vækst og testedes for tilstedeværelse af udskilte monoklonale antistoffer (se 2.4).
20 2.3 Fremstilling af nitrocellulosepapirstrimler, på hvilke et mønster 25 af proteiner fra en SDS-polyacrylamidgel er blevet elektroaf- trykt SDS-polyacrylamidgel elektroforese af antigenet (2 x polymeriserede mikrotubulusproteiner) udførtes efter Laemmlis metode på en 7,5% gel. Antigenet, som var opløst og kogt i prøvepuffer, fyldtes oven på stab-30 lingsgelen som et kontinuert lag, 300 øg pr. gel. Når farvefronten havde migreret 3 cm ind i separeringsgelen, blev elektroforesen afbrudt. En lille lodret strimmel af gelen blev udskåret til "coomassie blue" farvning, og resten anvendtes til elektroaftrykning på nitrocellulosepapir.
Gelen ligevægtsindstilledes i overføringspuffer [25 mM Tris-192 mM gly-35 cin/20% (vol/vol) methanol ved pH 8,3] i 30 minutter ved stuetemperatur.
Gelen anbragtes på et nitrocelluloseark (udblødt i puffer på forhånd), og der blev draget omsorg for at undgå eller fjerne alle indesluttede luftbobler. Arket anbragtes mellem to stykker filterpapir, som var ud- 13
DK 1 β C 1113 B
blødt på forhånd, og to nylonnetpuder. Dette resulterede i en tæt pasning i et lukket elektrodeskellet til et EC-elektroaftrykningsapparat, hvori elektroaftrykning udførtes natten over ved 400 mA ved stuetemperatur. Efter elektroforetisk overførsel undertrykkedes resterende protein-5 bindingssteder på nitrocellulosepapirarket ved inkubation af arkene i 5% BSA i 20 mM Tris-pufret saltvand, pH 8,2 i 30 minutter ved 37*C. Nitrocellulosearket blev derefter udskåret i 3 mm brede strimler parallelt med elektroforeseretningen. Disse strimler anvendtes til screening af supernatanten for hybridomceller.
10 2.4 Påvisning af monoklonale antistoffer 100 /il af hver hybridomkultursupernatant overførtes til 3,5 cm lange 0,5 ml Eppendorf tips og fortyndedes 1:5 med 0,4 ml 0,1% BSA-Tris.
Tips og strimler forsynedes med et kodenummer. Hver tip forsynedes med 1 15 strimmel og de inkuberedes i 2 timer. Strimlerne vaskedes portionsvis i et overskud af 0,1% BSA-Tris og inkuberedes også portionsvis med GAM G20 (gedeantimuse IgG, mærket med 20 nM kolloidale guldpartikler) fra Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien. GAM G20 fortyndedes med 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine til en O.D. 52(jmnm * 0»1 20 og omsattes natten over. Strimlerne vaskedes med 0,1% BSA-Tris og H20 og lufttørredes.
Positiv reaktion var klart synlig som lyserøde til rødlige bånd (se vedføjede eksempler) svarende til proteinbånd med en given molekylmasse.
Denne meget simple screeningsprocedure ikke blot identificerer antistof-25 udskillende hybridomer, men giver også umiddelbar information om specificiteten af det pågældende antistof og er derfor til stor hjælp ved udvælgelse af interessante antistofudskillende hybridomer.
Eksempel III
30 En sandwichimmunoaftryksanalyse til påvisning af antigener i en vandig testprøve: påvisning af IgGér i en vandig testprøve.
3.1 Analyseprincip
En lille dråbe (±1 /il) af et renset eller beriget antistof, som er 35 monospecifikt for antigenet, som skal bestemmes, aftrykkes på en strimmel nitrocellulosepapir (eller et hvilket som helst bekvemt aftryknings-medium), tørres, og fri proteinbindingssteder undertrykkes (se eksempel 1.3). Disse antistofholdige undertrykte strimler kan eventuelt vaskes i
DK 160108B
14 vand, lufttørres og opbevares. Strimlen inkuberes derefter med et volumen antigenholdig testopløsning i et fast tidsrum. Efter udvaskning af ikke-bundne stoffer inkuberes strimlerne yderligere med passende fortyndet, med kolloidale metal parti kl er (for eksempel en sol af guld eller 5 sølv) mærket monospecifikt antistof lig det, der er adsorberet på af-trykningsmediet. Eventuelt kan der anvendes to monoklonale antistoffer, som genkender forskellige antigeniske epitoper. Det ene knyttes til af-trykningsmediet, det andet knyttes til kolloidale metal parti kler. Under faste betingelser vil analysen være i stand til at påvise en forudbe-10 stemt minimal koncentration af antigen og kan anvendes som en kvalitativ diagnostisk test, forudsat at den kan påvise en som minimum nødvendig koncentration i en given testopløsning.
3.2 Eksempel på princip; påvisning af kanin IqGér i en pufret op-15 løsning af kanin IgG med kendt koncentration
For at afprøve muligheden for at realisere denne nye sandwichanalyse udførtes følgende forsøg: 6 strimler nitrocellulosepapir på 6 x 0,6 cm forsynedes med dråber (1 /il) indeholdende faldende mængder (½ for-20 tyndingsrække begyndende ved 125 ng//il) affinitetsrense de gedeantistoffer mod kanin IgG (GAR IgG) som beskrevet i eksempel 1.2.
Resterende proteinbindingssteder undertrykkedes som beskrevet i eksempel 1.2. 1 strimmel (nr. 6) vaskedes i 20 25 mM Tris-puffer-saltvand, sugedes tør på filterpapir, luft tørredes og anvendtes efter tør opbevaring natten over ved stuetemperatur.
De resterende 5 strimler inkuberedes i til proppede plastreagensglas i 30 minutter ved stuetemperatur som følger: 30 nr. 1: med RIgG, 1 ml, 1 /tg/ml, nr. 2: med RIgG, 1 ml, 0,25 /tg/ml, nr. 3: med RIgG, 1 ml, 0,063 /tg/ml, nr. 4: med RIgG, 1 ml, 0,015 jLtg/ml, nr. 5: med RIgG, 1 ml, 0 /tg/ml.
35 Kanin IgG fortyndedes i 0,1% BSA-Tris. Strimmel nr. 6 inkuberedes med 0,25 /tg/ml RIgG.
Strimlerne vaskedes 2 x 10 minutter i 0,1% BSA-Tris.
Alle strimlerne inkuberedes i nøjagtig 1 time ved stuetem- 15
DK IbCIOQB
peratur i GAR G20 (gedeantistoffer mod kanin IgG, mærket med kolloidale guldpartikler på 20 nm i diameter) fra Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien.
GAR G20 fortyndedes til en O.D. = mec* ^»1% 5 BSA-Tris + 0,4% gelatine.
Strimlerne vaskedes med 0,1% BSA-Tris efterfulgt af vand og lufttørredes.
3.3 Vurdering 10 Pletter indeholdende så lidt som 15 ng adsorberet GAR IgG blev synlige som lyserøde pletter efter inkubation i kun 30 minutter i 1 ml af en opløsning indeholdende 15 ng/ml RIgG efterfulgt af inkubation med 1 ml GAR G20, 0,0520 nm = 0,2 i 1 time. Opløsninger indeholdende mindst denne mængde RIgG ville være blevet anført som positive. Resultatet for 15 strimmel nr. 6 er identisk med resultatet fra strimmel nr. 2, hvilket indikerer, at strimlerne kan tørres efter undertrykkelsestrinnet under bibeholdelse af antistofaktiviteten.
Eksempel IV
20 Direkte påvisning af et antigen knyttet til NC-papir med kolloidalt sølvmærket primært antistof: påvisning af pletter af muse IgGér ved hjælp af med kolloidalt sølv mærkede gedeantistoffer mod muse IgG.
NC-papirstrimler (6 cm x 0,6 cm) forsynedes med pletter af muse IgG (1 /il) indeholdende en 2-fold seriefortynding 25 fra 250-0,4 ng/μΐ, som beskrevet i eksempel 1.2.
De resterende proteinbindingssteder undertrykkedes som i eksempel 1.2.
Strimlerne inkuberedes med med kolloidalt sølv mærkede gedeantistoffer mod muse IgG (fra E.Y. Laboratories, 30 SP-0011), fortyndet 1:100 i 0,1% BSA-Tris, i 1 time og 30 minutter ved stuetemperatur.
Strimlerne vaskedes 2 x 10 minutter med 0,1% BSA-Tris H20 og lufttøredes.
Positive pletter karakteriseredes ved en gul farve. Under 35 disse betingelser kunne ±30 ng i en 1 jal plet påvises.
Eksempel V
Testning af specificiteten af et affinitetsrenset kaninantistof mod
. DK 160108 B
16 kyllingekråseactin for actin i et totalt cellelysåt af sekundære kulturer af kyllingeembryolungeepithelceller ved anvendelse af en aftryksanalyse og guldmærket sekundært antistof efterfulgt af sølvberigelse.
5 5.1 Fremstilling af antiactinantiserum
Elektroforet'telTrent kyllingekråseactin homogeniseredes og injiceredes i kaniner som beskrevet for tubulin og calmodulin i eksempel 1.1.
Serum fremstilledes og opbevaredes som beskrevet i eksempel 1.1.
10 5.2 Affinitetsrensning af antistoffet mod actin
Actin kobledes til Sepharose-4-B-CNBr (Pharmacia) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. Antistoffet rensedes direkte fra serum. Sidstnævnte inkuberedes med den antigenholdige gel. Der anvendtes 20 ml serum til 10 mg koblet antigen. Efter 2 timers inkubation hældtes 15 gelen i en kolonne og vaskedes med 10 mM Tris-pufret saltvand (TBS), indtil O.D. ved 280 nm var næsten nul. Ikke-specifikt adsorberende materiale elueredes med TBS indeholdende 1M NaCl efterfulgt af vask med TBS.
Det specifikke antistof elueredes med 0,1M giycin-HCl-puffer ved pH 2,8.
1 ml fraktioner neutraliseredes straks med 100 μΐ 1M Tris-HCl-puffer, pH 20 8,5. Antistofkoncentrationen måltes ved 280 nm under anvendelse af en E^ = 14,3. Portioner af de eluerede antistoffer opbevaredes ved -20eC uden yderligere behandling.
5.3 Dyrkning af kyllingeembryolungeepithelceller 25 Embryoniske kyl li ngelungeepithel cel ler i soleredes fra 14 dage gamle kyllingeembryolunger. Vævet fintdeltes manuelt og trypsineredes i 0,25% trypsin i Ca^+ og Mg^ fri Hanks og balanceret saltopløsning ved 37eC i 20 minutter. Reaktionen blev afbrudt med medium og 10% FCS. Efter centrifugering og resuspension overførtes cellerne til en 75 cm2 T-kolbe 30 og henstilledes for tilknytning i 12 til 24 timer, før mediet ændredes.
Efter 3 til 5 dage under kultur tryptini seredes cellerne kortvarigt (2 til 3 minutter i 0,25% trypsinopløsning) og blev udstrøget på petriskåle, 9 cm 0, og anvendtes efter 3 til 5 dage under kultur, når cellerne var sammenflydende. Cellerne dyrkedes i Eagles minimum essential medium 35 suppleret med ikke-essentielle aminosyrer og 10% kalvefosterserum i en atmosfære af fugtig luft indeholdende 5% C02 ved 37eC.
17
DK 16 C 'i o O B
5.4 Fremstilling af totalt celle-SDS-lysat af kyllingeembryolungeepi-thelceller 2+ 2+
Celler dyrket i petriskåle, 9 cm 0, vaskedes i Ca og Mg frit PBS (Dulbecco's) og opsamledes med en gummibeklædt spatel og nedsænkedes 5 i absolut acetone ved -2Q°C i Eppendorf tip (1,5 ml). Acetonen afdampe-des, og den tørre celleremanens opløstes i kogende SDS-prøvepuffer indeholdende 1 mM TAME (en proteaseinhibitor). Uopløselige rester efter centrifugering bortkastedes. SDS-geler (ifølge Laemmli) udførtes af dette lysat seriefortyndet med prøvepuffer og farvet med "coomassie blue" for 10 at vurdere den mest passende fortynding af prøven. 1:16 anvendtes til den efterfølgende elektroforetiske overførsel til en Gene screenmembran (fra NEN). 1 overføringsenhed dannedes af 1 bane af et sådant fortyndet lysat og 1 bane af en blanding af rensede referenceproteiner: Ch.g. fi-lamin, Ch.g. myosin (H + L chain), Ch.g. α-actinin, BSA, rottehjernetu-15 bulin, svinemavetropomyosin, hver med 0,06 /xg pr. bane.
Pufferfronten fik ikke lov til at nå bunden af gelen, og elektroforetisk overførsel til Gene screenmembranen udførtes nøjagtig som i eksempel 2.3. Aftryksenheden udskares, og de resterende proteinbindingssteder undertrykkedes som beskrevet i eksempel 1.2 og 2.3. Inkubation 20 med antistof mod actin (0,5 /xg/ml) og GAR G20 (O.D. 520 nm = 0,2), og fortynding af GAR G20 med 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine udførtes i lukkede plastposer af omtrent samme størrelse som arket i 2 timer hver på samme måde som beskrevet i eksempel 2.4.
Efter 2 timers inkubation med GAR G20 vaskedes arkene med 0,1% BSA-25 Tris og forberedtes til sølvberigelse. På dette tidspunkt var et lyse-rødt-rødligt bånd med samme mobilitet som actin i lysatet og svarende til actin i proteinblandingen allerede synligt.
5.5 Sølvberigelse 30 - Arkene vaskedes i 2 minutter i 1:10 fortyndet citratfor rådspuffer. Denne puffer indeholder 100 ml 25,5 g trina-triumcitrat og 23,5 g citronsyre til et pH på 4.
Arkene inkuberedes derefter i 15 minutter omhyggeligt beskyttet mod lys i en fysisk fremkalder indeholdende 35 60 ml afioniseret H20, 0,85 g hydroquinon i 15,0 ml afioniseret H20, 10 ml citratpuffer pH 4, 0,11 g sølvlactat i 15,0 ml afioniseret H20.
DK 160108 B
18 Sølvlactatet beskyttes omhyggeligt mod lys og tilsættes de andre komponenter lige før brug.
Efter reaktionstiden vaskedes arkene i et overskud af H20 og behandledes med Agefix (1:4 i H20), et fotogra- 5 fisk fiksativ.
Arkene vaskedes igen i et overskud af H20 og lufttørre des.
5.6 Resultater 10 Båndet, som tidligere kunne ses som et lyserødt-rødligt farvet bånd, var nu blevet dybt sort. Antistoffet mod actin kan anses for ekstremt specifikt og har givet tilfredsstillende resultater for immunocy-tokemisk farvning af actinholdige strukturer i de dyrkede celler.
15 5.7 Konklusion
Denne sølvberigelse øger påvisningsmetodens kontrast og følsomhed stærkt. For eksempel var påvisningsgrænsen 3 i stedet for 30 ng/plet efter kun 5 minutters reaktion, hvis prøven i eksempel IV, der farvedes med antistoffer mærket med kolloidalt sølv, fremkaldtes yderligere.
Claims (12)
1. Fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af et agglo-merat dannet ved reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den til - 5 svarende acceptorsubstans ved aftryksanalyse under anvendelse af mærkede komponenter KENDETEGNET ved, AT de mærkede komponenter, som er opnået ved at koble den ønskede komponent i reaktionen til kolloidale metal parti kl er eller ved at koble et specifikt bindingsmiddel for komponenten i reaktionen til kolloidale metal parti kl er, gøres synlige som et farvet 10 signal, der befinder sig på reaktionsstedet ved overfladen af aftryksmediet eller bestemmes kvantitativt på dette sted ved hjælp af kendte spektrofotometriske metoder.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 KENDETEGNET ved, AT det specifikke 15 bindingsmiddel er et specifikt bindingsprotein.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2 KENDETEGNET ved, AT den omfatter de trin, at man i) immobiliserer acceptorsubstansen på en immobil iseringsmatrix, 20. i) bringer immobiliseringsmatrixen i kontakt med et specifikt bindingsmiddel mærket med kolloidale metal parti kl er, og iii) påviser det farvede signal på reaktionsstedet ved overfladen af immobiliseringsmatrixen.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2 KENDETEGNET ved, AT den omfatter, at man i) immobiliserer acceptorsubstansen på en immobiliseringsmatrix, ii) bringer immobiliseringsmatrixen i kontakt med et umærket specifikt bindingsmiddel og derefter med protein, der er mærket med kolloi- 30 dalt metal og specifikt for det umærkede specifikke bindingsprotein, og iii) påviser det farvede signal på reaktionsstedet ved overfladen af immobiliseringsmatrixen.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4 KENDETEGNET ved, AT immo-35 bi li seringstrinnet udføres ved direkte adsorption og/eller kovalent binding eventuelt efter anvendelse af en elektroforetisk adskillelsesprocedure og anvendelse af en procedure til overførsel eller aftrykning fra det elektroforetiske medium til aftryksmediet og derefter undertryk- DK 16 C10 8 B ker resterende middel specifikke bindingssteder på kendt måde.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4 KENDETEGNET ved, AT immobiliseringstrinnet udføres ved, at man lader acceptorsubstansen blive 5 bundet til et specifikt bindingsprotein, som er blevet immobil i seret på aftryksmediet,ved at bringe aftryksmediet i kontakt med en vandig opløsning, der indeholder acceptorsubstansen.
7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6 10 KENDETEGNET ved, AT de kolloidale metal parti kler består af guld, sølv, platin eller forbindelser af disse metaller eller jern eller kobber med en partikelstørrelse mellem 3 nm og 100 nm.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7 15 KENDETEGNET ved, AT de kolloidale metal parti kl er består af guld og/eller sølv med en partikelstørrelse mellem 3 nm og 100 nm.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8 KENDETEGNET ved, AT den endelige påvisning af de kolloidale metalpartik- 20 ler udføres efter påføring af en fysisk fremkalder.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9 KENDETEGNET ved, AT den fysiske fremkalder er en sølvholdig forbindelse.
11. Testudstyr til anvendelse til direkte eller indirekte påvis ning af én af komponenterne i reaktionen mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved aftryksanalyse ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 10 KENDETEGNET ved, AT det omfatter en med kolloidale metal parti kl er mærket komponent, som er opnået ved at 30 koble en komponent i reaktionen eller en komponent, som kan anvendes til at påvise denne reaktion indirekte, til kolloidale metal parti kl er.
12. Testudstyr ifølge krav 11 KENDETEGNET ved, AT det yderligere omfatter en fysisk fremkalder. 35
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8331514 | 1983-11-25 | ||
GB838331514A GB8331514D0 (en) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Visualization method |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK557684D0 DK557684D0 (da) | 1984-11-23 |
DK557684A DK557684A (da) | 1985-05-26 |
DK160108B true DK160108B (da) | 1991-01-28 |
DK160108C DK160108C (da) | 1995-07-24 |
Family
ID=10552346
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK557684A DK160108C (da) | 1983-11-25 | 1984-11-23 | Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4775636A (da) |
EP (1) | EP0158746B1 (da) |
JP (2) | JPH0643998B2 (da) |
KR (1) | KR890001131B1 (da) |
AT (1) | ATE64468T1 (da) |
AU (1) | AU583484B2 (da) |
CA (1) | CA1253422A (da) |
CY (1) | CY1759A (da) |
DE (1) | DE3484710D1 (da) |
DK (1) | DK160108C (da) |
ES (1) | ES537926A0 (da) |
FI (1) | FI80345C (da) |
GB (1) | GB8331514D0 (da) |
HK (1) | HK14894A (da) |
IL (1) | IL73607A (da) |
NO (1) | NO163754C (da) |
NZ (1) | NZ210309A (da) |
PT (1) | PT79533A (da) |
ZA (1) | ZA849182B (da) |
Families Citing this family (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622871A (en) | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
GB8415998D0 (en) * | 1984-06-22 | 1984-07-25 | Janssen Pharmaceutica Nv | Staining method |
US5958790A (en) * | 1984-12-20 | 1999-09-28 | Nycomed Imaging As | Solid phase transverse diffusion assay |
US5512332A (en) * | 1985-10-04 | 1996-04-30 | Immunivest Corporation | Process of making resuspendable coated magnetic particles |
US5137827A (en) * | 1986-03-25 | 1992-08-11 | Midwest Research Technologies, Inc. | Diagnostic element for electrical detection of a binding reaction |
US4837145A (en) * | 1986-06-09 | 1989-06-06 | Liotta Lance A | Layered immunoassay using antibodies bound to transport particles to determine the presence of an antigen |
US5514602A (en) * | 1986-06-09 | 1996-05-07 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles |
AU602694B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-10-25 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Improved colloidal gold membrane assay |
AU7385387A (en) * | 1986-06-09 | 1987-12-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Immunoassay using detection of colloidal gold |
JPS63127160A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-05-31 | Sukeyasu Yoneda | 特異的蛋白質の検出方法 |
CA1340803C (en) * | 1987-03-09 | 1999-10-26 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Method for depositing metal particles on a marker |
US5491098A (en) * | 1987-03-09 | 1996-02-13 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Method for depositing metal particles on a marker |
USRE38430E1 (en) | 1987-03-27 | 2004-02-17 | Becton, Dickinson And Company | Solid phase chromatographic immunoassay |
EP0291194B8 (en) * | 1987-04-27 | 2003-10-22 | Inverness Medical Switzerland GmbH | Immunoassays and devices therefor |
US4962023A (en) * | 1987-06-22 | 1990-10-09 | Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College | Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies |
US5120643A (en) * | 1987-07-13 | 1992-06-09 | Abbott Laboratories | Process for immunochromatography with colloidal particles |
JP2581566B2 (ja) * | 1987-09-30 | 1997-02-12 | 和光純薬工業株式会社 | 鉄コロイド標識抗体及びその製法並びにこれを用いる組織細胞化学的検出方法 |
US5571667A (en) * | 1987-10-01 | 1996-11-05 | Chu; Albert E. | Elongated membrane flow-through diagnostic device and method |
US5006464A (en) * | 1987-10-01 | 1991-04-09 | E-Y Laboratories, Inc. | Directed flow diagnostic device and method |
ES2039025T3 (es) * | 1987-11-16 | 1993-08-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Un agregado para determinar sustancias combinables. |
NL8702769A (nl) * | 1987-11-19 | 1989-06-16 | Holland Biotechnology | Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste een gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten. |
GB8800702D0 (en) * | 1988-01-13 | 1988-02-10 | Nycomed As | Test method & reagent kit therefor |
US4952517A (en) * | 1988-02-08 | 1990-08-28 | Hygeia Sciences, Inc. | Positive step immunoassay |
US5202267A (en) * | 1988-04-04 | 1993-04-13 | Hygeia Sciences, Inc. | Sol capture immunoassay kit and procedure |
JPH02504429A (ja) * | 1988-05-23 | 1990-12-13 | ガイ,ステファン | リウマチ様関節炎の診断と治療 |
AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
US5079172A (en) | 1988-11-04 | 1992-01-07 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit |
CA2002660A1 (en) * | 1988-11-10 | 1990-05-10 | Susan J. Mroczkowski | Method for electrical detection of a binding reaction |
US5202268A (en) * | 1988-12-30 | 1993-04-13 | Environmental Diagnostics, Inc. | Multi-layered test card for the determination of substances in liquids |
US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
EP0401913B1 (en) * | 1989-06-05 | 1995-01-25 | Janssen Pharmaceutica N.V. | A solid phase assay for use with a physical developer |
GB8915512D0 (en) | 1989-07-06 | 1989-08-23 | Sec Dep For Health | Silver enhanced gold-labelled immuno assay method |
US5698271A (en) * | 1989-08-22 | 1997-12-16 | Immunivest Corporation | Methods for the manufacture of magnetically responsive particles |
US6352863B1 (en) * | 1990-01-19 | 2002-03-05 | La Mina, Inc. | Assay device |
US5143852A (en) * | 1990-09-14 | 1992-09-01 | Biosite Diagnostics, Inc. | Antibodies to ligand analogues and their utility in ligand-receptor assays |
EP0566695B1 (en) * | 1991-01-11 | 1999-06-02 | Quidel Corporation | A one-step lateral flow assay and nonbibulous support used therein |
US5468648A (en) * | 1991-05-29 | 1995-11-21 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Interrupted-flow assay device |
US5998220A (en) | 1991-05-29 | 1999-12-07 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them |
US5877028A (en) | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
US5607863A (en) * | 1991-05-29 | 1997-03-04 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Barrier-controlled assay device |
US5869345A (en) * | 1991-05-29 | 1999-02-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing conductive barrier |
US6168956B1 (en) | 1991-05-29 | 2001-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Multiple component chromatographic assay device |
CA2130751C (en) * | 1992-02-25 | 2000-01-25 | Peter Andersen | Apparatus and process for electroelution of a gel containing charged macromolecules |
US5395754A (en) * | 1992-07-31 | 1995-03-07 | Hybritech Incorporated | Membrane-based immunoassay method |
US5340746A (en) * | 1993-01-08 | 1994-08-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Composite reactive articles for the determination of cyanide |
CA2105515A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-04 | Carlos A. Santizo Lescaille | Visual immunoassay method for the detection of ligands, based on the use of opaque plastic supports |
US5712172A (en) | 1995-05-18 | 1998-01-27 | Wyntek Diagnostics, Inc. | One step immunochromatographic device and method of use |
US20010051350A1 (en) | 1995-05-02 | 2001-12-13 | Albert Nazareth | Diagnostic detection device and method |
US6551794B1 (en) | 1995-11-09 | 2003-04-22 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable biotinylated biomolecule composition |
US5691152A (en) * | 1995-11-09 | 1997-11-25 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable avidin composition |
US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
JP4068677B2 (ja) * | 1996-10-25 | 2008-03-26 | アークレイ株式会社 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット |
JP4025833B2 (ja) * | 1996-10-25 | 2007-12-26 | アークレイ株式会社 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット並びに遺伝子分析装置 |
US7153651B1 (en) | 1996-10-31 | 2006-12-26 | Inverness Medical - Biostar, Inc. | Flow-through optical assay devices providing laminar flow of fluid samples, and methods of construction thereof |
US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
US6103536A (en) | 1997-05-02 | 2000-08-15 | Silver Lake Research Corporation | Internally referenced competitive assays |
US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
CA2346487A1 (en) * | 1998-10-14 | 2000-04-20 | Matthew R. Bonen | Immobilized silver immunoassay system |
IL126776A (en) * | 1998-10-27 | 2001-04-30 | Technion Res & Dev Foundation | A method of investing gold |
US6136610A (en) | 1998-11-23 | 2000-10-24 | Praxsys Biosystems, Inc. | Method and apparatus for performing a lateral flow assay |
US6136044A (en) * | 1999-02-03 | 2000-10-24 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Stable coloring by in situ formation of micro-particles |
CA2399202A1 (en) * | 2000-03-09 | 2001-09-13 | Heska Corporation | Use of recombinant antigens to determine the immune status of an animal |
US6699722B2 (en) | 2000-04-14 | 2004-03-02 | A-Fem Medical Corporation | Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes |
DE10108359B4 (de) * | 2001-02-21 | 2008-03-27 | Enßlin, Walther, Dr. | Nachweisverfahren für reduzierende Substanzen |
WO2002100444A1 (en) * | 2001-06-08 | 2002-12-19 | Biosphere Medical Inc. | Colloidal metal labelled microparticles, their production and use |
US20030013084A1 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-16 | Berlock Aps | Organometallic probe |
WO2003075765A1 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Biospecific contrast agents |
US7138468B2 (en) | 2002-03-27 | 2006-11-21 | University Of Southern Mississippi | Preparation of transition metal nanoparticles and surfaces modified with (CO)polymers synthesized by RAFT |
CA2500407C (en) * | 2002-10-11 | 2009-05-26 | Zbx Corporation | Diagnostic devices |
EP1704405A1 (en) | 2003-12-31 | 2006-09-27 | The President and Fellows of Harvard College | Assay device and method |
US7638093B2 (en) * | 2004-01-28 | 2009-12-29 | Dnt Scientific Research, Llc | Interrupted flow rapid confirmatory immunological testing device and method |
US7465587B2 (en) | 2004-12-03 | 2008-12-16 | Genzyme Corporation | Diagnostic assay device |
US20060292700A1 (en) * | 2005-06-22 | 2006-12-28 | Naishu Wang | Diffused interrupted lateral flow immunoassay device and method |
KR101255400B1 (ko) | 2005-05-23 | 2013-04-17 | 파디아 에이비 | 2 단계 횡 유동 검사 방법 및 장치 |
US20070015166A1 (en) * | 2005-07-14 | 2007-01-18 | Nilsen Thor W | Lateral flow methods and devices for detection of nucleic acid binding proteins |
EP1962093B1 (en) | 2005-11-25 | 2013-06-12 | Japan Science and Technology Agency | Analysis method |
US7879623B2 (en) * | 2006-03-31 | 2011-02-01 | Guirguis Raouf A | Integrated device for analyte, testing, confirmation, and donor identity verification |
US7741103B2 (en) * | 2006-03-31 | 2010-06-22 | Guirguis Raouf A | Integrated screening and confirmation device |
US11906512B2 (en) | 2006-03-31 | 2024-02-20 | Zeus Diagnostics, LLC | Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification |
US8940527B2 (en) * | 2006-03-31 | 2015-01-27 | Lamina Equities Corp. | Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification |
US7569396B1 (en) | 2006-09-08 | 2009-08-04 | Purplecow Llc | Caffeine detection using internally referenced competitive assays |
US7919331B2 (en) * | 2006-12-21 | 2011-04-05 | Silver Lake Research Corporation | Chromatographic test strips for one or more analytes |
JP4870695B2 (ja) * | 2008-02-12 | 2012-02-08 | 富士フイルム株式会社 | メンブレン内の標識を洗浄、増幅、停止する方法 |
JP4980946B2 (ja) * | 2008-02-12 | 2012-07-18 | 富士フイルム株式会社 | ブロッティング検出方法 |
US8673644B2 (en) | 2008-05-13 | 2014-03-18 | Battelle Memorial Institute | Serum markers for type II diabetes mellitus |
WO2010011860A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes |
US20100047913A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Colloidal Gold Single Reagent Quantitative Protein Assay |
CA2750818A1 (en) | 2009-01-27 | 2010-08-05 | Proteogenix, Inc. | Biomarkers for detection of neonatal sepsis in biological fluid |
JP5746978B2 (ja) | 2009-01-30 | 2015-07-08 | マイカーティス エヌ.ヴェ.MyCartis NV | 急性心不全の診断、予知及び/又は予後用バイオマーカー及びその使用 |
WO2010132447A2 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation |
US8628979B2 (en) | 2009-10-21 | 2014-01-14 | Pronota N.V. | MCAM as a biomarker for fluid homeostasis |
WO2011065976A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Hologic, Inc. | Detection of intraamniotic infection |
US20130040881A1 (en) | 2010-03-26 | 2013-02-14 | Pronota N.V. | Ltbp2 as a biomarker for renal dysfunction |
JP2013524251A (ja) | 2010-04-13 | 2013-06-17 | プロノタ エヌ.ヴェ. | 妊娠高血圧疾患のバイオマーカー |
WO2011129220A1 (ja) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | 日東紡績株式会社 | 試料中の分析対象物質を測定するための検査器具及びそれを用いた分析対象物質の測定方法 |
CN103025885B (zh) | 2010-05-26 | 2016-01-20 | 伊利诺伊大学评议会 | 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计 |
US20130116151A1 (en) | 2010-07-08 | 2013-05-09 | Pronota N.V. | Biomarker for hypertensive disorders of pregnancy |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
CA2819886A1 (en) | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Pronota N.V. | Biomarkers and parameters for hypertensive disorders of pregnancy |
US20150045245A1 (en) | 2011-12-08 | 2015-02-12 | Biocartis Nv | Biomarkers and test panels useful in systemic inflammatory conditions |
BR112014014456A2 (pt) | 2011-12-15 | 2018-09-25 | Pronota Nv | biomarcadores e parâmetros para distúrbios hipertensivos da gravidez |
EP3418397B1 (en) | 2012-01-24 | 2020-10-07 | CD Diagnostics, Inc. | System for detecting infection in synovial fluid |
US20140248629A1 (en) * | 2013-03-03 | 2014-09-04 | Morteza Mahmoudi | Gold nanoparticle based dipstick nano-biosensor for detecting plasmodium falciparum and plasmodium vivax and mehtod of synthesizing the same |
US9383352B2 (en) | 2014-03-26 | 2016-07-05 | Diabetomics, Inc. | Salivary protein glycosylation test for diagnosis and monitoring of diabetes |
GB2552427A (en) | 2015-01-29 | 2018-01-24 | Neogen Corp | Methods for immuno chromatographic assay desensitization |
US10584162B2 (en) | 2015-04-23 | 2020-03-10 | Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno | Fungal detection using mannan epitope |
EP3331572A4 (en) | 2015-08-04 | 2019-05-01 | CD Diagnostics, Inc. | METHOD FOR DETECTING UNWANTED LOCAL TISSUE ACTION NEKROSIS |
US10151749B2 (en) * | 2015-08-05 | 2018-12-11 | Alfaisal University | Method and kit for the detection of microorganisms |
US20200200735A9 (en) | 2016-02-22 | 2020-06-25 | Ursure, Inc. | System and method for detecting therapeutic agents to monitor adherence to a treatment regimen |
US20190120838A1 (en) | 2016-04-13 | 2019-04-25 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and kits for the rapid detection of the escherichia coli o25b-st131 clone |
US10564155B2 (en) | 2017-01-27 | 2020-02-18 | Raouf A Guirguis | Dual swab fluid sample collection for split sample testing and fingerprint identification device |
US11061026B2 (en) | 2017-02-17 | 2021-07-13 | MFB Fertility, Inc. | System of evaluating corpus luteum function by recurrently evaluating progesterone non-serum bodily fluids on multiple days |
WO2018211126A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Philip Morris Products S.A. | Diagnostic test for distinguishing the smoking status of a subject |
WO2019152657A1 (en) | 2018-02-03 | 2019-08-08 | Simple Healthkit, Inc. | Reliable, comprehensive, and rapid sexual health assessment |
US11300576B2 (en) | 2019-01-29 | 2022-04-12 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4115198A (en) * | 1974-02-11 | 1978-09-19 | Coughlin Robert W | Method of immobilization of biologically active organic substances including enzymes |
IL49685A (en) * | 1976-05-31 | 1978-10-31 | Technion Res & Dev Foundation | Specific binding assay method for determining the concentration of materials and reagent means therefor |
US4203724A (en) * | 1976-08-16 | 1980-05-20 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
US4208185A (en) * | 1976-08-16 | 1980-06-17 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
SE431257B (sv) * | 1977-11-03 | 1984-01-23 | Du Pont | Sett och anordning for immunanalys med magnetisk metall eller metalloxid som merksubstans |
NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
US4420558A (en) * | 1981-02-12 | 1983-12-13 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors |
US4487839A (en) * | 1983-01-05 | 1984-12-11 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Immunoassay methods employing patterns for the detection of soluble and cell surface antigens |
CA1260827A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-26 | Richard C. Siegel | Antibody-metal ion complexes |
-
1983
- 1983-11-25 GB GB838331514A patent/GB8331514D0/en active Pending
-
1984
- 1984-10-31 DE DE8484201559T patent/DE3484710D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 EP EP84201559A patent/EP0158746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 AT AT84201559T patent/ATE64468T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-07 CA CA000467203A patent/CA1253422A/en not_active Expired
- 1984-11-15 KR KR1019840007168A patent/KR890001131B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-11-16 FI FI844508A patent/FI80345C/fi active IP Right Grant
- 1984-11-21 JP JP59244692A patent/JPH0643998B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-22 PT PT79533A patent/PT79533A/pt unknown
- 1984-11-23 ES ES537926A patent/ES537926A0/es active Granted
- 1984-11-23 NZ NZ210309A patent/NZ210309A/en unknown
- 1984-11-23 AU AU35825/84A patent/AU583484B2/en not_active Expired
- 1984-11-23 IL IL73607A patent/IL73607A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 NO NO844672A patent/NO163754C/no not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 ZA ZA849182A patent/ZA849182B/xx unknown
- 1984-11-23 DK DK557684A patent/DK160108C/da not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-10-27 US US07/115,652 patent/US4775636A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-17 JP JP5081149A patent/JP2601616B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-24 HK HK148/94A patent/HK14894A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-07-15 CY CY175994A patent/CY1759A/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0643162A (ja) | 1994-02-18 |
GB8331514D0 (en) | 1984-01-04 |
DE3484710D1 (de) | 1991-07-18 |
EP0158746B1 (en) | 1991-06-12 |
FI80345C (fi) | 1992-11-16 |
NO163754C (no) | 1993-01-12 |
KR890001131B1 (ko) | 1989-04-24 |
DK160108C (da) | 1995-07-24 |
NO844672L (no) | 1985-05-28 |
EP0158746A2 (en) | 1985-10-23 |
NO163754B (no) | 1990-04-02 |
DK557684D0 (da) | 1984-11-23 |
NZ210309A (en) | 1987-04-30 |
AU3582584A (en) | 1985-05-30 |
PT79533A (en) | 1984-12-01 |
JPH0643998B2 (ja) | 1994-06-08 |
CY1759A (en) | 1994-07-15 |
ES8602255A1 (es) | 1985-11-01 |
ES537926A0 (es) | 1985-11-01 |
IL73607A0 (en) | 1985-02-28 |
AU583484B2 (en) | 1989-05-04 |
JPS60185160A (ja) | 1985-09-20 |
KR850003728A (ko) | 1985-06-26 |
ZA849182B (en) | 1986-06-25 |
FI844508L (fi) | 1985-05-26 |
IL73607A (en) | 1988-12-30 |
EP0158746A3 (en) | 1987-09-23 |
CA1253422A (en) | 1989-05-02 |
FI844508A0 (fi) | 1984-11-16 |
DK557684A (da) | 1985-05-26 |
HK14894A (en) | 1994-03-04 |
US4775636A (en) | 1988-10-04 |
ATE64468T1 (de) | 1991-06-15 |
JP2601616B2 (ja) | 1997-04-16 |
FI80345B (fi) | 1990-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK160108C (da) | Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans | |
Grauballe et al. | Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques | |
US8404479B2 (en) | Simple membrane assay method and kit | |
JPS61247965A (ja) | 酵素免疫測定法 | |
WO2019153630A1 (zh) | 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法 | |
CZ294954B6 (cs) | Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku | |
JPH08505224A (ja) | 免疫検定用試験ストリップ | |
CN203405465U (zh) | 一种检测胃蛋白酶原ⅱ的试纸条及应用其的试剂卡 | |
US7090984B2 (en) | Device and method for detecting substance | |
EP0207152B1 (en) | Solid phase diffusion assay | |
CN111474347A (zh) | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
US20130224884A1 (en) | Device and method for immunoassays | |
CN115060888A (zh) | 一种新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试纸的制备方法 | |
US20140093428A1 (en) | Device and method for immunoassays | |
JPS63127160A (ja) | 特異的蛋白質の検出方法 | |
EP0603958A1 (en) | Improvement of the dynamic range in specific binding assays | |
EP0245509B1 (en) | Method of immunoassay | |
EP4206181A1 (en) | Test reagent with improved specificity by suppressing false negatives | |
JP2002214236A (ja) | 血中抗原検出方法及び装置 | |
CN117214430A (zh) | 新型冠状病毒与甲、乙型流感病毒抗原联检试剂盒及制备方法 | |
CN116235053A (zh) | 通过抑制假阳性改善了特异性的检查试剂盒 | |
Srivastava et al. | Immuno-Reproduction Assays in Semen Biology | |
CN114280312A (zh) | 一种用于免疫荧光层析检测的全血分离膜及其制备方法和应用 | |
JPH02287258A (ja) | 体液中の感染症原因生物に対する抗体の測定方法およびそのための剤 | |
Kimotho | Development of an elisa kit for detection of hepatitis b surface antigen in plasma and serum, based on polyclonal antibodies generated in KEMRI, Kenya |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |