CN112458049B - 一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法 - Google Patents

一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法，属于干细胞和动物细胞培养技术领域。揭示了一种低成本培养肌肉干细胞的培养基和培养方法，通过所述培养基和培养方法可以使肌肉干细胞在保持体外生长和成肌分化能力，大大降低了培养基的成本。

Description

一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法，属于干细胞和动物细胞培养技术领域。
背景技术
随着社会发展和生活水平的提升，人们对肉类的需求也逐渐增大，使得依赖传统农业的肉类生产方式与资源环境之间的矛盾日益突出，迫切需要开发更加高效、可持续、环境友好的肉类生产***。细胞培养肉作为2018年全球十大突破和新兴科技之一，是利用动物细胞培养技术，通过从活体动物中分离得到的肌肉干细胞，使其在体外进行大量增殖并定向分化产生肌纤维，再经过收集、三维塑形、食品化处理等工序生产出可食用的肉类食品，为人类提供优质的动物蛋白。这一技术具有极大的高资源转化率、良好的可持续性、环境和动物友好性，被认为是最有可能颠覆传统农业***的一种新兴肉类生产方式。
肌肉干细胞又称肌卫星细胞，因其容易获取、肌源性分化能力强，是细胞培养肉生产最理想的种子细胞。但是，肌肉干细胞无法像其他类型的全能或多能干细胞具有高效的增殖潜能，通常随着体外培养时间的延长，细胞的增殖能力显著降低，分化成肌管的能力也大幅下降。因此，如果提高肌肉干细胞的增殖能力，使其短时间内大量扩增并维持其分化潜能，对细胞培养肉的制造尤为重要。因此，开发高效、安全、低成本的培养基促进卫星细胞的增殖是培养肉大规模制造和商品化生产的基础。
目前促进肌肉干细胞体外增殖的方法主要依靠在基础培养基中添加高浓度的胎牛血清(10-20％(v/v)FBS)和细胞因子bFGF，虽然可以使肌肉干细胞在体外增殖5～10代，但血清和细胞因子的成本都极其高昂，不利于应用到细胞培养肉的大规模生产。因此，开发促进肌肉干细胞生长的低成本培养基，对肌肉干细胞的大规模培养和培养肉的商品化生产具有重要意义。
维生素类化合物是是维持生命活动的重要物质，能够调节细胞的增殖和分化，除了作为营养物质，某些特定的维生素可调节细胞内的信号通路。此外，大部分维生素类化合物可通过化学合成或微生物发酵合成方法生产，产量高、成本低，若能将维生素类化合物添加到肌肉干细胞体外增殖的培养基中，替代细胞因子和部分血清，则可以大大降低细胞培养肉的制造成本，有利于肌肉干细胞大规模培养体系的研发，早日实现细胞培养肉的商品化生产。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法，所述方法是用含组合物的培养基培养肌肉干细胞，组合物包括：组分A、组分B和组分C；其中：
组分A为维生素C、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分B为维生素D、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分C为维生素E、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分A的浓度为10～500μM；组分B的浓度为50～150nM；组分C的浓度为100～300μM。
本发明的一种实施方式中，组分A选自：L-抗坏血酸、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、脱氢抗坏血酸，异抗坏血酸或L-抗坏血酸2-葡糖苷；
组分B选自：骨化二醇、骨化三醇、α-骨化醇、帕立骨化醇或卡泊三醇；
组分C选自：α-生育酚、α-生育酚乙酸酯或α-生育酚琥珀酸酯。
本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物是由组分A、组分B和组分C组成；
其中：
组分A为维生素C、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分B为维生素D、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分C为维生素E、维生素C的异构体或维生素C的类似物中的一种或多种；
组分A的浓度为10～500μM；组分B的浓度为50～150nM；组分C的浓度为100～300μM。
本发明的一种实施方式中，组分A选自：L-抗坏血酸、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、脱氢抗坏血酸，异抗坏血酸或L-抗坏血酸2-葡糖苷，工作浓度为：10～500μM。
本发明的一种实施方式中，组分B选自：骨化二醇、骨化三醇、α-骨化醇、帕立骨化醇或卡泊三醇，工作浓度为：1～200nM。
本发明的一种实施方式中，组分C选自：α-生育酚、α-生育酚乙酸酯或α-生育酚琥珀酸酯，工作浓度为：10～500μM。
本发明的一种实施方式中，所述的组合物：10～500μM的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；50～150nM的骨化三醇；100～300μM的α-生育酚乙酸酯。
本发明的一种实施方式中，所述的组合物：50～150μM的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；50～100nM的骨化三醇；50～200μM的α-生育酚乙酸酯。
本发明第三个目的是提供一种低成本培养肌肉干细胞的培养基，所述的培养基是V medium，包括：基础培养基；胎牛血清FBS；和上述组合物。
本发明的一种实施方式中，所述的基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、F10培养基。
本发明的一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为2％～8％。
本发明的一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为5％。
本发明的一种实施方式中，所述培养基V medium中不添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
本发明的一种实施方式中，所述方法包括：应用含组合物的培养基培养新鲜分离或液氮中冻存复苏的猪肌肉干细胞，培养期间每2～3天更换1次新鲜的培养基；可选地，在起始后第2±0.5天，更换1次新鲜的培养基，在达到所需细胞数量后，终止培养，收获猪肌肉干细胞。
本发明的第四个目的是提供上述组合物或培养基在制备肌肉干细胞中的应用。
有益效果：
本发明将肌肉干细胞通过V medium于体外培养，不仅可以有效支持肌肉干细胞的体外生长，更重要的是大大降低了培养基的成本，有利于肌肉干细胞的大规模培养和细胞培养肉的制造。
V medium能够有效促进肌肉干细胞的体外生长，利用V medium培养的肌肉干细胞与常规培养基(DMEM、10％FBS、5ng/mL bFGF和1％青霉素-链霉素)相比，培养7天细胞扩增倍数相似，细胞形态相近；同时，EdU细胞增殖分析和PI染色法细胞周期检测结果显示，Vmedium培养的肌肉干细胞DNA合成速率和处于***期的细胞比例与常规培养基相当；此外，经V medium扩增培养后的肌肉干细胞仍然具有成肌分化的潜能，且分化形成多核肌管的数量比经常规培养基扩增后肌肉干细胞分化形成的肌管数量多20％～40％；V medium中仅含有2～5％的FBS，大大降低了FBS的使用量，不含有细胞因子，因此培养基的成本是常规培养基的1/3-1/2。因此证明本发明提供的V medium有利于肌肉干细胞大规模培养体系的研发，早日实现细胞培养肉的商品化生产。
附图说明
图1为肌肉干细胞扩增8天后细胞显微镜照片。
图2为肌肉干细胞扩增不同时间总细胞数量。
图3为EdU实验检测细胞增殖能力。
图4为细胞周期检测。
图5为分化后MyHC免疫荧光染色情况。
具体实施方式
实施例1：V medium(配方A)配制及利用V medium(配方A)培养肌肉干细胞
V medium(配方A)配制：在DMEM(Gibco)中添加2％(v/v)FBS、1％(v/v)青链霉素及以下成分:L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐：100μM；骨化三醇：100nM；α-生育酚乙酸酯：200μM。
肌肉干细胞常规培养基配置：在DMEM中添加10％(v/v)FBS、1％(v/v)青链霉素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5ng/mL。
第0天：取液氮中冻存的第5代猪肌肉干细胞，复苏细胞，实验组和对照组分别用Vmedium(配方A)及常规培养基调整细胞密度为4×104/mL，取1mL接种于24孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱静置培养。
第3天：利用0.2mL 0.25％胰蛋白酶消化细胞，实验组和对照组分别用V medium(配方A)及常规培养基终止胰蛋白酶消化反应，1200rpm离心5分钟，收集实验组和对照组细胞沉淀并分别重悬于V medium(配方A)及常规培养基中，调整细胞密度为1～3×105/mL，接种于6孔板中扩大培养。
第5天：利用0.5mL 0.25％胰蛋白酶消化细胞，实验组和对照组分别用V medium(配方A)及常规培养基终止胰蛋白酶消化反应，1200rpm离心5分钟，收集实验组和对照组细胞沉淀并分别重悬于V medium(配方A)及常规培养基中，调整细胞密度为1～3×105/mL，接种于T25培养瓶中扩大培养。
第8天：利用1mL 0.25％胰蛋白酶消化细胞，实验组和对照组分别用V medium(配方A)及常规培养基终止胰蛋白酶消化反应，1200rpm离心5分钟，收集实验组和对照组细胞，进行细胞计数，显微镜观察细胞。
细胞显微照片如图1所示，两组细胞均生长良好，形态、体积相近。细胞数量统计结果如图2所示，V medium(配方A)培养肌肉干细胞，总细胞数扩增12.3±3.1倍；常规培养基的对照组细胞扩增12.8±3.5倍，两组无统计学差异，说明V medium(配方A)可以支持肌肉干细胞在体外与常规培养基培养的对照组细胞以相同的生长速率扩增。
取适量细胞进行EdU细胞增殖能力检测和PI染色法细胞周期检测，接种适量细胞进行成肌分化能力检测。
同时，接种适量细胞添加V medium(配方A)培养基继续培养。
第10天：待V medium(配方A)培养基中的肌肉干细胞达到80％～90％汇合率时，吸去原培养基，更换分化培养基(DMEM基础培养基+2％(v/v)马血清)诱导细胞分化，置于37℃，5％CO2培养箱静置培养。
第13天：利用细胞免疫荧光对分化后肌管的标志性蛋白MYHC进行鉴定，并计算细胞的分化效率(MYHC阳性细胞中细胞核数量/总细胞核数量)
实施例2：肌肉干细胞增殖能力
EdU是一种胸腺嘧啶核类似物，其连有的炔烃基团在天然化物中很少见，能在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中。在反应中采用点击化学-CuAAC(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应)，使用该反应可直接测量在细胞周期S期的DNA合成。本实验采用APE BIO公司的EdU Flow Cytometry Assay Kits(Cy5)试剂盒进行检测，Cy5azide与EdU进行连接后荧光标记增殖细胞的DNA，可通过流式细胞仪进行检测(Cy5 azide最大激发波长为646nm，最大发射波长为662nm)。
取适量实施例1中第8天实验组与对照组的细胞接种于6孔板中，实验组添加Vmedium(配方A)培养基，对照组添加常规培养基，调整细胞密度于1×105/mL，37℃，5％CO2培养箱静置培养24小时后进行EdU实验。结果如图3所示，实验组DNA合成期S期为24.8％，对照组DNA合成期S期为22.9％，说明V medium(配方A)培养的肌肉干细胞具有比对照组培养的肌肉干细胞更高的增殖活跃度。
实施例3：肌肉干细胞细胞周期检测
碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期分析。碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。可以根据流式细胞仪分析结果判断正在增殖的细胞的相对量。
取相同数量的第5代猪肌肉干细胞接种于6孔板中，实验组添加V medium(配方A)培养基，对照组添加常规培养基，37℃，5％CO2培养箱静置培养24小时后，采用碧云天细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)进行细胞周期检测。结果如图4所示，两组细胞处于S期、G2/M期的比例相近分别为20.5％和20.9％，说明Vmedium(配方A)培养的肌肉干细胞未改变细胞的增殖周期。
实施例4：肌肉干细胞成肌分化检测
取适量实施例1中第8天实验组与对照组的细胞接种于48孔板中，实验组添加Vmedium(配方A)培养基，对照组添加常规培养基，调整细胞密度于1×105/mL，37℃，5％CO2培养箱静置培养扩增，待细胞达到90％汇合度时，吸弃培养基，用37℃预热的PBS缓冲液清洗一次，加入分化培养基(即97％(v/v)DMEM培养基、2％(v/v)马血清、1％(v/v)青霉素-链霉素)，诱导肌肉干细胞分化为多核肌管，培养3天左右，显微镜下见到细长状多核肌管。利用细胞免疫荧光染色方法，使用MyHC抗体对分化后的肌管进行鉴定。
结果如图5所示，实验组与对照组的猪肌肉干细胞均可以融合形成多核肌管，表达肌管特异性蛋白MyHC，每条肌管含有10～50个细胞核。经V medium扩增后的肌肉干细胞分化形成多核肌管的数量比经常规培养基扩增后肌肉干细胞分化形成的肌管数量多20％～40％，表明本发明提供的方法所培养的肌肉干细胞具有成肌分化潜能和高的分化效率。
实施例5：V medium成本计算
由实施例2-4可以看出，V medium(配方A)培养的猪肌肉干细胞比对照组培养的细胞具有更高的增殖活跃度、相近的细胞周期以及更高的分化效率，当起始细胞量相同，培养至相同数量细胞所需的培养基体积相同。V medium(配方A)培养基减少了昂贵的胎牛血清添加量及bFGF的添加，仅需要添加成本低廉容易获取的维生素，成本较常规培养基减少了约2/3。
表1.V medium(配方A)和常规培养基成本对比(以配置1L培养基为例)
成分 V medium(配方A) 常规培养基
DMEM 791元 726元
FBS 555元 2775元
bFGF 0元 105元
L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐 1.2元 0元
骨化三醇 0.4元 0元
α-生育酚乙酸酯 1元 0元
青链霉素 40.6元 40.6元
总计 1389.2元 3646.6元
实施例6配方培养基及肌肉干细胞培养方法用于制备含动物蛋白肉的食品
按照实施例1的方法培养肌肉干细胞，收集培养后的肌肉干细胞，作为制备动物蛋白肉的原料。
收集培养后的肌肉干细胞，以0.5～1×106接种在胶原蛋白水凝胶支架上，添加分化培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3～5天，使肌肉干细胞分化形成肌纤维。收集分化完成的肌纤维，添加交联剂及食品风味剂。可选地，交联剂及食品风味剂按添加量的百分比包括：谷氨酰转氨酶5-10‰，食用盐10-15‰，焦磷酸盐3-5‰，三聚磷酸盐3-5‰，大豆蛋白15-20‰，重组血红素30-45‰，经通过充分混合，形成具有真实肉色和肉风味的细胞培养肉产品，可以根据需求进行烹调处理。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法是用含组合物的培养基培养肌肉干细胞，所述培养基是V medium，由基础培养基、2%胎牛血清FBS和组合物组成；组合物为100 μM的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；100 nM的骨化三醇；200 μM的α−生育酚乙酸酯；所述基础培养基为DMEM。
2.一种低成本培养肌肉干细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基是V medium，由基础培养基、2%胎牛血清FBS和组合物组成；所述组合物为100 μM的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；100 nM的骨化三醇；200 μM的α−生育酚乙酸酯；所述基础培养基为DMEM。
3.一种低成本培养肌肉干细胞的方法，其特征在于，应用权利要求2所述的V medium培养猪肌肉干细胞，培养期间每2~3天更换1次新鲜的培养基V medium。
4.权利要求2所述的培养基在制备肌肉干细胞中的应用。
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