CN112592890A - 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 - Google Patents
一种促进肌肉干细胞增殖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112592890A CN112592890A CN202011494129.4A CN202011494129A CN112592890A CN 112592890 A CN112592890 A CN 112592890A CN 202011494129 A CN202011494129 A CN 202011494129A CN 112592890 A CN112592890 A CN 112592890A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cells
- muscle stem
- culture
- ascorbic acid
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- CIWBSHSKHKDKBQ-MVHIGOERSA-N D-ascorbic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-MVHIGOERSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 13
- 101100351033 Mus musculus Pax7 gene Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 3
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- QENDFXAAWUTRRV-UHFFFAOYSA-N N-(3-azidopropyl)-6-[(2E)-3,3-dimethyl-2-[(2E,4E)-5-(1,3,3-trimethylindol-1-ium-2-yl)penta-2,4-dienylidene]indol-1-yl]hexanamide chloride Chemical compound [Cl-].CN1\C(=C\C=C\C=C\C2=[N+](CCCCCC(=O)NCCCN=[N+]=[N-])C3=C(C=CC=C3)C2(C)C)C(C)(C)C2=CC=CC=C12 QENDFXAAWUTRRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000009756 muscle regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000601661 Homo sapiens Paired box protein Pax-7 Proteins 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102100037503 Paired box protein Pax-7 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- -1 small-molecule compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
- C12N5/0659—Satellite cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/50—Poultry products, e.g. poultry sausages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种促进肌肉干细胞增殖的方法，属于细胞培养和生物技术领域。本发明设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基，包括L‑抗坏血酸、D‑抗坏血酸和/或***‑I。应用本发明优化的培养基培养的肌肉干细胞培养21天后，总细胞数量增加超过106倍，Pax7+细胞比例仍超过60％；经扩增后的肌肉干细胞能够经诱导分化形成大量典型的肌管，表达肌纤维特异性蛋白MyHC和Actin。实现了肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于制备干细胞移植物和细胞培养肉生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进肌肉干细胞增殖的方法，属于动物细胞培养和生物技术领域。
背景技术
肌肉干细胞又称肌卫星细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞。它是肌肉组织生长发育和损伤修复过程中最关键的祖细胞，当肌肉受到损伤时，处于静息状态的卫星细胞会被激活，开始迅速大量增殖，并可以启动分化程序，最终分化、融合形成新的肌管细胞，使骨骼肌得以快速地修复和再生。另外，卫星细胞还可以分化为成骨细胞和脂肪细胞等，能够为新生肌肉提供营养和稳定的支持，增加新生肌肉脂肪的含量，从而提高肌肉损伤修复效。
骨骼肌再生障碍是多种疾病类型如肌肉萎缩、糖尿病、癌症等疾病的常见并发症，也是衰老、肥胖、宇航员等人群的常见生理现象，这类患者和人群的肌肉组织功能、结构形态、生化指标发生一系列变化，肌肉重量减轻、力量减弱，严重影响了个体的活动状态，甚至危及生命健康。利用干细胞治疗骨骼肌再生障碍疾病是临床上一种新兴、有效的治疗策略，具体指通过移植肌肉干细胞到患者体内，补充肌肉干细胞的数量并重建肌纤维，进而达到修复受损肌肉组织的目的。
此外，近年来新提出的细胞培养肉概念，就是利用肌肉干细胞作为种子细胞，遵循肌肉组织的生长发育和损伤修复规律，在体外进行肌肉干细胞的培养，促进其增殖和分化，生产出人造肌肉组织，是一种颠覆传统农业***的新兴肉类生产方式。
无论是干细胞治疗还是细胞培养肉领域，肌肉干细胞数量不足的问题一直是限制其大规模应用的重要因素。肌肉干细胞在体内的数量极其稀少，需要通过组织分离提取肌肉干细胞，对其在体外进行大量扩增，获得大量具有成肌分化功能的肌肉干细胞，这是实现移植治疗或细胞培养肉制造目的最关键的一步。
目前现有的细胞培养技术通过在含血清培养基中添加生长因子、小分子化合物等维持肌肉干细胞体外生长和增殖，培养方法的优化大多是利用小鼠的细胞作为对象进行研究的。但是，已有研究表明，小鼠和人的肌肉干细胞在特性上存在差异，如CD34是小鼠肌肉干细胞特征表明标志物，但是人的肌肉干细胞是不表达CD34的。目前从研究报道来看，猪、牛等大动物的肌肉干细胞和人肌肉干细胞的形态特征、表面标志物等十分类似。此外，在肌肉干细胞体外增殖策略的研究中，如果保持肌肉干细胞的干性是必须解决的关键科学问题。常规的培养方法虽然可以使肌肉干细胞在体外扩增，但是扩增过程中肌肉干细胞的干性维持能力会大幅下降，具体表现为Pax7蛋白的表达比例和分化成肌管的效率均从第0天90％以上，培养5～7天后下降为30％以下，也就是所谓的肌肉干细胞的无效扩增，对临床移植治疗和细胞培养肉的制造十分不利。开发促进肌肉干细胞增殖以及干性维持的培养方法，实现肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于临床治疗和细胞培养肉生产具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供肌肉干细胞的体外培养方法，所述方法是用含(a)和/或(b)的培养基培养肌肉干细胞：
(a)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I(IGF-1)；
(b)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
在一种实施方式中，所述方法包括：
(1)应用含(a)的培养基培养PAX7+肌肉干细胞，培养期间更换2-3次新鲜的含(a)的培养基；可选地，在起始后第3±0.5天，更换1次新鲜的含(a)的培养基；
(2)培养起始后第11～13天，将培养基更换为含(b)的培养基，培养期间更换2-3次新鲜的含(b)的培养基；可选地，在起始后第14～16天，更换1次新鲜的含(b)的培养基。
在一种实施方式中，在培养起始后第19～21天，终止培养，收获肌肉干细胞。
在一种实施方式中，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。
本发明的第二个目的是提供组合物A或组合物B在单独或共同用于制备促进肌肉干细胞扩增的产品中的应用；其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
在一种实施方式中，所述组合物A：50～300uM L-抗坏血酸，20～150ng/mL IGF-1。
在一种实施方式中，所述的组合物A：100～200uM L-抗坏血酸，50～100ng/mLIGF-1。
在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清(FBS)的DMEM培养基。
在一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为5％～20％。
在一种实施方式中，胎牛血清在培养基中的体积浓度为10％。
在一种实施方式中，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。
在一种实施方式中，所述的肌肉干细胞是猪肌肉干细胞。
本发明还提供一种用于肌肉干细胞有效扩增的试剂盒，所述的试剂盒中包括组合物A或组合物B；其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
含有组合物A或组合物B的培养基，其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清、组合物A的DMEM培养基。
在一种实施方式中，所述的培养基为含有胎牛血清、组合物B的DMEM培养基。
本发明的有益效果：
本发明设计了体外有效扩增肌肉干细胞的培养基，不仅可以大量获得可供基础研究的肌肉干细胞，更重要的是可以满足肌肉干细胞临床移植需要和构建用于细胞培养肉制备的种子细胞库。
目前的肌肉干细胞扩增方法实现了其扩增，但在干细胞的***过程中，一个子细胞保留干性，但另一个则向下游分化，因此扩增后保持干性的细胞数量大大下降，即无效扩增。本发明使用含有L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、IGF-1的扩增肌肉干细胞的配方来有效扩增肌肉干细胞，与传统方法相比，具有以下优势：促进肌肉干细胞的有效增殖，培养21天总细胞数量增加超过106倍，Pax7+细胞比例仍超过60％；经扩增后的肌肉干细胞能够经诱导分化形成大量典型的肌管，表达肌纤维特异性蛋白MyHC和Actin。实现了肌肉干细胞的有效扩增，对肌肉干细胞的大规模培养用于制备干细胞移植物和细胞培养肉生产具有重要意义。
附图说明
图1为肌肉干细胞扩增9天后细胞显微镜照片。
图2为肌肉干细胞扩增不同时间总细胞数量(A)和培养第21天Pax7+细胞比例(B)。
图3为EdU实验检测细胞增殖能力；A对照组；B实验组。
图4为分化后Desmin免疫荧光染色情况；A对照组；B实验组。
具体实施方式
实施例中使用的胰蛋白酶为Trypsin 0.25％(Thermo Fisher Scientific货号：15050065)；胶原蛋白酶为胶原酶typeXI(Sigma-Aldrich货号：C7657)；青链霉素为Penicillin-Streptomycin(10,000U/mL)(Thermo Fisher Scientific货号：15140163)。
实施例1不同配方的培养基的设计
配方A培养基配制：在DMEM(Gibco)中添加10％(v/v)FBS、1％(v/v)青链霉素及按终浓度计的以下成分：L-抗坏血酸100μmol/L，IGF-1 100ng/mL。
配方B培养基配制：在DMEM(Gibco)中添加10％(v/v)FBS、1％(v/v)青链霉素。
配方C培养基配制：在DMEM(Gibco)中添加10％(v/v)FBS、1％(v/v)青链霉素及按终浓度计的以下成分：L-抗坏血酸200μmol/L，D-抗坏血酸50μmol/L，IGF-1 50ng/mL。
实施例2应用不同配方的培养基扩增猪肌肉干细胞
采用实施例1设计的培养基配方扩增猪肌肉干细胞，具体步骤如下：
第0天：分离猪肌肉干细胞，使用1mg/mL胶原蛋白酶XI消化肌肉组织，获得单细胞后利用流式分选***将CD31-CD45-CD56+CD29+细胞群分离，以4×104/mL密度接种于细胞培养板中，实验组添加配方A培养基，对照组添加配方B培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
第3天，从培养箱中取出细胞，吸取培养液上清，实验组添加新鲜的配方A培养基培养基，对照组添加新鲜的配方B培养基，分别再次置于培养箱中静置培养。
第6天：利用1mL胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，收集实验组和对照组细胞沉淀并分别重悬于配方A培养基和配方B培养基中，调整细胞密度为1～3×105/mL，接种于T25培养瓶中扩大培养。
第9天与第3天操作相同。
第12天：利用1mL胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，分别收集实验组和对照组细胞沉淀并将实验组的细胞重悬于配方C培养基中，将对照菌细胞重悬于或配方B培养基中，再接种于T75培养瓶中扩大培养。
第15天：从培养箱中取出细胞，吸取培养液上清，实验组添加新鲜的配方C培养基，对照组添加新鲜的配方B培养基，再次置于培养箱中静置培养。
第18天：利用1mL胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，收集实验组和对照组细胞沉淀并分别重悬于配方C培养基和配方B培养基中，调整细胞密度为1～3×105/mL，接种于多个T75培养瓶中扩大培养。
第21天：扩增完成，显微镜观察，收集细胞进行总细胞计数，并将细胞接种于小皿中进行Pax7蛋白的细胞免疫荧光染色，计算Pax7+细胞的比例。
细胞显微照片如图1所示，细胞数量统计结果如图2所示，实验组采用配方A培养基联合配方C培养基培养的肌肉干细胞总细胞数扩增1.8×106倍，Pax7+细胞比例为65％左右；对照组采用配方B培养的细胞扩增2.3×105倍，Pax7+细胞比例为30％左右，说明配方A和C联合应用，可有效扩增肌肉干细胞并保持干性。
实施例3EdU实验检测肌肉干细胞增殖能力
EdU是一种胸腺嘧啶核类似物，其连有的炔烃基团在天然化物中很少见，能在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中。在反应中采用点击化学-CuAAC(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应)，使用该反应可直接测量在细胞周期S期的DNA合成。采用APE BIO公司的EdU Flow Cytometry Assay Kits(Cy5)试剂盒进行检测，Cy5 azide与EdU进行连接后荧光标记增殖细胞的DNA，可通过流式细胞仪进行检测(Cy5 azide最大激发波长为646nm，最大发射波长为662nm)。
取1～3×105肌肉干细胞接种于6孔板中，实验组添加实施例1设计的配方A培养基，对照组添加实施例1设计的配方B培养基，24小时后进行EdU实验，结果如图3所示，实验组细胞处于DNA合成期S期的比例约23％，而对照组仅为约6％，说明配方A显著促进肌肉干细胞的增殖活跃度，有利于细胞体外扩增。
实施例4肌肉干细胞成肌分化能力鉴定
分化培养基(按体积计)：97％DMEM培养基、2％马血清、1％青霉素-链霉素。
分别取实施例2扩增后的实验组和对照组肌肉干细胞，接种于小皿中，添加分化培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，诱导肌肉干细胞分化为多核肌管，培养3天后，显微镜下见到细长状多核肌管。利用细胞免疫荧光染色方法，使用Desmin抗体对分化后的肌管进行鉴定。
结果如图4所示，实验组与对照组的肌肉干细胞均可以融合形成多核肌管，表达肌管特异性蛋白Desmin，表明本发明提供的方法扩增的肌肉干细胞仍然具有成肌分化潜能，且保存较高的分化效率。
实施例5配方培养基及肌肉干细胞培养方法用于制备含动物蛋白肉的食品
按照实施例2的方法培养肌肉干细胞，收集培养后的肌肉干细胞，作为制备动物蛋白肉的原料。
收集培养后的肌肉干细胞，以0.5～1×106接种在胶原蛋白水凝胶支架上，添加分化培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3～5天，使肌肉干细胞分化形成肌纤维。收集分化完成的肌纤维，添加交联剂及食品风味剂。可选地，交联剂及食品风味剂按添加量的百分比包括：谷氨酰转氨酶5-10‰，食用盐10-15‰，焦磷酸盐3-5‰，三聚磷酸盐3-5‰，大豆蛋白15-20‰，重组血红素30-45‰，经通过充分混合，形成具有真实肉色和肉风味的细胞培养肉产品，可以根据需求进行烹调处理。
对比例1：
具体实施方式同实施例2，区别在于，第12天、第15天、第18天均仅采用配方A的培养基，于第21天统计细胞增殖倍数和Pax7+细胞比例，结果显示肌肉干细胞总细胞数扩增1.0×106倍，Pax7+细胞比例为50％左右。
对比例2：
具体实施方式同实施例2，区别在于，第1天、第3天、第6天、第9天均仅采用配方C的培养基，于第21天统计细胞增殖倍数和Pax7+细胞比例，结果显示肌肉干细胞总细胞数扩增1.3×106倍，Pax7+细胞比例为65％左右。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.肌肉干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述方法是用含(a)和/或(b)的培养基培养肌肉干细胞：
(a)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸和10～200ng/mL***-I；
(b)终浓度为：20～500uM L-抗坏血酸、10～300uM D-抗坏血酸和10～200ng/mL***-I。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)第一阶段：应用含(a)的培养基培养肌肉干细胞至少10天，培养期间更换2-3次新鲜的含(a)的细胞培养基；
(2)第二阶段：将细胞在含(b)的细胞培养基中继续培养9～11天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)在培养起始后第2～4天，更换一次新鲜的含(a)的培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)在培养起始后第11～13天，将细胞培养基更换为含(b)的培养基，在培养起始后第14～16天，更换一次新鲜的含(b)的培养基。
5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述的培养基为含有胎牛血清的DMEM培养基。
6.组合物A、组合物B在单独或共同用于制备促进肌肉干细胞扩增的产品中的应用；其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肌肉干细胞的来源包括但不限于人、猪、牛、兔或禽类。
8.一种用于肌肉干细胞有效扩增的试剂盒，其特征在于，包括组合物A或组合物B；其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
9.含有组合物A或组合物B的培养基，其特征在于，其中：
组合物A：20～500uM L-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I；
组合物B：20～500uM L-抗坏血酸，10～300uM D-抗坏血酸，10～200ng/mL***-I。
10.权利要求1～5任一所述的方法，或权利要求6～7任一所述的应用，或权利要求9所述的培养基在食品领域制造动物蛋白肉方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011494129.4A CN112592890A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011494129.4A CN112592890A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112592890A true CN112592890A (zh) | 2021-04-02 |
Family
ID=75196943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011494129.4A Pending CN112592890A (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112592890A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112553148A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-26 | 南京农业大学 | 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用 |
| CN113150120A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-07-23 | 江南大学 | 发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法 |
| CN114134105A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-04 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法 |
| CN114645012A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-06-21 | 南京农业大学 | 一种基于食品级定向支架材料的细胞培养肉的生产方法 |
| CN114752554A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-07-15 | 江南大学 | 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 |
| CN115927171A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-07 | 中国海洋大学 | 一种用于淡水鱼类肌肉干细胞快速分化的培养基及其应用 |
| CN116004521A (zh) * | 2023-01-06 | 2023-04-25 | 超技良食(深圳)生物科技有限公司 | 一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060258003A1 (en) * | 2002-12-13 | 2006-11-16 | Celogos | Culture medium composition, culture method, and myoblasts obtained, and their uses |
| CN105745321A (zh) * | 2013-08-22 | 2016-07-06 | 修复股份有限公司 | 用于产生工程化心肌(ehm)的方法 |
| CN106854641A (zh) * | 2017-02-01 | 2017-06-16 | 徐州细力再生医学科技有限公司 | 一种肌肉干细胞的体外高效培养方法 |
| CN106916783A (zh) * | 2013-05-29 | 2017-07-04 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 |
| WO2018128779A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | The Regents Of The University Of California | Methods for generating skeletal muscle progenitor cells |
| US20180263995A1 (en) * | 2016-10-26 | 2018-09-20 | Genea Ip Holdings Pty Ltd | Generation of muscle lineage cells and therapeutic uses thereof |
| US20190365821A1 (en) * | 2016-11-18 | 2019-12-05 | Nestec S.A. | In vitro production of muscle stem cells |
| WO2020218845A1 (ko) * | 2019-04-23 | 2020-10-29 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 근골격계 줄기세포의 선택적 분화 조절방법 |
-
2020
- 2020-12-17 CN CN202011494129.4A patent/CN112592890A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060258003A1 (en) * | 2002-12-13 | 2006-11-16 | Celogos | Culture medium composition, culture method, and myoblasts obtained, and their uses |
| CN106916783A (zh) * | 2013-05-29 | 2017-07-04 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 肌肉干细胞体外培养方法及其应用 |
| CN105745321A (zh) * | 2013-08-22 | 2016-07-06 | 修复股份有限公司 | 用于产生工程化心肌(ehm)的方法 |
| US20180263995A1 (en) * | 2016-10-26 | 2018-09-20 | Genea Ip Holdings Pty Ltd | Generation of muscle lineage cells and therapeutic uses thereof |
| US20190365821A1 (en) * | 2016-11-18 | 2019-12-05 | Nestec S.A. | In vitro production of muscle stem cells |
| WO2018128779A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | The Regents Of The University Of California | Methods for generating skeletal muscle progenitor cells |
| CN106854641A (zh) * | 2017-02-01 | 2017-06-16 | 徐州细力再生医学科技有限公司 | 一种肌肉干细胞的体外高效培养方法 |
| WO2020218845A1 (ko) * | 2019-04-23 | 2020-10-29 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 근골격계 줄기세포의 선택적 분화 조절방법 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AI SHIMA,等: "IGF-I and vitamin C promote myogenic differentiation of mouse and human skeletal muscle cells at low temperatures", 《EXPERIMENTAL CELL RESEARCH》 * |
| JIAHUA FANG,等: "Vitamin C enhances the ex vivo proliferation of porcine muscle stem cells for cultured meat production", 《FOOD AND FUNCTION》 * |
| 赵战魁等: "生长因子对骨骼肌肌源性干细胞增殖的影响", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112553148A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-26 | 南京农业大学 | 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用 |
| CN113150120A (zh) * | 2021-05-21 | 2021-07-23 | 江南大学 | 发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法 |
| CN114134105A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-04 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法 |
| CN114134105B (zh) * | 2021-11-08 | 2023-07-07 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种利用高活性肌肉干细胞制备细胞培养肉的方法 |
| CN114752554A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-07-15 | 江南大学 | 一种含有天然化合物的无血清成肌分化培养基及应用 |
| CN114645012A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-06-21 | 南京农业大学 | 一种基于食品级定向支架材料的细胞培养肉的生产方法 |
| CN115927171A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-07 | 中国海洋大学 | 一种用于淡水鱼类肌肉干细胞快速分化的培养基及其应用 |
| CN116004521A (zh) * | 2023-01-06 | 2023-04-25 | 超技良食(深圳)生物科技有限公司 | 一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用 |
| CN116004521B (zh) * | 2023-01-06 | 2023-11-03 | 汕头得宝投资有限公司 | 一种用于鸡肌源性干细胞体外增殖的培养基及制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112592890A (zh) | 一种促进肌肉干细胞增殖的方法 | |
| CN101748096B (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| DE60028666T2 (de) | Verwendung von Fettgewebe-abgeleiteten Stromalen Zellen zur Differenzierung in Chondrozyten und ihre Verwendung zur Reparatur von Knorpelgewebe | |
| CN105112361B (zh) | 用于细胞的生物反应器放大的细胞培养*** | |
| CN106754668B (zh) | 一种干细胞培养液及注射液 | |
| CN112458049B (zh) | 一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法 | |
| CN103930542A (zh) | 棕色脂肪细胞组合物及方法 | |
| JP2002078484A (ja) | ｉｎｖｉｔｒｏで培養された軟骨細胞によるヒト軟骨移植片の製造方法 | |
| CN110564682B (zh) | 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法 | |
| CN102985534A (zh) | 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法 | |
| CN102066555A (zh) | 用于治疗糖尿病的源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞 | |
| EP2102330B1 (en) | Muscle derived cells for the treatment of gastro-esophageal pathologies and methods of making and using the same | |
| WO2021254296A1 (zh) | 一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途 | |
| WO2007010858A1 (ja) | 骨格筋組織由来の単一細胞よりクローン化した多能性幹細胞 | |
| CN112553148A (zh) | 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用 | |
| JP2009530334A (ja) | 軟骨細胞の軟骨表現型の維持、改善および修復方法 | |
| CN113692282A (zh) | 一种生物活性物质组合物、包含所述组合物的无血清培养基及其用途 | |
| CN102965337A (zh) | 分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基 | |
| CN113583949B (zh) | 一种细胞培养基及其应用 | |
| CN1778905A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| CN112553147B (zh) | 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用 | |
| CN116940667A (zh) | 用于培养细胞的方法和过程 | |
| CN112680408A (zh) | 一种诱导人间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法 | |
| CN115125192A (zh) | 一种骨髓上清液及其在细胞培养中的应用 | |
| CN102703380A (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210402 |