CN112458003A - 一株产双乙酰植物乳杆菌及其在泡菜中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产双乙酰的植物乳杆菌及其在泡菜中的应用，属于微生物技术领域。所述菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31，于2020年8月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20578。该菌具有较强的产双乙酰能力且发酵性能优良。接种该菌发酵使泡菜中双乙酰含量提高了96.35%，感官得分及挥发性风味物质的种类和相对含量均有所提高，结果表明植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31应用于泡菜生产具有巨大的潜力。

Description

一株产双乙酰植物乳杆菌及其在泡菜中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株从四川传统家庭自制泡菜中分离筛选出的产双乙酰能力较强的植物乳杆菌及其在泡菜中的应用。
背景技术
四川泡菜因其特殊风味被誉为“川菜之魂”，深受国内外消费者喜爱。目前泡菜产业已成为四川省最具特色的农产品加工产业，对发展蔬菜产业，带动农民增收，促进农业产业升级具有重要意义。虽然泡菜产业的发展取得了较好的成绩，但仍然存在着许多薄弱环节。如工业化生产方式的应用提高泡菜生产效率，但使其丧失了传统工艺的独特风味。此外，为使泡菜呈现更好风味，在泡菜制作过程中会添加大量香辛料。香辛料种类繁多，不同批次间可能存在色、香、味等方面的差异，致使添加香辛料后成品风味的差异。
一些微生物能利用简单的营养物质代谢产生风味物质，对发酵食品的增香提质有着重要作用。部分乳酸菌如植物乳杆菌、戊糖乳杆菌等能利用发酵体系中的葡萄糖、柠檬酸产生双乙酰（丁二酮），该物质具有淡淡的奶油香，是酸奶、干酪等发酵乳制品中一种重要的风味物质。同时也是泡菜香气的特征主体成分，对泡菜风味影响较大。由微生物代谢产生的双乙酰等香气成分属于天然食品添加剂，易于被消费者接受，具有市场竞争力。
目前已有学者从酸奶、干酪及野生植物中筛选到产双乙酰的乳酸菌，并在改善发酵乳制品风味方面得到了良好的应用。Tian等（Tian, H et al 2019）从西藏灵菇中筛选得到一株双乙酰产量为15.92mg/L的植物乳杆菌，并将其应用于酸奶发酵，促进了酸奶中挥发性风味物质的形成。王雪妮（王雪妮, 2014）以无菌全脂复原乳为基质，筛选到9株高产双乙酰的嗜热链球菌，其双乙酰产量均在12mg/L以下。此外，还有学者从发酵乳制品中筛选到产双乙酰能力较强的嗜柠檬酸明串珠菌（田玉娟, 2015）、戊糖乳杆菌（彭涛, 2011），其双乙酰产量分别为23.826mg/L及16.287mg/L。未见从泡菜中筛选出产双乙酰的乳酸菌并接种发酵泡菜的报道。泡菜发酵是一个高盐、高酸的环境，其中的乳酸菌经过长期的自然筛选具有更强的环境适应性，更适用于泡菜发酵。因此，以四川传统家庭自制泡菜水为样品源，从中筛选出产双乙酰能力强、发酵性能优良的乳酸菌，对改善泡菜风味、解决香辛料差异而引起的泡菜品质波动问题具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一株泡菜中产双乙酰的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31及其应用。
本发明所提供的菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20578，保藏日期为2020年8月28日。
本发明提供泡菜中产双乙酰乳酸菌的分离、筛选、鉴定及应用。
将泡菜水样品10倍系列稀释后，吸取适宜稀释度样液涂布于MRS固体培养基平板，37℃培养48h后，挑取有溶钙圈的具有乳酸菌典型菌落特征的菌落进行多次平板划线纯化，保存备用。
将上述获得的乳酸菌进行产双乙酰初筛，取一环菌落接于装有5mL无菌萝卜汁培养基的试管中，37℃培养48h后，采用肌酸比色法筛选菌株。
用无菌生理盐水调整初筛所获乳酸菌的菌体浓度为108CFU/mL，以2%接种量接种至萝卜汁培养基中，37℃培养48h后，采用邻苯二胺比色法筛选出一株产双乙酰能力较强的乳酸菌，编号为LYA31，该菌株于无菌萝卜汁中发酵48h后，双乙酰产量达20.31mg/L。
菌株LYA31形态鉴定：肉眼观察菌落形态为圆形、白色、中间凸起、表面光滑，在含CaCO3的MRS固体培养基平板上形成溶钙圈。光学显微镜下观察到菌体细胞呈短杆状，革兰氏染色呈阳性。
菌株LYA31生化鉴定：采用法国梅里埃的API 50CHL乳杆菌属生化鉴定条对菌株进行生化鉴定，结果显示LYA31能代谢山梨醇、菊粉等底物，经比对，初步将LYA31鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
菌株LYA31分子鉴定：提取菌株DNA，并对16S rDNA进行扩增，电泳检测合格后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
将该菌株的16S rDNA 基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与菌株Lactobacillus plantarum基因序列高度同源，结合形态学和生化实验结果，最终将菌株LYA31鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
对菌株LYA31进行产酸、降解NaNO2试验，结果显示LYA31在MRS液体培养基中培养48h后，发酵液中总酸含量达到1.94g/100mL，NaNO2降解能力为69.67%。
将菌株LYA31按0.2%接种量接种发酵泡菜，结果显示接种LYA31发酵的泡菜风味优于自然发酵泡菜，泡菜水双乙酰含量提高了96.35%。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：首次从四川传统家庭自制泡菜中筛选获得高产双乙酰的植物乳杆菌，并证实了其具有良好发酵性能。37℃48h内可降解69.67%的125μg/mL NaNO2，18h内菌株LYA31产酸能力较强，发酵液总酸含量达到1.94g/100mL，将其应用于泡菜发酵，能明显增加泡菜中双乙酰的含量，同时提高泡菜风味品质结果表明产双乙酰植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为菌株LYA31的菌落和细胞形态图。
图2为菌株LYA31的***发育树。
图3为泡菜成品图。
具体实施方式
下述实施例中各培养基的配方如下：MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 ml、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、碳酸钙15g，pH 6.0~6.4，溶解于1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20min。MRS固体培养基即加入2%的琼脂粉，121 ℃灭菌20min；
萝卜汁培养基：白萝卜与蒸馏水1:1混合打浆，四层纱布过滤后，添加盐3%、葡萄糖2%、柠檬酸0.2%、115℃灭菌15min。
实例1：泡菜中产双乙酰乳酸菌的筛选鉴定。
1）泡菜中乳酸菌的分离纯化：用无菌生理盐水对泡菜水样品进行10倍系列梯度稀释，吸取200μL 10-2、10-3两个稀释度样品于MRS固体培养基平板，无菌涂布棒涂布均匀，同时取样品原液划线，37℃培养48h后，挑取有溶钙圈且形态不同的菌落于MRS固体培养基平板反复划线，最终得到单菌落。将纯化后的菌种于30%甘油中冻存。
2) 产双乙酰乳酸菌的初筛：用无菌接种环挑取一环冻存于甘油管中的菌液划线于MRS固体培养基平板，37℃培养48h后，挑取一环单菌落于装有5mL萝卜汁培养基的试管中，混合均匀，37℃培养48h后，将发酵液与显色剂（0.5%肌酸、1%1-萘酚、16%氢氧化钾混合溶液）按2:1混合，30℃反应30min后观察发酵液是否变为红色。结果以“-”（阴性）、“+”（微红）、“++”（粉红）及“+++”（深红）表示。
3) 产双乙酰乳酸菌的复筛：选择初筛结果为“++”及“+++”的菌株进行复筛。将冻存于甘油管中的菌液于MRS液体培养基中活化，37℃培养至菌体密度为108CFU/mL，8000r/min离心10min收集菌体，用无菌生理盐水反复洗涤2~3次后，加入等量无菌生理盐水重悬菌体，按2%接种量接种于装有20mL萝卜汁培养基的三角瓶中，37℃培养48h后，采用邻苯二胺比色法测定发酵液中双乙酰含量，每个样品做3个平行。
37℃发酵48h后，接种LYA31的发酵液中双乙酰含量最高，为20.31mg/L，因此，选择菌株LYA31进行后续实验。
4) 菌株LYA31鉴定。
①形态鉴定：用无菌接种环挑取一环冻存于甘油管中菌液划线于MRS固体培养基平板，37℃培养48h后，观察到其菌落形态为圆形、白色、中间凸起、表面光滑，在含CaCO3的MRS固体培养基平板上形成溶钙圈。挑取一环单菌落进行革兰氏染色，光学显微镜油镜下观察到其菌体形态为短杆状，革兰氏染色呈阳性。菌株LYA31菌落、细胞形态如图1所示。
②生化鉴定：用无菌接种环挑取一环冻存于甘油管中的菌液划线于MRS固体培养基平板，37℃培养48h后，使用法国梅里埃的API 50CHL乳杆菌属生化鉴定条对其进行生化鉴定。
LYA31能代谢菊粉、赤藓糖醇等底物，LYA31生化鉴定结果如下。
Figure 26649DEST_PATH_IMAGE002
③分子鉴定：将筛选所得菌株接种于装有5mL MRS液体培养基的试管中，37 ℃静置培养16h，收获菌体。按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以此DNA为模板，用细菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增16S rDNA全长序列。PCR产物经检验合格后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，BLAST进行同源性比对，并用MEGA5.0构建***发育树。
将序列导入NCBI进行BLAST同源性比对，结果显示，菌株LYA31与植物乳杆菌相似度达100%（图2）。结合形态学及生化实验结果，将菌株LYA31鉴定为Lactobacillus plantarum植物乳杆菌。将其16S rDNA序列上传NCBI，获得登录号MT998495。
实例2：Lactobacillus plantarum植物乳杆菌LYA31发酵性能测试。
1) 产酸能力：将菌株LYA31活化后在MRS液体培养基中37℃培养18h，按2%接种量接种至盛有30mL MRS液体培养基的三角瓶中，37℃培养48h，参照GB/T 5009.51-2003中4.6操作测定发酵液总酸含量,同时测定其pH。
菌株LYA31产酸能力测试结果如表2所示。由表2可知，菌株LYA31产酸能力较强，于MRS液体培养基中培养48h后，发酵液总酸含量达到1.94g/100mL，其pH也相应较低。
Figure 583532DEST_PATH_IMAGE003
2) NaNO2降解能力：将菌株LYA31活化后在MRS液体培养基中37℃培养18h，按2%接种量接种至盛有30mL含有125μg/mL NaNO2的MRS液体培养基的三角瓶中，37℃培养48h后，参照GB 5009.33-2016测定发酵液NaNO2含量。
经测定，菌株LYA31具有较强的NaNO2降解能力，于MRS液体培养基中培养48h后，降解率为69.67%。
实例3：Lactobacillus plantarum植物乳杆菌LYA31在泡菜发酵中的应用。
1) 泡菜的制作：将新鲜萝卜清洗、沥干，切分为长宽高约为2~4cm的块状后置于泡菜坛中，与6%盐水1:1（w/v）混合，按盐水体积0.2%接种菌株LYA31为试验组，以不接种自然发酵为空白对照组，密封后，于30℃发酵5d。
2) 感官评定：选取10名具有食品专业背景的研究生组成感官鉴评小组，按照总体得分=色泽与形态×20%+香气×20%+质地×30%+滋味×30%对自然发酵泡菜及接种LYA31发酵泡菜进行感官鉴评。
由泡菜感官得分结果可知，接种菌株LYA31发酵的泡菜在香气及滋味方面均明显优于自然发酵泡菜（P＜0.05），总体感官得分显著高于自然发酵泡菜（P＜0.05），说明产双乙酰植物乳杆菌LYA31能够提高泡菜感官品质。
Figure 319407DEST_PATH_IMAGE004
3) 泡菜双乙酰含量测定：经测定接种LYA31发酵的泡菜中双乙酰含量为16.12mg/L，自然发酵的泡菜中双乙酰含量为8.21mg/L，接种LYA31发酵使泡菜中双乙酰含量提高了96.35%。
4) 泡菜挥发性风味物质测定：采用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）测定自然发酵泡菜及接种LYA31发酵泡菜的挥发性风味物质。测得接种LYA31发酵泡菜中挥发性风味物质47种，自然发酵34种。接种LYA31发酵提高了泡菜挥发性风味物质的种类及相对含量。
Figure 454327DEST_PATH_IMAGE006
以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一株产双乙酰植物乳杆菌及其在泡菜中的应用
<141> 2020-10-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
ggctggttcc taaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt acaaactctc atggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga atggctttaa 180
gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac tgataataag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg catagtatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 600
agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc attcatcgtt tacggtatgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc gagcctcagc gtcagttaca 720
gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 780
acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcttc 840
ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900
ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
gtggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta ctctcagata tgttcttctt 1020
taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1080
ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1140
cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1200
gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1260
ctttcaagct cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1320
gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactcactca 1380
aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa taccagagtc 1420

Claims (3)

1.一株产双乙酰的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31，其特征在于：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.20578的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31。
2.根据权利要求1所述产双乙酰的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31，其特征在于：所述菌株分离自四川传统家庭自制泡菜并应用于泡菜发酵，菌株经过形态、生化及分子鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31的应用，其特征在于：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31应用于泡菜发酵，将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31种子液按0.2%接种量接种至泡菜盐水中，混合均匀后加入新鲜蔬菜，于30℃发酵5d制得接种发酵泡菜，并以自然发酵泡菜为对比，感官鉴评结果表明，接种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31发酵泡菜的感官品质优于自然发酵泡菜；接种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31发酵使得泡菜双乙酰含量提高了96.35%；检测得出接种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31发酵泡菜中47种挥发性风味物质，自然发酵泡菜34种，接种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31发酵增加了泡菜挥发性风味物质的种类和相对含量，同时其可降解NaNO2，表明植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LYA31能提高泡菜风味品质，具有潜在应用价值。
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