CN112438278B - 处理农作物和观赏植物中，优选葡萄种植和木本植物中的感染的方法 - Google Patents
处理农作物和观赏植物中，优选葡萄种植和木本植物中的感染的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于处理农作物和观赏植物中的真菌，特别是卵菌的感染，以及细菌感染的方法。应用领域是藤本植物、水果、蔬菜和观赏植物的种植。本发明的根本问题是开发用于处理藤本植物和蔬菜栽培中的真菌，特别是卵菌的感染，以及细菌感染，特别是霜霉病菌(霜霉目)和丁香假单胞菌的方法。意外地发现，所选择的蛋白酶单独地以及与补充的酶组合有效地处理由某些植物病原性生物体引起的植物的感染。受保护的植物未被感染。从而处理植物树干内的病原体的繁殖。本发明的方法的特征在于，在生长期，优选在高感染威胁的天气相关阶段之前，制备单独的或者与β‑葡聚糖酶和/或几丁质酶组合的蛋白酶水溶液，添加稳定剂、粘着剂和润湿剂，以及通过常规技术向植物施用加成的溶液数次。
Description
分案申请声明
本申请是第2015800354827号中国专利申请的分案申请。
描述
本发明涉及用于处理农作物和观赏植物中的由真菌，特别是卵菌引起的感染的方法，以及涉及细菌感染的处理。应用领域是蔬菜、水果、藤本植物和观赏植物的种植，优选藤本植物和蔬菜的种植。由卵菌引起的感染的相关性、进程和控制
每年，农作物和观赏植物以及木本植物中的植物性病害导致高的经济损失。而且，温室中的水载蔬菜和观赏植物的种植中，真菌和卵菌如疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)和霜霉属(Peronospora)对植物病害的原因起主要作用(Malathrakis&Goumas,1999；Paulitz&Berlanger,2001)。在蔬菜(特别是马铃薯和番茄)、水果、观赏植物和藤本植物的种植以及在森林地中，它们具有特别的经济相关性。在2013年，全球19.3百万公顷的农业用地种植马铃薯(***粮食及农业组织统计司)。马铃薯种植中的最主要病原体(通过将植物种植扩展为较暖气候而获得更大重视)是卵菌致病疫霉(Phytophthorainfestans)，引起晚疫病的病原体(Oerke und Steiner,1996)。它的传播只能通过经常使用杀真菌剂来控制(仅仅用于马铃薯的种植，每年就超过235百万US$)。仅杀真菌剂的总市场每年总计55亿US$(Powell&Jutsum,1993)。
在德国，仅仅是葡萄种植中的害虫控制，每年就花费大约100百万欧元(Ochβner,2009)。在生态性的葡萄种植中，仅使用含铜的植物保护产品。然而，这些产品对环境有害并且可能有毒。由于该原因，确立有效抵抗病原体且同时生态友好的可选、改善的保护手段是令人感兴趣的。
在这里，将利用引起葡萄霜霉病的葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的实例来描述卵菌的繁殖周期。将生命周期分为两个不同的流行病学意义部分。卵孢子在有性生殖阶段形成，卵孢子对冬季期间病原体的存活是重要的。在无性生殖的夏季周期，释放大量的孢子囊。葡萄霜霉病菌以卵孢子的形式在严重寄生的叶片的叶碎片的土壤中过冬。在晚冬期间，卵孢子变得可萌发并且维持它们的萌发能力直到夏初。一旦土壤变暖并且降有足够的降水，它们萌发并形成初生孢子囊。直到六月中旬，在暴雨期间卵孢子保持萌发。一些卵孢子也可能休眠超过一年并且在来年萌发。通常，当温度上升在10℃以上并且具有超过8mm的降水时，游动孢子的萌发和释放起源于初生孢子囊。在这些条件下，通常，葡萄藤的第一批新叶是展开的，使得可以发生初次感染。为了通过萌发的游动孢子发生初次感染，叶子必须被水充分地润湿。只有在该阶段，如果损害或抑制游动孢子是成功的，则可以预防或减少感染。
初次感染是葡萄霜霉病菌的夏季周期的起点，其中如果再生的条件是有利的，则病原体通过孢子囊以无性生殖的方式再生并且可以引起疫情。初次感染之后是潜伏期，其中病原体在叶的内部成熟，而无可见的症状。在那时，处理感染不再可能。病原体的生长和发育严重地依赖于温度，以致于在较高的温度下，相比于低温，叶组织被菌丝体更快渗入，以及油斑出现更早。在潜伏期末期，所谓的油斑呈现为真菌感染的可见症状。一旦在夜晚，相对湿度上升在95％以上，且温度维持在12℃以上，孢囊梗便从感染叶片的气孔突出。孢子囊通过水滴或空气的移动扩散。一旦这些水滴接触它们的宿主植物的绿色部分，游动孢子便孵化。游动孢子的孵化和随后感染在24℃的最佳条件下四小时内发生。如果温度较低或较高，游动孢子的孵化延迟，且感染过程延长。葡萄霜霉病菌可以感染叶子、花序(包括茎)、葡萄和芽尖端，如果它们具有气孔并且如果它们被润湿的话。小水滴已经足够用于感染，然而，如果用水进行润湿是大范围的且长时间持续，则感染的条件更有利。在每次感染之后，再次是潜伏期，并且随后一旦在夜晚具有足够的湿度，则孢子囊将扩散。葡萄霜霉病菌属于多环的病原体，并且在一个种植季节可以经历数次繁殖周期。如果在较长的时期中保持孢子囊的扩散和感染的最佳条件，并且由于温度条件潜伏期短，则可以快速地发展疫情。干旱会延迟葡萄霜霉病菌的扩散并阻碍疫情的进程。局部地预测感染的高风险期并且从而采取具体的预防防范措施是可能的。
在中欧流行的气候条件下，通过此类病原体导致的感染每一年都在意料之中。这些感染导致疫情的程度高度依赖于每年的天气条件，并且在种植期开始时并不能预测。疫情，例如葡萄霜霉病的疫情(葡萄霜霉病菌)在高度易感的经典葡萄品种中几个雨天内可能变得十分严重。因此，在早期阶段必须检测和控制该感染。如果侵袭已经处于晚期阶段，则后期控制不再可能。对于该原因，商业的植物种植针对此类感染的预防性措施只是可能的。在德国联邦的葡萄种植研究所(Staatliches Weinbauinstitut)，对于葡萄霜霉病菌，已经开发了允许进行特别的预防性控制的预测方法，并且投入了实践。
当前，众多杀真菌剂供出售，用于常规的植物种植。仅仅在葡萄种植中，目前就批准了29种杀真菌剂，用于在葡萄霜霉病中施用。
对于生态性藤本植物的种植，葡萄霜霉病是一种挑战，因为在这里预防性处理不可缺少，并且当前只批准了含铜的制备物(例如Cuprozin)。由于已知的关于铜的生态毒理担忧，迫切需要找到该试剂的替代物。然而，这些替代物在高的侵袭率下也必须具有充分的功效。数年来，测试已证明，被批准作为植物加强剂的大多数制备物针对葡萄霜霉病未显示出满意的功效。一些植物加强剂针对低侵袭率的葡萄霜霉病是有效的，然而，控制措施在此时不是必要的。在较高的侵袭率下，测试的制备物的功效是不充足的，这也从商业的角度证明与之斗争是正当的。从这些测试认识到，葡萄霜霉病的生物控制在生态学植物种植中行不通。尤其是在停止疫情具有有限的可能性的生态学藤本植物的种植中，迫切地需要用于生物控制疫情的有效且行得通的方法。
细菌感染的相关性、进程和控制
尽管植物病原菌的数目少于真菌样病原体的数目，但是由细菌病害引起的对农作物植株的损害非常高。在全球，黄单胞菌属(Xanthomonas)的细菌在所有主要的高等植物群中引起病害，其伴有萎黄和坏死的病变、枯萎和腐烂。高经济相关性的实例是甘蓝品种中的黑腐病，其由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)引起。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)通过侵袭稻米植株导致大米的白色叶子/细菌性枯萎，并且随后产生经济和社会问题，这是稻米植株中最严重的病害之一。同样地，必须提及柑橘溃疡致病菌(Pathovar X.axonopodis pv.citri)和地毯草黄单胞菌辣椒致病变种(X.campestris pv.Vesicatoria)，所述柑橘溃疡致病菌是引起柑橘癌的病原体，所述地毯草黄单胞菌辣椒致病变种是引起胡椒和番茄上的细菌性叶斑病的病原体，这在在温暖和潮湿的气候的地区特别具有经济重要性。而且，必须提及由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)病原体引起的火疫病，其经历了强制性的报道。解淀粉欧文氏菌的宿主植物是蔷薇科，如苹果、梨和温柏。解淀粉欧文氏菌引起被侵袭植物的叶和开花的枯萎，然后其将变成棕色或黑色。而且，必须提及细菌物种丁香假单胞菌，其在重要的农作物植株(如番茄、胡椒和黄豆)中引起多种植物性病害，如癌症、枯萎和斑点。这种广泛的物种在玻璃下生长的许多植物(如番茄、黄瓜和西葫芦)中具有重要的价值。
所描述的细菌性植物病原体中的大部分属于变形菌门的群并且是革兰氏阴性生物体(例如假单胞杆菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas))。然而，还存在经济上相关的革兰氏阳性病原体，如引起番茄中的细菌性萎蔫病的番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensis ssp.Michiganensis)。该检疫性有害生物在暖和干燥的番茄种植地区和在温室中具有重要的价值。
植物病原菌具有在环境中(例如在土壤中、在植物材料(如种子)中或者在昆虫中)存活的多种策略。昆虫、其它动物和人在植物病原菌的扩散中发挥重要作用。水(例如以雨滴的形式)是关于在植株上分布的重要媒介物。如果细菌被转移至宿主植株，则它们通过天然开口(如气孔或排水器)、通过植株的病变处渗入。高的细菌密度以及外部条件(如雨、高的湿度或损伤的斑点)促进植株的感染。细菌在植株的内部可以容易地繁殖，它们殖民于质外体并且从这里损害整个植株。它们干扰植物的生理机能和形态学，并且从而它们引起病害症状，如坏死斑、落叶、成疤、枯萎或腐烂(De la Fuente and Burdman,2011)。
因此，保护农作物植株免受此类细菌的感染并从而保护它们的收获是至关紧要的。在德国批准的具有抗菌效果的植物保护剂的当前列表中出现各种化学化合物和铜化合物。含铜的制备物是唯一的手段，其反过来允许在生态农业中使用。用于控制细菌病的含铜制备物的处理具有部分效果，并且一旦细菌种菌的密度超过某一阈值就显示出它们的局限性。由于铜化合物和其它农药的已知生态毒理作用，存在关于使用此类植物保护产品的合理担忧。此外，即使在德国，在特殊情况下，允许使用含抗生素(如链霉素)的植物保护剂以控制火疫病。在其它国家，链霉素是抵抗细菌病的合法手段，但是同时，抗生素的使用非常有问题，因为对环境的不良影响，以及通过抗生素的无差别使用可能遭遇由细菌耐药的发展导致的功效的降低。因此，迫切地需要发展环境更友好且对使用者更安全的这些物质的改善的、高度有效的以及商业相关的替代物。
植物保护的当前发展策略
1.关于对非靶向生物体的功效、选择性、特异性、生物降解和功效的化学性植物保护产品的需求是稳定递增的。同时，许多新的植物保护产品可以满足这些需求。许多以前的化合物(如烃类(艾氏剂、DDT、DDD、狄氏剂、开乐剂))的使用目前是禁止的。然而，当前使用的化学性植物保护产品(例如邻苯基苯酚E 231或噻苯咪唑E 233)越来越受到批评。它们显示出数种有害的副作用，使得它们的使用成问题。这些有害的副作用包括，农作物植株区别的损伤、农作物味道的改变、对多种有益生物体的毒性作用、耐药的害虫群体的发展、微生物的不完全分解并且从而在土壤中太长时间的持续和积累以及最终渗入地下水并在人和动物的食物链中累积(Source:Umweltlexikon-www.umweltlexikon-online.de)。
2.逐渐地，生物和综合的植物保护方法正在建立，如使用针对昆虫的有益生物体和外激素、使用土传的细菌和真菌拮抗剂以及使用植物提取物。最重要的拮抗作用类生物体是芽孢杆菌、假单胞杆菌和链霉菌(Streptomyces)细菌以及木霉、盾壳霉属(Coniothyrium)和轮枝菌(Verticillium)真菌。在本背景中特别重要的是细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和真菌木霉属，所述枯草芽孢杆菌的菌株作为“植物促生根圈细菌”(PGPR)分泌植物检疫的代谢物，所述真菌木霉属的菌株用作“生物控制剂”(Kücük,C.and M.Kivanc,2002；DeMarco,J.L.等,2003)。虽然可以通过这些生物方法充分地控制许多动物害虫，但是由卵菌引起的感染难以斗争。在农业部门，下述植物性病害由于其感染风险及其导致的损失而具有显著的重要性(表1)。
表1
本领域的现状
已知，非淀粉的多糖水解酶类型的糖苷裂解酶的制备物在植物病原真菌的预防和治疗中有效。在这里，假定了所述酶对真菌细胞壁的结构，特别是对卵菌细胞壁的结构进行直接攻击(DE 10 2205 048 520,Biopract GmbH)。然而，这些水解也可能损害植物的细胞壁，因此，它们仅部分适用于植物保护。
非淀粉多糖水解酶类型的酶对真菌植物病原体的预防和治疗的用途也被其它领域的许多发现支持。例如，在用来自木霉菌的复合酶制备物斗争基于***的鱼真菌病中获得经验(WO 2004/002574 A1Biopract GmbH)。
美国专利6663860(Tvedten,2003年12月16日)描述了蛋白酶作为针对尤其是昆虫、细菌和真菌的杀虫剂。然而，在预防葡萄栽培的真菌侵袭中使用不是预期的。
此外，杀虫剂和酶(例如蛋白酶)的组合描述于多个专利文件中。在此，所描述的效果基于杀虫剂，而不是基于添加的单独的酶(WO 2013/096383 A2、CN 103461383 A、WO1997/047202 A1、WO 1990/003732 A1)。其它专利文件描述了洗涤剂和酶的组合(US7393528 B2)、植物提取物和蛋白的组合(WO 2001/030161 A1)以及表面活性物质和酶的组合(EP 184288 A1)。这些出版物也没有证明酶本身负责杀虫的效果。
最后，显示尤其是抗真菌或抗细菌效果的酶或酶的组合在过去已有描述，例如来自植物的蛋白酶(WO 1991/002459 A1)、来自蚯蚓的蛋白酶(JP 2011177105A)或芽孢杆菌发酵的培养上清液(JP 54073182 A)。
以上提及的发明中没有一个描述农作物植株被卵菌和细菌侵袭的既有问题的可比较的有效解决方案。这里描述的蛋白酶提供了高度有效且同时环境上合理的针对常规植物保护产品的替代物。
本发明的目的
本发明旨在开发用于控制由真菌，特别是卵菌引起的感染，以及农作物和观赏植物中的细菌感染的高效的方法，所述方法对植物本身以及对生态***无害。本发明的最初目的是开发用于预防由植物病原体引起的农业中的农作物植株的感染的方法。具体而言，应该解决识别和预防在葡萄品种早期中的疫情(如葡萄霜霉病)的问题。提供合适的方法也是本发明所包含的。
通过权利要求中所描述的措施解决该问题。本发明所述的方法的特征在于，分别制备浓缩物和备用的溶液，其含有单独的蛋白酶或者蛋白酶和β-葡聚糖酶和/或几丁质酶的组合。本发明的精髓是提供单独的蛋白酶作为用于控制农作物和观赏植物中的感染的有效手段的意外可能性。
此外，保护性产品可以含有改善应用特性的稳定剂、粘合剂和润湿剂。常规的雨水稳定剂和UV稳定剂也可以包含在这些混合物中。
通过常规的施用***，在固定的时间施用该混合物，基于天气条件、润湿整个植株的方式来确定施用***。可以在4℃至34℃的温度下进行施用，并且因此在整个种植季节期间进行施用。在玻璃下的植物栽培中，所述施用大部分不依赖于天气条件，并且温度范围为15℃至25℃。该施用模式确保酶制备物有活性，并且防止植物被例如植物病原性卵菌或细菌病原体(如丁香假单胞菌)的游动孢子感染。根据农作物植株确定每面积的施用量。例如在藤本植物的种植中，当前，在一公顷的面积上施用大约400至800升的喷雾混合物。所描述的酶制备物以可以继续使用常规喷雾技术的方式混合。
本发明所描述的相比于当前建立的手段和方法显示重大进步。
以下描述了相比于本领域现状的优势：
·与含铜的制备物或其它化学性植物保护产品相比，酶制备物的使用对生态***无害，因为所述物质在土壤中被完全降解，并且不积累。因此，阻止值得考虑的环境损害。
·不存在植物性毒素的反应，因为本发明所应用的蛋白酶不攻击植物表面。
·蛋白酶和其它酶在植物生长期间是有效的。它们不在一个位置粘附于叶片结构上，但是以液膜的形式分散在表面上。
·尽管有雨水和UV辐射，酶的功效在数天的相关时期内保持完整。若需要，可以通过合适的制剂改善该稳定性。
蛋白酶(也被称为肽酶)切割蛋白中的肽键，并且因此促进其对肽或氨基酸的降解。基于它们的作用模式，将其分为以下的组：丝氨酸蛋白酶，EC 3.4.21.-，(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知的或迄今为止未分类的蛋白酶(Handbook of Proteolyse Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds),Academic Press(1998))。
所描述的根据本发明使用的蛋白酶具体而言是丝氨酸蛋白酶。该酶类的催化机理基于氨基酸丝氨酸的亲核羟基，所述酶类可以切割肽键。可以从例如来自拟诺卡氏菌属或芽孢杆菌属的微生物的培养上清液获得各自的酶。各自的酶也可以重组产生。而且，有效的蛋白酶可以是以类似方式作用的所描述酶的突变体、变体或片段。
用使用含有各自肽键的底物(例如酪蛋白)的每一种检测方法，可以测定蛋白酶的活性。
意外地，已经发现，用于例如动物饲养中的蛋白酶制备物能预防植物被植物病原性卵菌和细菌感染。具体地，在卵菌的繁殖周期出现的且造成叶组织的实际感染的游动孢子被这些酶的活性不可逆地损害，并且所保护的植物的感染不会发生。迄今为止还没有阐明针对细菌侵袭的作用模式。这些酶的显著影响预期不会达到这样的程度，因为作用模式和攻击位点与β-葡聚糖酶或几丁质酶的所描述的作用模式不相符。通过与β-葡聚糖酶和/或几丁质酶组合可以增加保护效果。
含有所描述的蛋白酶的可商购制备物是例如
(DSMNutritional Products AG,exdamples 1-9:Prot III)或
(Novozymes AG)，所述
含有来自拟诺卡氏菌的丝氨酸蛋白酶，所述
主要地含有来自地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的一种丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶A)。此外，显示出保护性效果的选择的蛋白酶制备物是Lumis酶公司的制备物(PAP2XS)(据所知，其含有来自木瓜的木瓜蛋白酶)、Cyadic公司的制备物(Protease Plus,ProteaseAP Conc)以及AB酶公司的制备物(BIOTOUCH ROC 250LC)(据所知，其含有来自木霉的蛋白酶)。
葡聚糖酶和几丁质酶是可以水解葡聚糖或几丁质的酶。它们被分配为酶类E.C.3.2.1.-，所述酶类包含糖苷酶，即切割O-和S-糖苷键的酶。
根据具体病害的特性，通过用浓度为0.001％至1％的酶制备物处理植物的气生部分(例如通过喷射)来施用针对叶病原体(例如霜霉菌或丁香假单胞菌)的酶。蛋白酶和糖基化酶优选以单一酶的不同混合比例使用。
根据本发明，酶制备物的效果通过使用单独的蛋白酶或者以混合物的形式实现，其表现在本身防止感染的发生。
从微生物的培养上清液获得酶。使病原体失活的组分优选在pH范围为4.5至8.5，优选pH范围为6.0至7.5的水性环境中使用。它们在4℃至34℃，优选在10℃至25℃的水温下使用。
在下文中，本发明将通过实施例来描述。实施例1-7表明蛋白酶的使用保护抵抗卵菌，而实施例8和9描述了针对细菌感染的保护性效果。
(DSMNutritionai产品s AG)以蛋白酶III的形式使用。
实施例
保护农作物植株免受由卵菌引起的感染
实施例1
在叶盘中，蛋白裂解酶制备物的适时叶片施用对葡萄霜霉病菌的感染抑制作用
用不同的蛋白裂解酶制备物(蛋白酶I、II和III)通过喷洒施用将葡萄藤Vitisvinifera cv.Müller-Thurgau的叶盘处理一次，使得所用叶盘的叶子的底侧被均匀地润湿。所述制备物含有各自的丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶从拟诺卡氏菌属或芽孢杆菌属的物种获得。用于处理的酶制备物以0.01％至1％(v/v)的浓度范围进行测试。在水中稀释的制备物的pH值的范围为6至7.5。作为对照，用含铜的植物保护产品或者用水喷洒叶盘。处理之后24小时，用葡萄霜霉病菌(在葡萄藤中引起霜霉病的病原体)进行叶盘的人工感染(每ml水大约40000个孢子)。随后，在具有昼夜节律的植物室中，将叶盘在水琼脂板上于22℃孵育六天。
根据叶子的总面积与叶子的感染面积的比值计算侵袭的程度。为了分析，使用能区分总面积(实验开始时叶盘的绿色像素点的数目)和感染面积(实验结束时白色像素点的数目)的图像评价软件。两种测试的蛋白酶制备物(I，III)以及含铜的植物保护产品(Cuprozin)有效地预防葡萄霜霉病菌的侵袭和发展(0％的侵袭)，第三种制备物蛋白酶II仅一定程度地预防侵袭(38％的侵袭)。然而，用水喷洒的叶盘显示显著的侵袭(参见表2和图1)。
表2：
在用三种不同的蛋白酶制备物处理叶盘之后，根据叶盘的总面积相对于每叶盘的感染面积的比值，计算侵袭的程度(％)(n＝36)
实施例2
在叶盘中，蛋白酶、几丁质酶和糖苷裂解酶制备物的组合的适时叶片施用对葡萄
霜霉病菌的感染抑制作用.
由1:1:1的混合比例的蛋白酶、几丁质酶和β-葡聚糖酶组成的酶组合通过喷洒施用，将葡萄藤Vitis vinifera cv.Müller-Thurgau的叶盘处理一次，使得所用叶盘的叶子底侧被均匀地润湿。对于各种酶而言，所使用的酶制备物的浓度是0.1％(v/v)。水稀释的制备物的pH值的范围为6至7.5。作为对照，用含铜的植物保护产品或者用水喷洒叶盘。处理之后24小时，用葡萄霜霉病菌(在葡萄藤中引起霜霉病的病原体)进行叶盘的人工感染(每ml水大约40000个孢子)。随后，在具有昼夜节律的植物室中，将叶盘在水琼脂板上于22℃孵育六天。
根据叶子的总面积与叶子的感染面积的比值，计算侵袭的程度。为了分析，使用能区分总面积(实验开始时叶盘的绿色像素点的数目)和感染面积(实验结束时白色像素点的数目)的图像评价软件。在用酶和含铜的植物保护产品处理的叶盘上，葡萄霜霉病菌的发育被有效地阻止。
实施例3
在温室植物中，蛋白裂解酶制备物的适时叶应用对葡萄霜霉病菌的感染抑制作用
用蛋白裂解酶制备物(蛋白酶III)通过固定的施用单元的手段完全地单次处理品种Vitis vinifera cv.Müller-Thurgau的幼年藤本植物。所使用的酶制备物的浓度是0.1％、0.2％和0.5％(v/v)。将喷雾混合物的pH值调整至6.5至7.5。作为对照，用含铜的植物保护产品或者用水喷洒其它盆栽的藤本植物。用蛋白酶制备物处理之后24小时，用葡萄霜霉病菌(在葡萄藤中引起霜霉病的病原体)进行叶子的人工感染。随后，将植物在20℃的温室中培养一周。通过视觉观察测定侵袭，并且表述为分别在叶和茎上病死和坏死的变化相对于各重复的植物的总重量的比例(％)，并进行照相记录。使用等级为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、90％、100％病死变化的评分尺。
在用蛋白酶III和含铜的植物保护产品处理的植物上，葡萄霜霉病菌的发育和扩散被有效地阻止，而用水喷洒的叶子显示高度侵袭(图2)。
实施例4
在试验田中，蛋白裂解酶制备物的定期施用对葡萄霜霉病菌的感染抑制作用
在种植季节期间，间隔8至14天，用酶裂解的酶制备物(Prot III)通过隧道式循环喷雾机的手段重复地喷洒Vitis vinifera cv.Blauer 
品种的整个葡萄藤，使得葡萄藤的表面被均匀地润湿。使用的酶制备物的浓度是0.1％(v/v)。将喷雾混合物的pH值调整在6.5至7.5之间。为了改善叶子的润湿，还添加了润湿剂(TREND 90)。
在生长季节结束时，评分叶子和葡萄上被霜霉菌侵袭的程度和侵袭频率。在开阔地的葡萄藤上，葡萄霜霉病菌的发育被有效地阻止。
实施例5
在番茄植物中，蛋白裂解酶制备物对引起晚疫病的病原体(马铃薯晚疫病菌)的感
染抑制作用
在4叶期，用蛋白酶制备物(蛋白酶III，0.1％(v/v))喷洒番茄品种红鸟(Redrobin)。将喷雾混合物的pH值调整在6.5至7.5。作为另外的变型，向蛋白酶溶液添加浓度为0.02％(v/v)的常用润湿剂(T/S forte,Biomaxima,Nufilm)。将商购的铜制备物Atempo和水作为内在对照。按照变型，一个植株制备5个重复。
施用酶之后24小时，以每ml 80 000个孢子的孢子囊浓度进行马铃薯晚疫病菌病原体的人工接种。对于每个植株，应用6ml悬液。将植株放置在约16℃和100％相对湿度、无光照的培养箱中。24小时之后，设置16:8小时的光照节律，并且关上加湿器。在感染之后6天进行评分。通过视觉观察测定侵袭，并且表述为叶和茎上病死和坏死的变化相对于植物的总重量的比例(％)，并进行照相记录(表3)。
表3：马铃薯晚疫病菌的侵袭以及蛋白酶制备物的功效
实施例6
在黄瓜植物中，蛋白裂解酶制备物对古巴假霜霉菌的感染抑制作用
黄瓜植株在植物恒温恒湿箱中生长。为了证明蛋白酶的保护作用，用大约6ml的蛋白酶制备物(Prot III)喷洒叶的底侧，所述蛋白酶制备物是浓度为0.1％的水溶液。将喷雾混合物的pH值调整在6.5至7.5。将常用的铜制备物(Cuprozin Progress)和水作为对照。每一变型，一个植株制备6个重复。应用酶之后一天，用古巴假霜霉菌感染试验植株(每ml 75000个孢子)。在相对湿度大于95％的温室中，在室温下进行培育。在前48小时期间，将植物暗培养，然后，将植物维持在16/8小时的昼夜节律下。在感染之后10天进行评分。由此，测定植株的侵袭比例。通过使用制备物Prot III可以将侵袭降低至小于4％(表4)。
表4
实施例7
在黄瓜植株中，不同的蛋白酶制备物对古巴假霜霉菌的感染抑制作用的比较
黄瓜植株在恒温恒湿箱中生长。为了比较不同的蛋白酶制备物的功效，用大约6ml的各种蛋白酶制备物(Prot III-Prot IX)喷洒叶的底侧，所述各种蛋白酶制备物是浓度为0.1％的水溶液。将喷雾混合物的pH值调整在6.5至7.5。将常用的铜制备物(CuprozinProgress)和水作为对照。每一变型，一个植株制备6个重复。施用酶之后一天，用古巴假霜霉菌感染试验植株。在相对湿度大于95％的温室中，在室温下进行培育。在前48小时期间，将植株暗培养，然后，将植株维持在16/8小时的昼夜节律下。在感染之后10天进行评分。由此，测定植株的侵袭比例。各制备物的功效呈现在表5中。具有最好效果的制备物是蛋白酶III。蛋白酶IV、VIII和IX具有类似的效果。据已知，陈述了各自的蛋白酶源自的生物体。
表5：用于实验中的蛋白酶制备物的概述以及侵袭和各自的功效
保护农作物植株免受由细菌引起的感染
实施例8
蛋白酶对番茄溃疡病菌的生长抑制作用的接种实验
使番茄溃疡病菌的培养物生长至对数期后期并且相应地在10nM NaCl溶液中稀释至OD600nm＝1.0。将该起始培养物以10-1至10-12的12种稀释物在各营养琼脂上接种，所述各营养琼脂含有浓度为0.01-1％的蛋白酶III制备物。两个对照板不含蛋白酶III，并且在给定条件下显示番茄溃疡病菌的最大生长(图3，左：10-5)。在0.05％的蛋白酶浓度下，细菌的生长开始被有效地抑制，因为只生长最浓的稀释物(10-1至10-3，参见图3)。蛋白酶III作为控制番茄中的细菌性萎蔫病(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)的植物保护手段的高潜能通过该实验变得显而易见。
实施例9
保护番茄植株免受由丁香假单胞菌引起的感染
对于该实验，用含有以及不含添加的粘合剂(NufilmP)的0.1％蛋白酶溶液(蛋白酶III)喷洒“红鸟”品种的番茄植株，并且于22℃孵育24小时。将喷雾混合物的pH值调整在6.5至7.5。作为对照，分别用自来水和模拟溶液喷洒各4株植株。施用酶之后24小时，用丁香假单胞菌感染植株。
接种之后两个小时取0.7cm2大的叶块的首个样本，在接种之后第7天、第14天和第21天取其它的样本。为了分析，从4株不同植株中的每一株取4片不同的单一叶子，以及从这四片不同的单一叶子中的每一片取4块叶块，用于分析。起初，每叶块的克隆形成单位(CFU)数是1x 103。在对照(水)中，CFU数在三周内增加至每叶块1x 106个CFU。用蛋白酶III处理的植株在前两周内保持恒定的水平(每叶块103个CFU)。在三周之后，用蛋白酶处理的叶上的每叶的CFU数显著地减少至每叶块10个CFU(图4)。所使用的蛋白酶比模拟物质显著地更有效。
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·DE 10 2205 048 520Biopract GmbH,Berlin GmbH,Institut für Gemüse-undZierpflanzenbau Groβbeeren/Erfurt.Verfahren zurProphylaxe und Therapie vonMykosen bei Nutz-und Zierpflanzen sowie bei 
insbesondere inhydroponischen Systemen,07.10.2007
附图图示
图1：用水(A)、含铜的植物保护产品(B)、蛋白酶I(C)、蛋白酶II(D)或蛋白酶III(E)处理叶盘。
图2：Prot III在盆栽的Müller-Thurgau葡萄藤上的功效测试。显示相比于内标水对照和铜参照溶液，在处理的变型蛋白酶III 0.01％至0.5％下，葡萄霜霉病菌侵袭的程度。通过使用Prot III，侵袭的程度被有效降低。在单片叶上，通过喷洒阴影，引起用0.5％Prot III处理的植株的侵袭增加(*)。每一变型，基于6株单独的多至6片叶的植株的成比例侵袭，计算侵袭的程度。
图3：蛋白酶III对番茄溃疡病菌的生长的抑制作用的陈述。显示了细菌培养物的稀释系列与不同浓度的蛋白酶III。琼脂板下面的数值表示细菌生长的稀释度。
图4：在接种之后21天内番茄叶块中丁香假单胞菌细菌的增殖。番茄植株是模拟处理的(空白)，以及分别用蛋白酶III或含Nufilm-P的蛋白酶III处理。在48小时的孵育之后，从0.7cm2叶块分出克隆形成单位(CFU)并进行计算。
Claims (7)
1.用于抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，用细菌丝氨酸蛋白酶作为唯一活性成分的水溶液喷洒所述植物，其中所述细菌丝氨酸蛋白酶来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)或拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.)，所述感染由卵菌或细菌引起，其中所述卵菌是葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)、马铃薯晚疫病菌(Phytophtorainfestans)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)，并且所述细菌是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)或番茄溃疡病菌(Clavibacter michinganensis)。
2.如权利要求1所述的用于抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，所述水溶液包含细菌丝氨酸蛋白酶的组合作为唯一活性成分。
3.如权利要求1所述的抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，用于控制病原体的细菌丝氨酸蛋白酶的所述水溶液以0.001％至1％的剂量施用。
4.如权利要求1所述的抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，通过喷洒所述植物的气生部分对所述植物进行时间间隔的处理。
5.如权利要求1所述的抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，在4.0至8.0的pH下施用细菌丝氨酸蛋白酶的所述水溶液。
6.如权利要求1所述的抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，在4℃至34℃的温度下施用细菌丝氨酸蛋白酶的所述水溶液。
7.如权利要求1所述的抑制农作物和观赏植物中的感染的方法，其特征在于，用粘合剂和润湿剂以及稳定剂配制细菌丝氨酸蛋白酶的所述水溶液。
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