CN112430610B

CN112430610B - 低温酯酶功能基因DcaE及其应用

Info

Publication number: CN112430610B
Application number: CN202011126497.3A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 周正富; 陆伟; 张亚格; 陈明; 张维
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112430610A

Abstract

本发明发现了一种具有低温酯酶功能的基因DcaE。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，低温下能催化酯类底物进行酯键水解反应，应用于各种酯类的降解。

Description

低温酯酶功能基因DcaE及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种具有酯酶功能的基因。

背景技术

低温活性酯酶与中温酶和嗜热酶相比，在低温下具有更高的催化活性。该类酯酶不仅能在低温环境有效地提高工业生产效率，而且能以最小的能耗节约能源，因此低温酯酶在工业应用的各个方面都具有重要商业价值。

在微生物酯酶的活力测定中，目前本领域公认的通用模式底物为对硝基苯酯类化合物。如对硝基苯酚乙酸酯pNPA,对硝基苯酚丁酸脂pNPB,对硝基苯酚辛酸酯pNPC，对硝基苯酚月桂酸酯pNPL对硝基苯酚棕榈酸酯pNPP等。

在酯类的模式底物硝基苯酯类化合物中加入一种蛋白，通过测定生成的水解产物对硝基苯酚(pNP)含量来确定酯酶的酶活。如果对该模式底物有水解功能，则该蛋白被认为具有酯酶功能。

发明内容

本发明的目的是找到一种在生物催化中用于酯类化合物的降解反应的低温酯酶基因。

为了寻找适用于工业生产的酯酶，本发明筛选了基因DcaE(Deinococcus cold-adapted Esterase)，构建重组载体，进行表达纯化，首次发现DcaE基因可用于低温下酯类化合物的生物降解。具体研究工作如下：

1、获得含有DcaE基因的重组工程菌株

1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出DcaE基因，基因大小为939bp(序列见SEQ ID NO.1)，该基因编码312个氨基酸(序列见SEQ ID NO.2)，将其克隆于载体pET-32a上，该质粒含有能在大肠杆菌中都起作用的T7启动子，构建了含有T7启动子的完整DcaE基因的重组质粒pET32a-DcaE；

2)将导入DcaE基因的重组质粒pET32a-DcaE转入受体大肠杆菌BL21中，获得工程菌株BL21-pET32a-DcaE(详见实施例1)；

2、由基因DcaE编码的蛋白DcaE在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

实验证实，DcaE基因在大肠杆菌中能够大量可溶性表达，并且通过镍柱亲和层析纯化到了纯品蛋白

3、蛋白DcaE降解对硝基苯酯类底物的检测实验

本发明采用了检测酯酶功能基因的通用公认模式底物对硝基苯酯类化合物，通过比色法测定了对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定了酯酶DcaE的活力。

测定的酯类底物是：

对硝基苯酚乙酸酯pNPA(C2)

对硝基苯酚丁酸脂pNPB(C4)

对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8)

对硝基苯酚月桂酸酯pNPL(C12)。

实验结果表明，耐辐射异常球菌DcaE基因编码的DcaE蛋白能够降解上述对硝基苯酯类底物的酯键从而生成对硝基苯酚。

其中，对pNPC8的降解最佳，酶活可达32.14U/mg(见图2)。

上述实验证实，耐辐射异常球菌DcaE基因编码的蛋白DcaE能够降解酯类底物，具有酯酶功能。

4、DcaE蛋白在低温条件下(10℃至40℃之间)具有较高的稳定性和活性。详见实施例。

序列表信息

SEQ ID NO.1：基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2：DcaE的氨基酸序列。

附图说明：

图1蛋白DcaE纯化胶图。

图2蛋白DcaE降解不同底物的相对酶活。

图3蛋白DcaE酶活的低温稳定性。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

表达质粒pET32a：为德国默克公司市售产品；

大肠杆菌BL21：为北京诺唯赞公司市售产品。

实施例1构建表达耐辐射异常球菌DcaE基因的重组大肠杆菌工程菌株

一、实验方法

1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的DcaE基因序列设计1对PCR特异性引物：

DcaE-F：5′CCATGGCTGATATCGGATCCATGCCCGTAGACCCCAACCT 3′

DcaE-R：5′CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGCCGCGCAGTTGCTCG 3′

2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

PCR反应程序：

3.PCR产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过BamhⅠ/HindIII双酶切获得的含有粘性末端的pET-32a载体上，构建大肠杆菌表达载体pET32a-DcaE。

4.将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-pET32a-DcaE。含有pET32a对照空质粒的E.coli BL21命名为BL21-pET32a。

二、实验结果

成功构建了表达DcaE的重组大肠杆菌工程菌株。

实施例2含耐辐射异常球菌DcaE基因重组工程菌株的酯酶活性实验

实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的含有DcaE基因的BL21-pET32a-DcaE菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的BL21-pET32a菌株。

一、实验方法

1、酯酶蛋白DcaE的诱导表达

(1)以1％的接种量将菌种接种到20mL加了抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；

(2)第二天以OD₆₀₀为0.1的初始浓度的接种量将菌液转接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8；

(3)加入IPTG(终浓度0.1μmol/L)进行蛋白诱导表达，诱导条件为25℃，6～8h；

2、亲和层析纯化重组酯酶蛋白DcaE

(1)诱导后的菌液离心，经5000rpm 10min收集菌体，用NTA-0重新悬浮菌体；

(2)菌液超声破碎：将含有悬浮菌体的离心管置于冰水混合物的烧杯中，置于超声破碎仪超声5～10min，超声仪设定程序为：超声3s停5s，功率＜400W；

(3)超声破碎后的样品13000rm离心30min，用离心管分别收集破碎液上清和沉淀，离心得到的破碎上清液即为粗酶液。

(4)取出镍柱，待乙醇流完后首先用去离子水清洗镍柱两遍，然后用NTA-0平衡柱子，流速保持在1mL/min；粗酶液挂柱，穿透两次，流速同上；

(5)用配置好的NTA-10，NTA-30，NTA-50，NTA-80，NTA-100，NTA-150，NTA-200，NTA-250，NTA-300梯度洗脱，使用蛋白检测液检测蛋白，收集洗脱峰；用浓度为20％的乙醇溶液清洗镍柱，清洗后将镍柱保存在4℃冰箱；使用超滤离心置换蛋白溶液的缓冲液，从而去除蛋白溶液中的咪唑，所得的蛋白溶液即为酶液(酯酶蛋白DcaE)。

3、酯酶蛋白DcaE活力测定

采用酯酶活力测定通用的比色法和通用模式底物对硝基苯酯类化合物进行。

检测原理是，通过水解对硝基苯酯类化合物底物生成对硝基苯酚(pNP)，pNP呈黄色并且在410nm处有吸收峰，通过检测产物pNP的含量来确定酯酶的酶活。

1个酶活单位(U)定义为：单位时间内释放1μmol的产物pNP所需要的酶量。

对硝基苯酚(pNP)标准曲线制作方法：称量pNP 0.1391g，溶于50mL异丙醇中制备pNP母液(20mM)，取其中10mL pNP母液，用异丙醇定容至100mL，得到pNP工作液(2.0mM)。按表1各种试剂的添加量和操作步骤添加8组样品(标准曲线的体积和反应条件均与实际测定样品酶活反应条件一致)。

酶活测定试剂：

(1)底物溶液：分别将0.3％对硝基苯酚乙酸酯pNPA(C2),对硝基苯酚丁酸脂pNPB(C4),对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8),对硝基苯酚月桂酸酯pNPL(C12)溶于异丙醇中，4℃保存。

(2)缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5,0.11％***胶)。

(3)底物测试液：底物溶液分别与缓冲液按1:3的比例混匀后作为底物测试液使用。

酶活测定：

1.5mL离心管中加入600μL底物测试液，并加入适当稀释后的酶液25μL；对照组加入25μL pH＝8的Tris-HCl缓冲液；

30℃下保温5min后，加入500μL 95％的乙醇终止反应。在410nm下测定吸光值，计算酶活。

表1 pNP标准曲线

说明：在上述实验中：

a、IPTG是诱导重组菌株表达DcaE蛋白的诱导物，并非催化反应的底物；

b、DcaE蛋白(33kDa)表达形式为融合蛋白，融合了pET-32a载体的一段水溶性蛋白(20kDa)，融合蛋白总分子量约为53kDa(图1)。

4、温度对酶活性的影响及酶的热稳定性

酶液加入pH 8的Tris-HCl缓冲液中，分别在不同温度(5，10，20，30，40，50，60，70℃)下测定脂肪酶/酯酶的降解活力，反应5min，确定脂肪酶的最适温度。进一步研究脂肪酶/酯酶的热稳定性：将纯化后的酶液分别于5，10，20，30，40，50℃下保温6h，每隔1h在最适温度下测定剩余酶活力，以最高酶活力为100％计算相对酶活。

三、实验结果和结论

对硝基苯酯类化合物是检测酯酶功能基因的通用模式底物，通过比色法可以测定对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定酯酶的活力。

耐辐射异常球菌DcaE基因编码的DcaE蛋白能够降解对硝基苯酯类底物(pNPC2、pNPC4、pNPC8、pNPC12)的酯键从而生成对硝基苯酚，其中对pNPC8的降解最佳(图2)，酶活可达32.14U/mg。

DcaE蛋白在10℃至40℃之间表现出较高的稳定性，在孵育1h后保留了80％以上的初始活性，在40℃孵育6h后仍有66.32％的剩余活性。然而，在50℃孵育1h后，DcaE的剩余活性急剧下降至约56.31％(图3)。

酯类物质广泛存在于自然界中，而酯酶在降解天然物质、有毒物质以及手性药物拆分等方面具有重大作用，例如酯酶能够改善奶制品风味、降解菊酯类农药、生产如布洛芬的抗炎药物等。因此，DcaE作为一种新型酯酶，在洗涤剂、食品加工、化妆品、制药等工业化生产和酯类农药降解的环境修复等方面具有重要的应用潜力。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 低温酯酶功能基因DcaE及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 1

atgcccgtag accccaacct gtaccaactt ctgctgcaac tctcgcaggc gcctgaaccc 60

gccggactgg aagaactgcg ggcgggcgtg atcgccaacg cggcgcgcag ccccaaacgt 120

ccggtgacta ttggcgaagt ccgtgacctg agcgtggcgg gcgcggaggg ctccctgccc 180

gcccgcctgt accaccccgc cgggcaggcc cccgcgtccg gctggccgct gacggtgttc 240

ttccacggtg gcggcttcgt ggtctacgac ctcgacaccc acgacgcgct gtgccgcgag 300

ctgtgcgcga cgtcgggcgc ggcggtgctg agcgtggcct accgcctcgc gcccgaagcc 360

cgctttcccg cgccggtaga cgacgccctg gcgagtgtgg tctgggccgc cgcgcacgcc 420

gccgaactcg gcgcagacgc ggggcgactc gcggtggcgg gcgacagcgc gggggccaac 480

ctcgccaccg tcacggcgct gcggtcgcgt gacgagggcg gcccggcttt gcgggcgcag 540

cttctcattt accccgccgc cgatttcgag caccccgaac gctaccccag ccgccaggaa 600

aacggacgcg gctatttcct cactgacgag cggatgcgct ttttcggaca gatgtacctt 660

gctcgcccgg aagacgccgc gcatccccac gcctcgccgc tcaacgctga gagtctcgcg 720

gggttgccgc cggccctggt cctgaccgcc gaattcgacc ccctgcgcga tgaaggcgcc 780

gcttacgccg aagctctcaa ggccgctggc gtaagcgccg agtaccgccc cggccccggc 840

atgattcacg gttacgccaa catgaccgcg ttttcgcccg tcgccgcaca actgattgac 900

gaggcgggcg tatggctcgg cgagcaactg cgcggctga 939

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 2

Met Pro Val Asp Pro Asn Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gln

1 5 10 15

Ala Pro Glu Pro Ala Gly Leu Glu Glu Leu Arg Ala Gly Val Ile Ala

20 25 30

Asn Ala Ala Arg Ser Pro Lys Arg Pro Val Thr Ile Gly Glu Val Arg

35 40 45

Asp Leu Ser Val Ala Gly Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ala Arg Leu Tyr

50 55 60

His Pro Ala Gly Gln Ala Pro Ala Ser Gly Trp Pro Leu Thr Val Phe

65 70 75 80

Phe His Gly Gly Gly Phe Val Val Tyr Asp Leu Asp Thr His Asp Ala

85 90 95

Leu Cys Arg Glu Leu Cys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Val

100 105 110

Ala Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Ala Arg Phe Pro Ala Pro Val Asp Asp

115 120 125

Ala Leu Ala Ser Val Val Trp Ala Ala Ala His Ala Ala Glu Leu Gly

130 135 140

Ala Asp Ala Gly Arg Leu Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Ala Asn

145 150 155 160

Leu Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg Ser Arg Asp Glu Gly Gly Pro Ala

165 170 175

Leu Arg Ala Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ala Ala Asp Phe Glu His Pro

180 185 190

Glu Arg Tyr Pro Ser Arg Gln Glu Asn Gly Arg Gly Tyr Phe Leu Thr

195 200 205

Asp Glu Arg MET Arg Phe Phe Gly Gln MET Tyr Leu Ala Arg Pro Glu

210 215 220

Asp Ala Ala His Pro His Ala Ser Pro Leu Asn Ala Glu Ser Leu Ala

225 230 235 240

Gly Leu Pro Pro Ala Leu Val Leu Thr Ala Glu Phe Asp Pro Leu Arg

245 250 255

Asp Glu Gly Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Val Ser

260 265 270

Ala Glu Tyr Arg Pro Gly Pro Gly MET Ile His Gly Tyr Ala Asn MET

275 280 285

Thr Ala Phe Ser Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Asp Glu Ala Gly Val

290 295 300

Trp Leu Gly Glu Gln Leu Arg Gly

305 310

Claims

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因在酯类化合物的降解反应中的应用，所述降解反应是利用酯类底物进行的酯键水解反应，并在低温下进行。