CN110438176A - 具有酯酶功能的基因estDR4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中发现了一种具有酯酶功能的基因estDR4。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，能催化酯类底物进行酯键水解反应。所述基因可应用于洗涤剂、食品、油脂加工、化妆品、制药等工业化生产和农药降解的环境修复的酯类降解中。

Description

具有酯酶功能的基因estDR4及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种具有酯酶功能的基因。
背景技术
酯酶(EC3.1.1.1,Esterase,carboxylic ester hydrolase)属于α/β水解酶家族中的一种。酯酶特性是，在水相中识别羧酸和醇之间的酯键，并且使之水解；在非水相或有机相中，能催化逆反应，通过酯化反应或转酯反应形成酯键。酯类水解酶被广泛应用于洗涤剂、食品、油脂加工、化妆品和药品等工业化生产。
耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)是一种抗逆模式菌株。1999年完成了耐辐射异常球菌的全基因组测序与基因注释，其基因组全长约3.28Mbp，包含两条染色体，长度分别为2,648,638bp和412,348bp，以及一个长度为177,466bp的大质粒和长度为45,704bp的小质粒。整个基因组的G+C％含量约为66.6％，共包含3,187个开放阅读框架(ORF)，其中次生代谢产物合成基因占整个基因组的3％。
目前发现耐辐射异常球菌的主要功能，除了具有超强电离辐射抗性，UV辐射抗性外，还具有抗氧化，抗干燥，耐高低温等特性。但鲜有发现其具有酯酶功能。
在微生物酯酶的活力测定中，目前本领域公认的通用模式底物为对硝基苯酯类化合物。如对硝基苯酚乙酸酯pNPA,对硝基苯酚丁酸脂pNPB,对硝基苯酚辛酸酯pNPC，对硝基苯酚月桂酸酯pNPL对硝基苯酚棕榈酸酯pNPP等。
在酯类的模式底物硝基苯酯类化合物中加入一种蛋白，通过测定生成的水解产物对硝基苯酚(pNP)含量来确定酯酶的酶活。如果对该模式底物有水解功能，则该蛋白被认为具有酯酶功能。
发明内容
本发明的目的是从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中发现一种用于酯类底物降解的酯酶基因。
本发明为了寻找适用于工业生产的酯酶，从耐辐射异常球菌的基因组中筛选了基因estDR4，构建重组载体，进行表达纯化，首次发现耐辐射异常球菌estDR4基因可用于酯类化合物的生物降解。具体研究工作如下：
1、获得含有estDR4基因的重组工程菌株
1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出estDR4基因，基因大小为939bp(序列见SEQ ID NO.1)，该基因编码312个氨基酸(序列见SEQ ID NO.2)，将其克隆于载体pET-32a上，该质粒含有能在大肠杆菌中都起作用的T7启动子，构建了含有T7启动子的完整estDR4基因的重组质粒pET32a-estDR4；
2)将导入estDR4基因的重组质粒pET32a-estDR4转入受体大肠杆菌BL21中，获得工程菌株BL21-pET32a-estDR4(详见实施例1)；
2、由基因estDR4编码的蛋白EstDR4在大肠杆菌中的诱导表达与纯化
实验证实，estDR4基因在大肠杆菌中能够大量可溶性表达，并且通过镍柱亲和层析纯化到了纯品蛋白
3、蛋白EstDR4降解对硝基苯酯类底物的检测实验
本发明采用了检测酯酶功能基因的通用公认模式底物对硝基苯酯类化合物，通过比色法测定了对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定了酯酶EstDR4的活力。
测定的酯类底物是：
对硝基苯酚乙酸酯pNPA(C2)
对硝基苯酚丁酸脂pNPB(C4)
对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8)
对硝基苯酚月桂酸酯pNPL(C12)。
实验结果表明，耐辐射异常球菌estDR4基因编码的EstDR4蛋白能够降解上述对硝基苯酯类底物的酯键从而生成对硝基苯酚。
其中，对pNPC8的降解最佳，酶活可达32.14U/mg(见图2)。
上述实验证实，耐辐射异常球菌estDR4基因编码的蛋白EstDR4能够降解酯类底物，具有酯酶功能。
序列表信息
SEQ ID NO.1：estDR4基因的DNA序列。
SEQ ID NO.2：estDR4的氨基酸序列。
附图说明：
图1蛋白EstDR4纯化胶图。
图2蛋白EstDR4降解不同底物的相对酶活。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
表达质粒pET32a：为德国默克公司市售产品；
大肠杆菌BL21：为北京诺唯赞公司市售产品。
实施例1构建表达耐辐射异常球菌estDR4基因的重组大肠杆菌工程菌株
一、实验方法
1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的estDR4基因序列设计1对PCR特异性引物：
DR4-F：5′CCATGGCTGATATCGGATCCATGCCCGTAGACCCCAACCT 3′
DR4-R：5′CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGCCGCGCAGTTGCTCG 3′
2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。
PCR反应程序：
3.PCR产物经胶回收后，通过重组酶连接于经过BamhⅠ/HindⅠ双酶切获得的含有粘性末端的pET-32a载体上，构建大肠杆菌表达载体pET32a-estDR4。
4.将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-pET32a-estDR4。含有pET32a对照空质粒的E.coli BL21命名为BL21-pET32a。
二、实验结果
成功构建了表达estDR4的重组大肠杆菌工程菌株。
实施例2含耐辐射异常球菌estDR4基因重组工程菌株的酯酶活性实验
一、实验材料
重组工程菌株：实施例1得到的含有estDR4基因的BL21-pET32a-setDR4菌株
对照菌株：实施例1所述含空质粒的BL21-pET32a菌株。
酯酶蛋白EstDR4按以下步骤制备：
1、重组菌的诱导表达及超声破碎
(1)以1％的接种量将菌种接种到20mL加了抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；
(2)第二天以OD600为0.1的初始浓度的接种量将菌液转接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8；
(3)加入IPTG(终浓度0.1μmol/L)进行蛋白诱导表达，诱导条件为25℃，6～8h；
(4)诱导后的菌液离心，经5000rpm 10min收集菌体，用NTA-0重新悬浮菌体；
(5)菌液超声破碎：将含有悬浮菌体的离心管置于冰水混合物的烧杯中，置于超声破碎仪超声5～10min，超声仪设定程序为：超声3s停5s，功率＜400W；
(6)超声破碎后的样品13000rm离心30min，用离心管分别收集破碎液上清和沉淀，离心得到的破碎上清液即为粗酶液，破碎样品用于后续实验。
2、亲和层析纯化重组酯酶蛋白EstDR4
目的蛋白的纯化按如下步骤进行：
(1)取出镍柱，待乙醇流完后首先用去离子水清洗镍柱两遍，然后用NTA-0平衡柱子，流速保持在1mL/min；
(2)粗酶液挂柱，穿透两次，流速同上；
(3)用配置好的NTA-10，NTA-30，NTA-50，NTA-80，NTA-100，NTA-150，NTA-200，NTA-250，NTA-300梯度洗脱，使用蛋白检测液检测蛋白，收集洗脱峰；
(4)用浓度为20％的乙醇溶液清洗镍柱，清洗后将镍柱保存在4℃冰箱；
(5)用SDS-PAGE检测所得蛋白大小与纯度；
(6)使用超滤离心置换蛋白溶液的缓冲液，从而去除蛋白溶液中的咪唑，所得的蛋白溶液即为酶液(酯酶蛋白EstDR4)。
二、酯酶蛋白EstDR4活力测定
1、实验方法
采用酯酶活力测定通用的比色法和通用模式底物对硝基苯酯类化合物进行。
检测原理是，通过水解对硝基苯酯类化合物底物生成对硝基苯酚(pNP)，pNP呈黄色并且在410nm处有吸收峰，通过检测产物pNP的含量来确定酯酶的酶活。
1个酶活单位(U)定义为：单位时间内释放1μmol的产物pNP所需要的酶量。
对硝基苯酚(pNP)标准曲线制作方法：称量pNP 0.1391g，溶于50mL异丙醇中制备pNP母液(20mM)，取其中10mL pNP母液，用异丙醇定容至100mL，得到pNP工作液(2.0mM)。按表1各种试剂的添加量和操作步骤添加8组样品(标准曲线的体积和反应条件均与实际测定样品酶活反应条件一致)。
2、酶活测定试剂：
(1)底物溶液：分别将0.3％对硝基苯酚乙酸酯pNPA(C2),对硝基苯酚丁酸脂pNPB(C4),对硝基苯酚辛酸酯pNPC(C8),对硝基苯酚月桂酸酯pNPL(C12)溶于异丙醇中，4℃保存。
(2)缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5,0.11％***胶)。
(3)底物测试液：底物溶液分别与缓冲液按1:3的比例混匀后作为底物测试液使用。
3、酶活测定：
1.5mL离心管中加入600μL底物测试液，并加入适当稀释后的酶液25μL；对照组加入25μL pH＝8的Tris-HCl缓冲液；
30℃下保温5min后，加入500μL 95％的乙醇终止反应。在410nm下测定吸光值，计算酶活。
表1 pNP标准曲线
说明：在上述实验中：
1、IPTG是诱导重组菌株表达EstDR4蛋白的诱导物，并非催化反应的底物；
2、EstDR4蛋白(33kDa)表达形式为融合蛋白，融合了pET-32a载体的一段水溶性蛋白(20kDa)，融合蛋白总分子量约为53kDa(图1)。
三、实验结果和结论
对硝基苯酯类化合物是检测酯酶功能基因的通用模式底物，通过比色法可以测定对硝基苯酯类化合物分解后生成对硝基苯酚的量，鉴定酯酶的活力。
耐辐射异常球菌estDR4基因编码的EstDR4蛋白能够降解对硝基苯酯类底物(pNPC2、pNPC4、pNPC8、pNPC12)的酯键从而生成对硝基苯酚，其中对pNPC8的降解最佳(图2)，酶活可达32.14U/mg。
酯类物质广泛存在于自然界中，而酯酶在降解天然物质、有毒物质以及手性药物拆分等方面具有重大作用，例如酯酶能够改善奶制品风味、降解菊酯类农药、生产如布洛芬的抗炎药物等。因此，EstDR4作为一种新型酯酶，在洗涤剂、食品加工、化妆品、制药等工业化生产和酯类农药降解的环境修复等方面具有重要的应用潜力。

Claims (6)

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因在微生物催化酯类降解中的应用。
2.权利要求1所述的应用，是作为酯酶，在生物催化中用于酯类化合物的降解反应。
3.权利要求2所述的应用，所述酯类化合物降解反应是利用酯类底物进行的酯键水解反应。
4.权利要求1所述的应用，所述微生物是原核生物。
5.权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。
6.权利要求5所述的氨基酸序列所示的蛋白在微生物催化酯类降解中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112430610A (zh) * 2020-10-20 2021-03-02 中国农业科学院生物技术研究所 低温酯酶功能基因DcaE及其应用
CN113215128A (zh) * 2021-04-28 2021-08-06 中国农业科学院生物技术研究所 一种提高酯酶DcaE4的活性的方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104334716A (zh) * 2011-12-23 2015-02-04 德意诺夫 具有重构转录单元的细菌及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104334716A (zh) * 2011-12-23 2015-02-04 德意诺夫 具有重构转录单元的细菌及其用途

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112430610A (zh) * 2020-10-20 2021-03-02 中国农业科学院生物技术研究所 低温酯酶功能基因DcaE及其应用
CN113215128A (zh) * 2021-04-28 2021-08-06 中国农业科学院生物技术研究所 一种提高酯酶DcaE4的活性的方法及应用
CN113215128B (zh) * 2021-04-28 2022-08-02 中国农业科学院生物技术研究所 一种提高酯酶DcaE4的活性的方法及应用
CN115058405A (zh) * 2021-04-28 2022-09-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种基于Tyr285改造提高酯酶DcaE4活性的方法及应用
CN115074341A (zh) * 2021-04-28 2022-09-20 中国农业科学院生物技术研究所 第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用
CN115094048A (zh) * 2021-04-28 2022-09-23 中国农业科学院生物技术研究所 一种突变改造第163位苏氨酸残基提高DcaE4酯酶活性的方法及应用
CN115094048B (zh) * 2021-04-28 2023-08-25 中国农业科学院生物技术研究所 一种突变改造第163位苏氨酸残基提高DcaE4酯酶活性的方法及应用
CN115058405B (zh) * 2021-04-28 2023-08-29 中国农业科学院生物技术研究所 一种基于Tyr285改造提高酯酶DcaE4活性的方法及应用
CN115074341B (zh) * 2021-04-28 2023-08-29 中国农业科学院生物技术研究所 第238位丝氨酸残基改造在提高酯酶DcaE4活性上的应用

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