CN110423787B - 一种均一性褐藻三糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种藻胶裂解酶联合降解褐藻胶的方法，是将褐藻胶裂解酶AlyV和AlyF来降解褐藻胶制备褐藻三糖；其中褐藻胶裂解酶AlyV的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的序列为SEQ ID NO:2；其中褐藻胶裂解酶AlyF的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的序列为SEQ ID NO:4。其中褐藻胶裂解酶AlyV和AlyF的摩尔比为1:10‑10:1,最优选摩尔比为1:1。本发明采用酶法制备技术，绿色环保；具有不同底物结合特异性的双酶联用，提高底物转化效率；同时双酶联用，大大提高了产物的均一性。

Description

一种均一性褐藻三糖的制备方法

技术领域

本发明属于寡糖制备技术领域，具体涉及一种均一性褐藻三糖的制备方法。

背景技术

褐藻胶是由α-L-古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)通过1,4-糖苷键，按照不同的组合方式构成的非均聚线性分子。褐藻胶裂解酶通过β-消除反应，催化单体间的1,4-糖苷键，在非还原端的C4、C5之间形成不饱和双键，该双键在235nm处有最大吸光值。在酶活测定中，主要通过OD₂₃₅紫外吸收法检测不饱和双键的产生和薄层层析法(TLC)测定降解产物的均一性。

研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有多种不同的生物学活性。而且深入研究发现褐藻寡糖的活性与其聚合度息息相关。如研究发现聚合度为5(DP5)的褐藻寡糖，其抑制骨肉瘤细胞的活性优于其它聚合度的褐藻寡糖。

目前褐藻寡糖主要是通过化学法和酶法降解褐藻胶获得。相对与化学法，酶法制备具有环境友好，底物特异性强等优势，是未来均一性褐藻寡糖制备的主要方法。因此，用于褐藻寡糖制备的褐藻胶裂解酶得到了研究人员的广泛关注。但目前所使用的褐藻胶裂解酶依然存在单一酶降解效率低，产物均一性差的问题，这限制了基于酶法的均一性褐藻寡糖制备技术的广泛应用，成为制约产业发展的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种藻胶裂解酶联合降解褐藻胶的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的藻胶裂解酶联合降解褐藻胶的方法，是将褐藻胶裂解酶AlyV和AlyF来降解褐藻胶制备褐藻三糖；

其中褐藻胶裂解酶AlyV的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的序列为SEQID NO:2；

其中褐藻胶裂解酶AlyF的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的序列为SEQID NO:4。

其中褐藻胶裂解酶AlyV和AlyF的摩尔比为1:10-10:1,最优选摩尔比为1:1。

本发明采用酶法制备技术，绿色环保；具有不同底物结合特异性的双酶联用，提高底物转化效率；同时双酶联用，大大提高了产物的均一性。

附图说明

图1：AlyV与同源蛋白序列比对图；

图2：纯化后的AlyV的SDS-PAGE检测图；

图3：纯化后的AlyF的SDS-PAGE检测结果图；

图4：各比例组AlyV和AlyF降解AL产物分布图；

图5：AlyV和AlyF的相对底物降解率图；

图6：AlyV和AlyF10:10组产物分离图。

具体实施方式

对于本发明所涉及的名词解释如下：

1、褐藻胶：褐藻胶是由α-L-古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)通过1,4-糖苷键，按照不同的组合方式构成的非均聚线性分子。

2、褐藻胶裂解酶：通过β-消除反应，催化单体间的1,4-糖苷键，在非还原端的C4、C5之间形成不饱和双键，该双键在235nm处有最大吸光值；

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：AlyV和AlyF的基因克隆

1基因克隆

1.1AlyV的基因克隆

首先对具有褐藻胶降解活性的海洋弧菌Vibrio pelagius进行基因组测序和同源蛋白序列分析，获得了AlyV的基因序列信息(其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；编码基因的序列为SEQ ID NO:2)。序列分析表明AlyV是一个未表征过的新型褐藻胶裂解酶，属于多糖裂解酶7家族(PL-7)。根据CAZy数据库，PL-7家族中已表征过的成员中，A9mT、AlxM和AlyVOA三个蛋白的序列与AlyV最相近，同源性分别为47.1％、43.4％和42.8％，氨基酸序列比对如图1所示。这三个AlyV的同源褐藻胶裂解酶都具有polyM的底物特异性，A9mT和AlyVOA来源于弧菌属，AlxM来源于发光杆菌属。

AlyV基因由弧菌Vibrio pelagius基因组扩增获得，并构建于pET-28a表达载体。

上游引物AlyV-F:5’-CGGGATCCGCAAATGCTTCAGATAAGGCTGCTC-3’，下游引物AlyV-R:5’-CCGCTCGAGTTAACGAATTACTGGCTCGCTTTCTAC-3’进行PCR扩增，反应体系和条件如表1所示。

表1：AlyV基因扩增PCR体系

PCR反应条件：94℃，30s预变性；94℃，30s变性；65℃，30s退火；72℃，60s延伸；30个循环；72℃，10min终延伸。

扩增得到的目标基因先用琼脂糖凝胶电泳检测，后用Cycle-Purekit(OMEGA)纯化，使用限制性内切酶BamH I/Xho I双酶切后连接到pET-28a载体，酶切条件30℃，20h，体系如表2所示。

表2：AlyV PCR产物双酶切体系

组份	体积
		AlyV PCR产物(79ng/μl)	20μl
10×K buffer	3μl
		BamH I	1μl
Xho I	1μl
		双蒸水	5μl

双酶切后再用Cycle-Pure Kit纯化基因片段。使用相同的酶切体系酶切pET-28a载体，琼脂糖凝胶电泳检测后Gel Extraction Kit(OMEGA)回收载体片段。基因片段和载体片段连接条件16℃，4h，体系如表3所示。

表3：AlyV基因片段连接体系

连接产物转化入E.coli BL21(DE3)感受体细胞中，经PCR鉴定后基因测序，获得阳性克隆。

1.2AlyF的基因克隆

以弧菌Vibrio.splendidus OU02基因组DNA为模板，上游引物AlyF-F:5’-CGGGATCCTGTACCACCCAAGAAAAAACAGC-3’，下游引物AlyV-R:5’-CCGCTCGAGTTACTTAGTTGTGTTCTCAAGTAC-3’进行PCR扩增，反应体系同表1，条件：94℃，3min预变性；94℃，30s变性；58℃，30s退火；72℃，2min延伸；30个循环；72℃，10min终延伸。

采用和1.1相同的方法，目标基因AlyF经过纯化、双酶切(BamH I/XhoI)、连接到pET-32a载体并测序，获得阳性克隆。其中Aly的其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；编码基因的序列为SEQ ID NO:4。

2蛋白重组表达

pET-28a-AlyV和pET-32a-AlyF的重组表达方法基本相同。

1)甘油菌的活化

按照1％的接菌量，将含有pET-28a-AlyV和pET-32a-AlyF大肠杆菌BL21(DE3)甘油菌(500μL)分别加入50mL LB(Kan⁺)和50mLLB(Amp⁺)液体培养基中，37℃振荡培养过夜(12h)即为种子液。

2)扩大培养及IPTG诱导表达

种子液按1％的接菌量(10mL)分别接入1L LB(Kan⁺)和1L LB(Amp⁺)液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值至0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃振荡培养20h。

3)收集菌体

将培养后的菌液于4℃，3000g离心30min，弃上清。pET-28a-AlyV用20mL裂解液A(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，10mM咪唑)重悬菌体，pET-32a-P-AlyF用20mL裂解液B(20mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl，10mM咪唑)重悬菌体，于5000g，4℃离心10min，弃上清，菌体于-80℃保存。

3分离纯化

3.1AlyV的分离纯化

1)菌体破碎

20mL裂解液A重悬菌体，用超声破碎仪进行菌体破碎，超声2s，间隔4s，20min。菌悬液于12000g，4℃离心30min，取上清。

2)亲和层析

菌体超声后上清与2ml Ni-NTA凝胶于4℃旋转结合1h后流出。用20倍柱体积裂解液A进行流洗，之后分别用2倍柱体积的含有100、200、500mM咪唑的缓冲液(20mM Tris-HClpH 8.0，500mM NaCl)洗脱。SDS-PAGE检测各洗脱组份的蛋白含量。

3)透析

将目标蛋白纯度和浓度较高的洗脱组份透析至20mM Tris-HCl pH8.0，500mMNaCl缓冲液中2h，完成AlyV的纯化。

4)蛋白浓度测定

以20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl缓冲液为空白对照，测定酶液的OD₂₈₀值。通过https://web.expasy.org/protparam/网站预测AlyV蛋白的消光系数(Abs)；然后计算其蛋白浓度。

蛋白浓度的计算公式为：A(吸光值)＝ε(消光系数)×cm(光程)×M(蛋白浓度)。

纯化后的AlyV的SDS-PAGE检测结果如图2所示。

根据蛋白浓度测定结果表明，AlyV和AlyF的发酵效率分别为72mg/ml和57mg/ml。

3.2AlyF的分离纯化

1)菌体破碎

20mL裂解液B重悬菌体，用超声破碎仪进行菌体破碎，超声2s，间隔4s，20min。菌悬液于12000g，4℃离心30min，取上清。

2)亲和层析

方法同3.1(1)，所有缓冲液pH值改为7.5。

3)透析酶切

将目标蛋白纯度和浓度较高的洗脱组份透析至20mM Tris-HCl pH7.5，500mMNaCl缓冲液中，并按质量比100:1加入蛋白酶进行透析酶切。2h后SDS-PAGE检测融合蛋白酶切完全后，混合酶液再次流过Ni-NTA凝胶，除去Trx标签，SDS-PAGE检测，完成AlyF的纯化。

4)蛋白浓度测定

方法同3.1(4)。

纯化后的AlyF的SDS-PAGE检测结果如图3所示。

实施例2：联合降解褐藻胶

1、酶活协同研究

本实施例的反应条件如下：

底物为2mg/ml AL，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH 8.0)、500mM NaCl，30℃反应1h。

AlyV和AlyF分别具有polyM和polyG特异的褐藻胶裂解酶活性，但当二者单独作用时，均无法将褐藻胶(AL)完全裂解成褐藻寡糖，但使用AlyV和AlyF联合反应可以将AL完全降解，如图4所示，图中“10:0”泳道和“0:10”泳道分别为AlyV和AlyF单独降解AL。

设置“AlyV+AlyF”组终浓度为10nM AlyV+10nM AlyF，“AlyV”组终浓度为20nMAlyV，“AlyF”组终浓度为20nM AlyF。

以“AlyV+AlyF”组的ΔOD₂₃₅值为100％，通过计算“AlyV”组和“AlyF”组的ΔOD₂₃₅值与其的比例，得到AlyV和AlyF单独降解AL的相对底物降解率。结果如图5所示，AlyV和AlyF的相对底物降解率分别为72％和37％，相比于AlyV+AlyF联合使用效率明显降低；充分说明双酶联用大大提高了底物的利用效率。

2、确定AlyV和AlyF的最优比例

底物为2mg/ml AL时，使用表4中各比例组(摩尔比)进行降解反应，缓冲液为20mMTris-HCl(pH 8.0)、500mM NaCl，4μL不同比例混合酶溶液(AlyV和AlyF酶浓度均为2μM)，30℃反应1h，终产物TLC检测(Merck Silica gel 60F254)，展开剂正丁醇：甲酸：水＝4：6：1(v:v:v)，显色剂中含有二苯胺2g、苯胺2ml、丙酮100ml、磷酸10ml、浓盐酸1ml，酒精灯加热显色。

综合比较各组反应的初速度和产物分布，确定AlyV和AlyF降解AL的最优比例。各组产物TLC检测结果如图6所示。

结果表明，AlyV和AlyF联合降解AL时，AlyV:AlyF＝10:5、10:10组底物降解较为彻底，产物中三糖比例较高(图6)，其中AlyV:AlyF＝10:10组的反应速度最高(表4)，因此AlyV和AlyF降解AL时最优摩尔比为1:1。

表4：AlyV:AlyF各比例组反应初速度

AlyV:AlyF	V(OD<sub>235</sub>/min)
		10:0	0.0925±0.0008
10:1	0.0845±0.0018
		10:2	0.0955±0.0010
10:5	0.1151±0.0010
		10:10	0.1256±0.0018
5:10	0.0829±0.0004
		2:10	0.0532±0.0008
1:10	0.0418±0.0003
		0:10	0.0338±0.0005

使用Superdex Peptide 10/30GL对10:10组的产物进行分离，流动相0.2mMNH₄HCO₃，流速0.3ml/min，UV235响应信号和各组份TLC检测结果如图6所示，通过计算各组分的峰面积定量不同聚合度产物所占比例，结果如表5所示。

表5：AlyV和AlyF按10:10组产物各组分含量表

组份	含量(％)
		DP4	7.1
DP3	77.6
		DP2	15.3

其中DP2、DP3、DP4分别为褐藻二糖、褐藻三糖和褐藻四糖。

综上，AlyV和AlyF在摩尔比1:1时降解AL的速度达到最大值，可将AL完全降解为寡糖，产物聚合度较为均一，其中三糖比例为77.6％。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种均一性褐藻三糖的制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Asn Ala Ser Asp Lys Ala Ala Pro Ala Asp Tyr Glu Gln Phe Gln

1 5 10 15

Asp Val Leu Lys Val Ser Lys Leu Gln Ala Ser Asp Pro Glu Gly Lys

20 25 30

Ser Gly Asn Lys Ser Glu Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Phe Asp Gly Leu

35 40 45

Val Leu Asp Ser Phe Tyr Val Asp Lys Ala Ser Glu Ala Leu Val Phe

50 55 60

Lys Met Pro Gly Tyr Lys Asn Arg Ser Glu Val Arg Ile Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Phe Asn Val Gly Glu Ala Asp Lys Tyr Tyr His Leu Gly Ala Glu Ile

85 90 95

Lys Pro Ile Asn Pro Arg Ala Ser Val Ala Asn Thr Asp Lys Ala Lys

100 105 110

Asn Asp Ala Ile Thr Tyr Leu Gln Val His Asn Ala Gly Ser Val Ser

115 120 125

Ala Asp Phe Pro Asp Gly Val Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Pro His Pro

130 135 140

Leu Val Arg Val Val Tyr Glu Ala Glu Arg Ser Gly Lys Asn Asp Trp

145 150 155 160

Tyr Trp Ala Val Ile Lys Asn Asn Ala Val Asn Cys Gly Ser Lys Ser

165 170 175

Gly Asn Lys Gly Thr Glu Glu Cys Lys Asn Ala Tyr Leu Lys Leu Pro

180 185 190

Ile Ala Pro Ile Ala Lys Glu Gly Thr Asp Lys Phe Asp Ile Tyr Val

195 200 205

Gly Gly Asn Lys Leu Ile Ile Asn His Asn Asp Lys Thr Ala Ile Asn

210 215 220

His Asp Ile Thr Tyr Trp Asn Glu Lys Lys Ser Tyr Phe Lys Ala Gly

225 230 235 240

Val Tyr Asn Gln Phe Lys Asn Gly Glu Ser Glu Ala His Phe Tyr Lys

245 250 255

Leu Thr Tyr Ser Val Glu Ser Glu Pro Val Ile Arg

260 265

<210> 2

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaaatgctt cagataaggc tgctccagca gactacgaac aatttcaaga tgtattaaaa 60

gtgtctaagc ttcaggcgtc tgatcccgaa ggaaaatcgg gaaataagtc ggagtatgct 120

ttaaacggag agttcgatgg tttggtgctt gatagctttt acgtagacaa agcatcggaa 180

gcgcttgtgt ttaaaatgcc tggttacaaa aatcgtagtg aagtacgcat ctataaaaac 240

tttaatgtcg gagaggccga taaatactat catttgggcg cagaaattaa gccaatcaac 300

ccacgcgcgt cagtagctaa cacggacaaa gcgaagaatg atgcgatcac ataccttcaa 360

gtacataatg cgggtagtgt ctctgctgat ttccctgacg gtgtgtctgg agaaggttat 420

attccacacc cactagtgcg cgtagtttat gaagctgaac gtagtggcaa gaacgattgg 480

tactgggctg taattaagaa caatgctgtg aactgtggtt cgaagagtgg caataagggc 540

acagaagagt gtaaaaatgc gtatttgaaa ctaccaattg caccaatcgc caaagaaggt 600

acagacaagt ttgatatcta tgttggtggt aacaagttga tcattaatca taacgataaa 660

acggccatca accacgacat cacatattgg aatgagaaga aaagctattt caaagccggt 720

gtttataacc agtttaagaa cggagaaagt gaagctcatt tttacaagct aacgtattcg 780

gtagaaagcg agccagtaat tcgttaa 807

<210> 3

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Thr Thr Gln Glu Lys Thr Ala Pro Val Ile Ser Val Ala Glu Gln

1 5 10 15

Ala Val Pro Ser Ile Ser Glu Ile Asp Arg Ser Tyr Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Asp Arg Leu Thr Glu Val Asp Gly Asn Thr Leu Asp Val Ala Ser Glu

35 40 45

Glu Gln Val Ala Ala Leu Lys Ala Gln Phe Glu Asn Leu Lys Asp Gly

50 55 60

Asp Glu Val Val Ile Pro Asn Gly Lys Tyr Ala Asn Leu Gly Gln Val

65 70 75 80

Thr Ile Thr Ala Asn Asp Val Thr Ile Arg Ala Glu Gln Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Trp Leu Thr Gly Leu Ile Gln Phe Glu Leu Lys Gly Asp Asp Ile

100 105 110

Thr Leu Asp Gly Leu Val Phe Thr Glu Gly Gly Pro Asn Glu Arg Phe

115 120 125

Gly Ala Val Arg Met Met Gly Asn Gly Asn Thr Leu Gln Asn Ser Thr

130 135 140

Phe Tyr Tyr Phe Asn His Asp Tyr Thr Tyr Glu Pro Asp Glu Arg Arg

145 150 155 160

Ser Glu Tyr Pro Lys Tyr Leu Trp Val Ser Leu Trp Gly Lys Asp Gly

165 170 175

Lys Val Ile Asn Asn Arg Phe Glu Gly Lys Gln Lys Arg Gly Thr Leu

180 185 190

Ile Gly Val Gln Lys Asp Asp Thr Pro Asp Asn His Leu Ile Ala Asn

195 200 205

Asn Ile Phe Met Asp Gln Lys Pro Asn Gln Phe Asn Glu Phe Asp Ile

210 215 220

Lys Glu Ala Ile Arg Tyr Asn Gly Asn Ser Trp Glu Ala Ile Arg Ile

225 230 235 240

Gly Asp Ser Lys Ser Ser Gln Trp Asp Ser Ser Ser Lys Phe Val Asn

245 250 255

Asn Leu Met Ile Asp Met Asp Gly Glu Arg Glu Leu Ile Ser Ile Lys

260 265 270

Ser Gly Asp Asn Thr Ile Ser Gly Asn Thr Ile Phe Gln Ser Ala Ala

275 280 285

Leu Ile Ser Leu Arg His Gly Lys Gly Asn Thr Val Glu Asn Asn Met

290 295 300

Ile Leu Gly Asn Glu Lys Arg Leu Thr Gly Gly Ile Arg Ile Tyr Asp

305 310 315 320

Glu Asp His Val Ile Arg Asn Asn Tyr Ile Ala Asn Thr Arg Gly Arg

325 330 335

Asp Gly Val Ile Glu Gly Asn Ala Asp Leu Arg Gly Gly Ile Val Ile

340 345 350

Asn Thr Gly Ile Ile Asp Val Ala Asn Gly Glu Gln Leu Asp Gln Ser

355 360 365

Val Lys Gly Lys Glu Leu Asn Lys Gln Trp Thr Pro Lys Asn Ile Thr

370 375 380

Ile Glu Asn Asn Ser Leu Val Asp Thr Glu Trp Gly Ile Val Tyr Gly

385 390 395 400

Asn Gln Ser His Arg Val Ser Leu Phe Asn Asn Ala Glu Val Glu Gly

405 410 415

Ile Tyr Ala Gly Val Asp Ile Ala Phe Lys His Asn Val Val Asp Asn

420 425 430

Ser Gln Thr Pro Glu Phe Val Ser Val Arg Ala Thr His Asp Phe Pro

435 440 445

Leu Val Gly Ala Thr Tyr Thr Asp Glu Thr Tyr Val Gly Gln Val Thr

450 455 460

Asp Ser Glu Leu Ile Glu Ser Tyr Ser Val Glu Leu Pro Lys Val Thr

465 470 475 480

Val Glu Asn Gly Leu Asn Ala Tyr Gln Gly Glu Gly Ala Asp Val Ser

485 490 495

Lys Leu Ser Val Val Thr Ala Glu Thr Ala Gly Pro Asp Tyr Val Leu

500 505 510

Glu Asn Thr Thr Lys

515

<210> 4

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaccaccc aagaaaaaac agcacccgtg atcagcgtgg ctgagcaagc tgtgccttcg 60

atcagcgaaa tcgaccgtag ttacttatta agcagtgacc gcttaactga ggttgatggc 120

aatacactag acgttgcttc agaagaacaa gtggctgcac ttaaggcgca atttgaaaac 180

ctaaaagatg gcgacgaagt ggttatccct aatggtaaat acgcgaactt aggtcaagtg 240

acgatcaccg caaatgacgt gactattcgc gctgaacaag caggggcagc gtggctgaca 300

ggtctaattc agtttgaact gaaaggtgat gacatcacgc ttgatggtct cgtatttaca 360

gagggtggtc caaacgaacg ttttggcgca gtacgtatga tgggtaatgg caacacgttg 420

caaaactcaa cattctacta cttcaaccat gattacacgt acgagccaga tgagcgtcgc 480

tctgagtatc caaagtacct ttgggtttct ctgtggggta aagatggcaa ggtgattaac 540

aaccgtttcg aaggtaagca aaagcgcggt acattgatcg gtgttcaaaa ggatgacaca 600

ccagataatc atttgatcgc aaacaacatc tttatggatc aaaagccaaa ccagtttaac 660

gagttcgata tcaaagaagc gattcgctac aacggtaaca gctgggaagc gattcgtatc 720

ggtgactcta agtcttcgca gtgggattca agctccaagt tcgtgaacaa cctgatgatc 780

gatatggacg gtgagcgtga gcttatctct attaagtcgg gcgacaatac gatttcaggc 840

aacacgatct tccaaagtgc ggcactgatt tcactgcgtc acggcaaagg caacacggtt 900

gagaacaaca tgattttggg taacgagaaa cgcctaacgg gtggtattcg tatctatgat 960

gaagaccatg tgatccgcaa caactacatt gctaatactc gtggccgtga tggtgtgatt 1020

gaaggtaacg ctgacttacg tggtggtatc gtgatcaaca cgggcatcat tgatgtggcg 1080

aacggtgaac agcttgacca atcagtgaaa ggtaaagagc ttaataagca atggactccg 1140

aaaaacatca ccatcgaaaa caactctcta gtcgatactg agtggggcat tgtttatggt 1200

aatcaaagcc atcgcgtaag cctgtttaat aacgcagaag tagaaggcat ttatgccggt 1260

gttgatattg cgttcaaaca caacgtggtt gataactcac aaacacctga atttgtgagt 1320

gttcgagcga ctcatgactt cccattagtc ggcgcaactt acacagatga aacttacgtt 1380

ggtcaagtca cagactctga actgattgaa agctactcgg ttgagctacc aaaagtaacg 1440

gtcgagaatg gcctgaatgc ttaccaaggt gagggcgcag atgtgtctaa actctcagtt 1500

gtgaccgctg aaacagcagg tccagattat gtacttgaga acacaactaa gtaa 1554

Claims (5)

1.一种藻胶裂解酶降解褐藻胶的方法，其特征在于，所述的方法是用氨基酸序列为SEQID NO:1的褐藻胶裂解酶和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的褐藻胶裂解酶来降解褐藻胶制备褐藻三糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶裂解酶，其编码基因的序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的褐藻胶裂解酶，其编码基因的序列为SEQ ID NO:4。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶裂解酶和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的褐藻胶裂解酶的摩尔比值为1:10-10:1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶裂解酶和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的褐藻胶裂解酶的摩尔比为1:1。

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