CN112430256A - 一种阿尼芬净母核的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：(1)将阿尼芬净母核溶解、过滤，得到阿尼芬净母核滤液；(2)采用水和有机溶剂作为流动相，将阿尼芬净母核滤液用均粒HILIC层析柱进行柱层析，收集目的峰的洗脱液，得到纯化后的阿尼芬净母核。本发明所涉及的阿尼芬净母核的分离纯化方法仅需一步层析纯化即可满足阿尼芬净母核纯度大于99％，收率大于80％的要求，纯度高、收率高且稳定，同时该分离纯化方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。所用固定相可重复利用，所用流动相量可回收利用，也大大降低成本。
Description
技术领域
本发明属于药物纯化技术领域，具体涉及一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，尤其涉及一种纯化高、收率高且稳定性好的阿尼芬净母核的分离纯化方法。
背景技术
阿尼芬净母核(CAS号79411-15-7，分子式C34H51N7O15)，脂肽，是一种自然发生的与酰侧链的环状六肽。它属于一类抗真菌药物称为棘白菌素，是通过非竞争性抑制的一个关键酶β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶抑制真菌细胞壁葡聚糖的合成的主要成分。其分子式如下所示：
目前现有技术对阿尼芬净母核的报道多为合成方法专利，分离纯化方法鲜有报道，例如CN105154424B公开了一种固定化环脂肽脱酰酶的制备方法，环脂肽脱酰酶溶液不经纯化，直接与多孔亲水性酶载体混合，并加入一种或多种有机溶液和无机盐，得到固定化环脂肽脱酰酶；同时公开了这一方法可用于工业化生产米卡芬净母核和阿尼芬净母核。该发明公开的制备方法工艺简单，不仅节省了酶纯化设备，而且固定化过程中酶活回收率明显提高，固定化酶可多次重复使用。酶法转化米卡芬净和阿尼芬净中间体，相比发酵转化法反应底物浓度高，产物杂质少，转化效率高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，尤其提供一种纯化高、收率高且稳定性好的阿尼芬净母核的分离纯化方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：
(1)将阿尼芬净母核溶解、过滤，得到阿尼芬净母核滤液；
(2)采用水和有机溶剂作为流动相，将阿尼芬净母核滤液用均粒HILIC层析柱进行柱层析，收集目的峰的洗脱液，得到纯化后的阿尼芬净母核。
本发明所涉及的阿尼芬净母核的分离纯化方法仅需一步层析纯化即可满足阿尼芬净母核纯度大于99％，收率大于80％的要求，纯度高、收率高且稳定，同时该分离纯化方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。所用固定相可重复利用，所用流动相量可回收利用，也大大降低成本。
上述收集目的峰的洗脱液是指分段收集目的峰值的阿尼芬净母核溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选地，所述有机溶剂包括乙腈。
相比于其他有机溶剂例如乙醇、甲醇等，本发明特定选用乙腈作为流动相是因为其他流动相纯化效果差，某几个杂质去除不了。
优选地，所述水与有机溶剂的体积比为10:90-20:80，例如10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、14.8:85.2、14.9:85.1、15:85、15.1:84.9、15.2:84.8、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选16:84-14:86，进一步优选15.2:84.8-14.8:85.2。
所述水与有机溶剂的体积比特定选择为10:90-20:80，且随着有机溶剂的占比升高，目的峰的出峰时间大幅度延长，耗费的流动相更多，但产物纯度略有提高，为了平衡成本与纯度要求的关系，本发明更优选16:84-14:86这个范围，最优选15.2:84.8-14.8:85.2这个范围，能将洗脱时间控制在200min以内，同时保证99％以上的纯度。
优选地，所述溶解的溶剂包括甲醇。
优选地，所述过滤采用0.45μm滤膜进行过滤。
此处过滤操作是为了去除不溶性杂质。
优选地，所述阿尼芬净母核滤液的浓度为25-35mg/mL，例如25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述柱层析的流速控制在0.5-1.0mL/min，例如0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述柱层析的流速特定控制在0.5-1.0mL/min的范围内，且随着流速的降低，纯化时间会相应地增加。
优选地，所述均粒HILIC层析柱的填料为型号UniSil-Amide的硅胶填料。
所述型号UniSil-Amide的硅胶填料是粒径为10μm、孔径
的高分子微球，该微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构，为单分散的、具有孔道结构的微球，使其作为色谱填料时具有很好的针对性。由苏州纳微科技有限公司生产。
优选地，所述柱层析的洗脱方式为等度洗脱。
优选地，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％(例如45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述)的乙腈水溶液再生层析柱，再用80-90％(例如90％、89％、88％、87％、86％、85.2％、85.1％、85％、84.9％、84.8％、84％、83％、82％、81％、80％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述)的乙腈水溶液平衡层析柱。
更优选地，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用84-86％的乙腈水溶液平衡层析柱。
进一步优选地，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用84.8-85.2％的乙腈水溶液平衡层析柱。
作为本发明的优选技术方案，所述分离纯化方法具体包括如下步骤：
(1)将阿尼芬净母核用甲醇溶解、0.45μm滤膜过滤，得到浓度为25-35mg/mL的阿尼芬净母核滤液；
(2)将型号UniSil-Amide的硅胶微球为填料的层析柱进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用80-90％的乙腈水溶液平衡层析柱；
(3)采用体积比为10:90-20:80的水和乙腈作为流动相，将阿尼芬净母核滤液进行柱层析，等度洗脱，流速控制在0.5-1.0mL/min，收集目的峰的洗脱液，得到纯化后的阿尼芬净母核。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的阿尼芬净母核的分离纯化方法仅需一步层析纯化即可满足阿尼芬净母核纯度大于99％，收率大于80％的要求，纯度高、收率高且稳定，同时该分离纯化方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。所用固定相可重复利用，所用流动相量可回收利用，也大大降低成本。
附图说明
图1是型号UniSil-Amide的硅胶微球的扫描电镜图；
图2是实施例1中纯化前的阿尼芬净母核的高效液相色谱图；
图3是实施例1中纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图；
图4是实施例4中纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图；
图5是实施例5中纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例和对比例所涉及的型号UniSil-Amide的硅胶微球由苏州纳微科技有限公司生产，其扫描电镜图如图1所示。所涉及的型号RPC-30SCX的填料由苏州纳微科技股份有限公司生产；其他涉及原料均可通过市售途径获得。
下述实施例所涉及的高效液相色谱分析的条件为：色谱柱型号为Waters XBridgeAmide 4.6*150mm 3.5μm，流动相为乙腈、水，柱温为40℃，流速为1mL/min，洗脱方式为等度洗脱。下述对比例所涉及的高效液相色谱分析的条件为：色谱柱型号为Waters XBridgeAmide 4.6*250mm 3.5μm，流动相为乙醇、水，柱温为40℃，流速为1mL/min，洗脱方式为梯度洗脱。
实施例1
本实施例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作如下：
(1)将纯度为92.445％的阿尼芬净母核用纯甲醇溶解，溶液中阿尼芬净母核浓度为30mg/mL；用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
(2)采用4.6×250mm的色谱柱，UniSil-Amide微球作为层析柱填料进行装柱，装柱体积为4.2mL。然后进行平衡处理，先用50％的乙腈水溶液再生层析柱，再用85％的乙腈水溶液平衡层析柱；
(3)采用体积比为15:85的水和乙腈作为流动相，将阿尼芬净母核滤液进行柱层析，等度洗脱，流速控制在1.0mL/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化后的阿尼芬净母核。柱层析过程共耗时180min。
本实施例中纯化前和纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图分别如图2和图3所示。经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度99.5％，收率82％。
实施例2
本实施例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作如下：
(1)将纯度为92.445％的阿尼芬净母核用纯甲醇溶解，溶液中阿尼芬净母核浓度为30mg/mL；用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
(2)采用4.6×250mm的色谱柱，UniSil-Amide微球作为层析柱填料进行装柱，装柱体积为4.2mL。然后进行平衡处理，先用45％的乙腈水溶液再生层析柱，再用85.2％的乙腈水溶液平衡层析柱；
(3)采用体积比为14.8:85.2的水和乙腈作为流动相，将阿尼芬净母核滤液进行柱层析，等度洗脱，流速控制在0.5mL/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化后的阿尼芬净母核。柱层析过程共耗时400min。
经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度99.65％，收率85％。
实施例3
本实施例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作如下：
(1)将纯度为92.445％的阿尼芬净母核用纯甲醇溶解，溶液中阿尼芬净母核浓度为30mg/mL；用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
(2)采用4.6×250mm的色谱柱，UniSil-Amide微球作为层析柱填料进行装柱，装柱体积为4.2mL。然后进行平衡处理，先用55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用84.8％的乙腈水溶液平衡层析柱；
(3)采用体积比为15.2:84.8的水和乙腈作为流动相，将阿尼芬净母核滤液进行柱层析，等度洗脱，流速控制在0.7mL/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化后的阿尼芬净母核。柱层析过程共耗时240min。
经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度99.6％，收率83％。
实施例4
本实施例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作与实施例1的区别仅在于步骤(2)中用87％的乙腈水溶液平衡层析柱，步骤(3)中采用体积比为13:87的水和乙腈作为流动相，其他条件均保持不变。柱层析过程共耗时360min。
本实施例中纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图如图4所示。经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度99.7％，收率85％。
实施例5
本实施例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作与实施例1的区别仅在于步骤(2)中用83％的乙腈水溶液平衡层析柱，步骤(3)中采用体积比为17:83的水和乙腈作为流动相，其他条件均保持不变。柱层析过程共耗时80min。
本实施例中纯化后的阿尼芬净母核的高效液相色谱图如图5所示。经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度98.6％，收率80％。
对比例1
本对比例提供一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，操作如下：
(1)将纯度为92.445％的阿尼芬净母核用纯水溶解，溶液中阿尼芬净母核浓度为30mg/mL；用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用；
(2)采用4.6×250mm的色谱柱，RPC-30SCX微球作为层析柱填料进行装柱，装柱体积为4.2mL。然后进行平衡处理，用纯水平衡层析柱；
(3)以纯水作为A相，100％乙醇作为B相，将阿尼芬净母核滤液进行柱层析，设置0min-60min的0％B-100％B进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化后的阿尼芬净母核。柱层析过程共耗时80min。
经高效液相色谱分析，洗脱液中阿尼芬净母核的纯度99.1％，收率20.5％。
由此可知：本发明所涉及的阿尼芬净母核的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足阿尼芬净母核纯度大于99％，收率大于80％的要求，纯化收率高而稳定，同时该分离方法简单方便，耗时短。
通过对比实施例1和实施例2-3的结果可知，当流速降低，柱层析过程耗时增加，但纯度和收率同样维持在较高水平。对比实施例1和实施例4，当乙腈水溶液的浓度由85％增加到87％时，纯度和收率同样维持在较高水平，但柱层析过程耗时显著延长；对比实施例1和实施例5，当乙腈水溶液的浓度由85％降低到83％时，虽然耗时缩短，但纯度和收率均显著降低；对比实施例和对比例可知，本发明所涉及的分离纯化方法中UniSil-Amide微球作为层析柱填料这一条件同时保证了高纯度和高收率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：
(1)将阿尼芬净母核溶解、过滤，得到阿尼芬净母核滤液；
(2)采用水和有机溶剂作为流动相，将阿尼芬净母核滤液用均粒HILIC层析柱进行柱层析，收集目的峰的洗脱液，得到纯化后的阿尼芬净母核。
2.如权利要求1所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙腈。
3.如权利要求1或2所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述水与有机溶剂的体积比为10:90-20:80，优选16:84-14:86，进一步优选15.2:84.8-14.8:85.2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述溶解的溶剂包括甲醇；
优选地，所述过滤采用0.45μm滤膜进行过滤；
优选地，所述阿尼芬净母核滤液的浓度为25-35mg/mL。
5.如权利要求1-4中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述柱层析的流速控制在0.5-1.0mL/min。
6.如权利要求1-5中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述均粒HILIC层析柱的填料为型号UniSil-Amide的硅胶填料。
7.如权利要求1-6中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述柱层析的洗脱方式为等度洗脱。
8.如权利要求1-7中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用80-90％的乙腈水溶液平衡层析柱。
9.如权利要求1-7中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用84-86％的乙腈水溶液平衡层析柱。
10.如权利要求1-7中任一项所述的阿尼芬净母核的分离纯化方法，其特征在于，所述均粒HILIC层析柱在使用前进行平衡处理，包括：先用45-55％的乙腈水溶液再生层析柱，再用84.8-85.2％的乙腈水溶液平衡层析柱。
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