CN103724403A - 一种棘白菌素b的分离纯化方法和用途 - Google Patents
一种棘白菌素b的分离纯化方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发提供一种从发酵液中分离棘白菌素B的方法及其用途,发酵液经过酸化、浸提、浓缩等步骤,再将浓缩液上样至反相硅胶柱进行分离,浓缩得棘白菌素B。本方法获得产物纯度高是制备棘白菌素环肽母核及抗真菌药物的良好原材料。本方法制得的终产物收率高、所用的溶剂及仪器均安全又经济,生产成本低、操作简便特别适合工业生产。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,具体涉及一种棘白菌素B从发酵液中分离的方法及其用途。
背景技术
棘白菌素类(Echinocandins)是70年代末期发现的一组天然产物,具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征,能够非竞争性抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶活性,临床上作为抗真菌药物使用。
棘白菌素B(Echinocandin B,简称ECB)由构巢曲霉(Aspergilus
nidulans)代谢产生,是棘白菌素类中的一种,其结构如下:
棘白菌素B经脱酰酶作用得到环肽母核,环肽母核再经过化学修饰可制备得到抗真菌药物阿尼芬净(Anidulafungin)。为了提高ECB脱酰效率和ECB母核质量,需要对发酵液中的ECB进行分离纯化,发酵液HPLC图谱见附图1。
现有技术中对棘白菌素B的分离技术大多通过大孔树脂和硅胶层析法进行分离,如美国专利US4968608公开了一种用大孔树脂HP20、葡聚糖凝胶LH20和正相硅胶从发酵液中分离纯化得到ECB的方法,该方法步骤繁琐、所使用分离介质价格昂贵且对含油酸甲酯超过2%的发酵菌丝浸提液适应性差;美国专利US6506726对此进行改进,将发酵液酸化后使用HP20、SP825、SP207和CG-161等大孔树脂分离提纯ECB,该方法比较简便但分离效果不好,产品纯度低于80%,也存在对含油酸甲酯超过2%的发酵菌丝浸提液适应性差得缺点。同时美国专利US4288549 中也公开了一种采用过硅胶柱,萃取等方法纯化棘白菌素B的方法,但是此方法需要在较大的压力条件下进行,导致制备工艺难以放大,且对上游发酵液中的色素不能很好的去除。棘白菌素B中所含杂质成分过高必将导致其经脱酰酶作用得到的环肽母核质量降低,进而影响以其为有效成分的抗菌药物的质量。
所以迫切需要一种适应性强、纯度和收率高、操作简便又经济的从发酵液中分离棘白菌素B的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棘白菌素B及其从发酵液中分离的方法,该方法包括如下步骤:
步骤1):酸化棘白菌素B 的发酵液并过滤取菌丝体;
所述的酸化是指使用弱酸,调节发酵液pH为4-6。
所述的弱酸为草酸、碳酸或醋酸,优选为草酸;调节发酵液pH为4-6,优选调节发酵液pH为5。
所述的酸化过程中,可以添加助滤剂,添加的量为菌丝质量的5%-15%,优选为10%。
所述的助滤剂为珍珠岩、微分硅胶、滑石粉或麦子淀粉,优选为珍珠岩。适当的添加助滤剂以减小菌丝体之间的摩擦力,改善溶液的流动性,便于菌丝体更充分的被过滤获取。
优选的,可以在将菌丝体过滤后用水洗涤,并进一步干燥获得。
更进一步的,步骤1)优选为向发酵液中加入质量为菌丝质量10%的助滤剂,再加入适量酸化剂调节发酵液 pH为4-6,搅拌1-3小时;过滤,用水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体。
步骤2):将菌丝体用有机溶剂浸提,过滤并浓缩滤液;
所述的有机溶剂选自醇或酮中的一种或其任意两种或两种以上的溶剂组合。
所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇或1,3-丙二醇,优选为甲醇或乙醇;所述酮为丙酮、丁酮或戊酮。
所述的浸提过程中使用的有机溶剂质量为菌丝体质量的2-4倍,优选3倍;边搅拌边浸泡菌丝体3-8小时后,优选4-6小时,再过滤收集滤液。
进一步的,浸提过程可重复1-3次,优选2次,以达到充分提取、减少溶剂残留和节约成本的目的。
所述的浓缩是在温度小于50 ℃,真空度为-0.08~-0.09 Mpa条件下进行,浓缩至溶液中有机溶剂含量小于30%。
更进一步的,步骤2)优选为取质量为过滤所得菌丝体质量的3倍的有机溶剂浸泡菌丝体,边搅拌边浸泡4-6小时后过滤收集滤液,再次用质量为经浸提后的菌丝体质量的2-3倍的有机溶剂边搅拌边浸泡3-5小时,再过滤,收集滤液,合并两次滤液;减压浓缩滤液,使溶液中的有机溶剂含量小于30%。
步骤3):将滤液经萃取剂萃取除去油酸甲酯,收集有机层溶液并浓缩;
所述的萃取是指用体积为凝缩液体积5%-30%的萃取剂,优选10%;萃取1-3次,优选2次。
所述的萃取剂为石油醚、正己烷或正庚烷,优选为石油醚。
所述的浓缩是指经萃取后收集有机层溶液35℃-70℃下,优选为40-50℃,浓缩至有机层溶液体积的25%以下,优选10%以下。
进一步的,步骤3)优选为取体积为浓缩液体积10%-25%的萃取剂进行萃取2-3次,除去上层油酸甲酯,收集有机层溶液,40℃-50℃下浓缩有机层溶液至体积的10%-15%。
步骤4):将有机层溶液上样至反相硅胶进行分离,再浓缩得棘白菌素B粗品;
所述的上样至反相硅胶进行分离是在0.1 MPa-0.2 MPa的压力下进行;所述的反相硅胶柱填料为C4-C18反相硅胶填料,更优选为C18反相硅胶填料。
所述的反相硅胶填料的粒径为1-100um,优选为2-50um,更优选5-30um。
更进一步的,所述的反相硅胶柱填料的孔径可选自50-500Å,优选100-300Å。
所述的反向硅胶柱填料可购于苏州纳微生物科技有限公司的UniSil TM 2-RPC、UniSil TM 3-RPC、UniSil
TM 4-RPC、UniSil TM
5-RPC、UniSil TM 6-RPC、UniSil TM 8-RPC、UniSil
TM 10-RPC、UniSil TM
15-RPC、UniSil TM 20-RPC、UniSil TM 30-RPC、UniSil
TM 40-RPC或UniSil TM
50-RPC型号的填料。优选UniSil TM 10-RPC型号。
所述的反相硅胶分离是指用甲醇或乙醇溶液为洗脱液,优选60%-70%的甲醇或乙醇溶液。
所述的反相硅胶分离过程HPLC在线监测,波长210nm。
更进一步的,步骤4)优选为调节萃取后溶液中有机溶剂的浓度为40%-70%,上样至反相硅胶柱,再用浓度为60%-70%的醇溶液进行洗脱,除去色素和其它杂质。全过程 HPLC在线监测,波长210nm,收集溶液;浓缩溶液至干得棘白菌素B。
棘白菌素B在制备棘白菌素类抗真菌药物中的用途,其特征在于,所述的棘白菌素B是通过上述方法制备的。所述的棘白菌素类抗真菌药物包括卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净等。所述的制备棘白菌素类抗真菌药物的方法是将本发明所述分离方法制备得到的棘白菌素B为原料。
本发明提供的从发酵液中分离棘白菌素B的方法,在分离之前对含有棘白菌素B的溶液进行石油醚萃取,避免了氯仿这类有毒溶剂的使用,更有效的除去了溶液中的油酸杂质。申请人意外的发现,在柱层析分离之前通过萃取的步骤除去油酸类杂质,使得柱层析的过程仅需要较小的压力和适当的醇溶液洗脱即可实现最大程度的分离,有效避免了柱压过大对仪器的过分要求,也避免了有毒溶剂的使用,更适合于工业化生产。
本发明的分离条件温和易操作,申请人发现,本发明的方法解决了少量杂质不能被除去的问题,使分离后的目标产物纯度达到95%以上,不仅提高了产品的质量还避免了现有技术中填料昂贵和分离条件中沉降压力过大的问题,使产品的质量得到保障,实现产业化生产大大降低产品的生产成本。
其次,本发明中发酵液经过酸化处理,使棘白菌素B充分的从发酵液中被浸提出来,提高了产品的收率。本发明操作简单,产物收率高、纯度高,适合大规模生产。
本发明的方法制备的棘白菌素B纯度高,为制备棘白菌素类药物提供了品质良好的原料,有利于后续棘白菌素类药物的工业化生产中的产品质量控制。
附图说明
图1 棘白菌素B发酵液的HPLC图谱
图2 通过本发明的方法分离获得的棘白菌素B的HPLC图谱
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明作进一步的说明。
本发明中棘白菌素B 发酵可通过如下途径获得:
菌种:ATCC 58397
种子培养:
培养基:葡萄糖1.0%、甘油1.0%、棉籽粉2.5%,pH 为6.8-7.0;
条件:25℃,2 天,摇床转速:250rpm。
斜面培养:
培养基:PDA;
条件:25℃,10 天。
发酵培养:
培养基:葡萄糖2.0%、蔗糖2.0%、甘油2.0%、豆油2.0%、棉籽粉2.0%、黄豆粉1.0%、酵母粉0.5%、KH2PO40.5%、脯氨酸0.5%,消前pH7.0;
121℃灭菌20min,接种量10%,摇瓶装量100ml/750ml,置于25℃恒温室中旋转式摇床250rpm 摇瓶发酵9 天后,得到棘白菌素B发酵液。
实施例
1
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用草酸调节pH为5.0,加入20g珍珠岩搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体352g。
取菌丝体352g,加入1000ml乙醇溶液,边浸泡边搅拌6小时,过滤,得到浸提液约980ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml乙醇溶液中,边浸泡边搅拌4小时,过滤,得到浸提液约730ml,50℃下浓缩浸提液至体积为75ml,冷却至室温,合并两次的浸提液25℃,真空度为-0.08 Mpa下浓缩浸提液至溶液中的乙醇含量为25%。
取100ml浸提液,加入10ml石油醚振荡,静置2小时,收集有机层溶液92ml,40℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶UniSil
TM 10-RPC 孔径为100 Å的C18填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,柱型为4.6mm×250 mm×5 um,0.2MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540 mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B 900
mg ,HPLC检测纯度为96.7%。。
实施例
2
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用醋酸调节pH为4.0,加入15g滑石粉搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体350g。
取菌丝体350g,加入1000ml甲醇溶液,边浸泡边搅拌4小时,过滤,得到浸提液约970ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml甲醇溶液中,边浸泡边搅拌3小时,过滤,得到浸提液约725ml,50℃下浓缩浸提液至体积为72ml,冷却至室温,合并两次的浸提液。25℃,真空度为-0.08 Mpa下浓缩浸提液至溶液中的甲醇含量为20%。
取100ml浸提液,加入10ml正己烷振荡,静置2小时,收集有机层溶液90ml,40℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶UniSil TM
10-RPC孔径为500 Å的C8填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,柱型为2.1mm×150 mm×5 um,0.1MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540
mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B 910
mg,HPLC检测纯度为95.4%。
实施例
3
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用碳酸调节pH为6.0,加入35g微粉硅胶搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体355g。
取菌丝体355g,加入1000ml丙酮溶液,边浸泡边搅拌6小时,过滤,得到浸提液约985ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml丙酮溶液中,边浸泡边搅拌3小时,过滤,得到浸提液约735ml,50℃下浓缩浸提液至体积为75ml,冷却至室温,合并两次的浸提液。25℃,真空度为-0.08 Mpa下浓缩浸提液至溶液中的丙酮含量为28%。
取100ml浸提液,加入10ml正庚烷振荡,静置2小时,收集有机层溶液90ml,35℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶UniSil TM
10-RPC孔径为170Å的C4填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,柱型为4.6mm×250 mm×5 um,0.15MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540
mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B 920
mg,HPLC检测纯度为95.6%。
实施例
4
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用草酸调节pH为5.0,加入30g微粉硅胶搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体355g。
取菌丝体355g,加入800ml乙醇和200ml丙酮混合溶液,边浸泡边搅拌5小时,过滤,得到浸提液约980ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml丙酮溶液中,边浸泡边搅拌3小时,过滤,得到浸提液约735ml,50℃下浓缩浸提液至体积为75ml,冷却至室温,合并两次的浸提液。25℃,真空度为-0.08
Mpa下浓缩浸提液至溶液中的乙醇和丙酮含量之和为26%。
取100ml浸提液,加入10ml正庚烷振荡,静置2小时,收集有机层溶液90ml,40℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶为UniSil TM
2-RPC孔径为50 Å的C18填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,,柱型为2.1mm×150 mm×5 um,0.2MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540 mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B915mg,HPLC检测纯度为96.2%。
实施例
5
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用草酸调节pH为5.0,加入20g微粉硅胶搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体354g。
取菌丝体355g,加入800ml乙醇和200ml丙酮混合溶液,边浸泡边搅拌8小时,过滤,得到浸提液约980ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml丙酮溶液中,边浸泡边搅拌4小时,过滤,得到浸提液约735ml,50℃下浓缩浸提液至体积为75ml,冷却至室温,合并两次的浸提液。25℃,真空度为-0.08
Mpa下浓缩浸提液至溶液中的乙醇和丙酮含量之和为26%。
取100ml浸提液,加入10ml石油醚振荡,静置2小时,收集有机层溶液90ml,70℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶为UniSil TM
50-RPC孔径为50 Å的C18填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,,柱型为2.1mm×150 mm×5 um,0.2MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540 mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B915mg,HPLC检测纯度为96.0%。
实施例
6
:
取棘白菌素B发酵液1000ml,用草酸调节pH为5.0,加入30g珍珠岩搅拌2小时,过滤,用500 ml水洗涤菌丝体,干燥后收集菌丝体353g。
取菌丝体352g,加入1000ml乙醇溶液,边浸泡边搅拌6小时,过滤,得到浸提液约980ml,50℃下浓缩浸提液至体积为100ml;将浸提后过滤得到的菌丝体再加入到750ml乙醇溶液中,边浸泡边搅拌4小时,过滤,得到浸提液约730ml,45℃下浓缩浸提液至体积为75ml,冷却至室温,合并两次的浸提液。25℃,真空度为-0.08 Mpa下浓缩浸提液至溶液中的乙醇含量为25%。
取100ml浸提液,加入10ml石油醚振荡,静置2小时,收集有机层溶液92ml,40℃下浓缩至9ml。
取300 mL反相硅胶UniSil
TM 15-RPC 孔径为170 Å的C18填料,以50 %乙醇浸泡3 h后上柱,柱型为4.6mm×250 mm×5 um,0.2MP压力下室温沉降8 h。取浓缩后的有机层溶液200 mL,用无水乙醇与纯化水调节有机层溶液酒精度为50 %得到540 mL 50 %的上柱液,吸附时保持流速为1BV/h,上柱吸附4 h。然后以60 %乙醇溶液400 mL流速为2 BV/h进行预洗,然后以70 %乙醇溶液解吸,每50 mL洗脱液为一瓶进行接收,流速为2 BV/h,HPLC进行在线监测。合并含量、纯度较高的组分,在50℃下,浓缩得到棘白菌素B 900
mg ,HPLC检测纯度为96.5%。
应当说明的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种从发酵液中分离棘白菌素B的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)酸化棘白菌素B的发酵液,过滤获得菌丝体;
2)将步骤1)得到的菌丝体用有机溶剂浸提,过滤并浓缩滤液;
3)将步骤2)所得的滤液经萃取剂萃取除去油酸甲酯,收集有机层,浓缩;
4)将步骤3)得到的浓缩液上样至反相硅胶柱进行分离,得棘白菌素B。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤1)所述的酸化处理是指使用弱酸,调节发酵液pH为4-6。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述的弱酸为草酸、碳酸或醋酸;调节发酵液pH为5。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤2)所述的有机溶剂选自醇或酮中的一种或其任意两种或两种以上的溶剂组合。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇或1,3-丙二醇;所述的酮为丙酮、丁酮或戊酮。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤3)所述的萃取剂为石油醚、正己烷或正庚烷。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤4)所述的上样至反相硅胶柱进行分离是在0.1 MPa-0.2 MPa的压力下进行。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤4)所述的反相硅胶柱进行分离,是指使用60%-70%的甲醇或乙醇溶液为洗脱剂。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤4)所述的反相硅胶柱填料为C4-C18反相硅胶填料。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于反相硅胶柱填料为UniSil TM 10-RPC型号的C18填料。
11.棘白菌素B在制备棘白菌素类抗真菌药物中的用途,其特征在于,所述的棘白菌素B是通过权利要求1-10任意一项所述的方法制备的。
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2012
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