CN101238136A - 在植物来源的载体上纯化他克莫司 - Google Patents

在植物来源的载体上纯化他克莫司 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纯化他克莫司的方法，该方法包括将粗的他克莫司与溶于水/有机溶剂混合物中的银盐以及植物来源的载体接触，从载体中分离混合物并且回收纯的他克莫司。

Description

在植物来源的载体上纯化他克莫司
发明领域
本发明通常涉及免疫抑制剂和抗微生物三环大环内酯类(macrolide)，特别涉及回收和纯化他克莫司(I)的方法。
Figure S2006800290050D00011
技术背景
他克莫司(I)(17-烯丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮)是三环大环内酯类，其通过链霉菌属(Streptomyces sp.)的发酵产生的。他克莫司用于治疗移植排斥危象、自身免疫疾病、感染性疾病等。
EP0184162公开了通过发酵和化学合成制备他克莫司及其衍生物的方法。特别的是，用链霉菌属的发酵除了产生他克莫司外还产生17-乙基衍生物(II)(17-乙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮)，通常称为FK520
Figure S2006800290050D00021
和17-丙基衍生物(III)(17-丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮)。
Figure S2006800290050D00022
在EP0184162中还公开了他克莫司的化学物理性质及相关副产物，以及提取、纯化和回收方法。特别的是从发酵液中回收是通过已知的提取技术实现的，所述的提取技术例如：应用适合从培养基或菌丝体中提取活性的溶剂；用阴离子和阳离子交换树脂或非离子吸收树脂吸附/洗脱；在常规色谱载体上纯化，所述的色谱载体例如硅胶，氧化铝和纤维素；用活性炭脱色，结晶和重结晶。
根据EP0184162，从发酵液中提取和回收他克莫司和相关副产物的方法包括以下步骤：
-用溶剂(例如丙酮和甲醇)提取菌丝体和/或发酵液；
-在非离子吸收树脂(特别是HP-20)上纯化；
-将纯化的溶液蒸发至油状物；
-在硅胶(特别是12级硅胶，Fuji Devison Co.)上纯化，重复两次或三次以获得粉末形式的产物；
-通过制备HPLC纯化以分离上述杂质。
在非离子吸收树脂以及在硅胶上的纯化目的是除去大多数衍生自发酵液的化合物(通过在发酵过程中的微生物产生的物质、无机盐和衍生自原料的物质，但是杂质(II)和(III)通过在制备HPLC上纯化而分离，但是，该方法在工业规模上的产率和应用性较差。
US6492513公开了从杂质(II)和(III)中通过用银盐(特别是硝酸银)预处理的阳离子交换树脂纯化他克莫司。在分离具有相同数目碳原子的不饱和脂族酸的顺-反异构体中应用银盐是文献(J.Chromatography，149(1978)417-430)中已知的。银盐与不饱和化合物形成π-络合物，而分离取决于它们的构象。他克莫司(其具有不饱和的17-烯丙基侧链)用US6492513的方法从具有17-饱和侧链的两种杂质中分离，因为他克莫司在阳离子交换树脂上比两种杂质保留更紧密，因为它形成了银络合物。
最后，US6576135公开了通过非离子吸收树脂从杂质(II)和(III)中分离他克莫司。
发明详述
现在发现他克莫司可以作为与银离子的π-络合物(IV)通过应用植物来源的载体方便地从杂质(II)和(III)中纯化。
Figure S2006800290050D00031
因此，本发明涉及纯化他克莫司的方法，该方法包括将粗的他克莫司与溶于水-有机溶剂混合物中的银盐以及植物来源的载体接触，所述的载体选自纤维素(例如ARBOCELL BC 200，J.Rettenmaier&Sohn或SOLKAFLOC，Dicalite)，改良纤维素(例如Methocel，Dow Chemical)、淀粉、改良淀粉、具有作为单体的简单烃的天然聚合物和碳。在该方法中，杂质保留在植物来源的载体上，而络合物他克莫司-银离子被洗脱在水相中。在溶剂混合物从载体上洗脱后，用他克莫司可溶解的有机溶剂处理水相可以回收他克莫司。
因此，根据第一个实施方案，本发明方法包括：
a.将粗的他克莫司与溶于水-有机溶剂混合物中的银盐以及植物来源的载体接触，所述的载体选自纤维素、改良纤维素、淀粉、改良淀粉、具有作为单体的简单烃的天然聚合物和碳；
b.从载体中分离水/有机溶剂混合物；
c.从水相中回收他克莫司。
特别的是，从水相中回收他克莫司可以通过以下方法实现：
c1.除去有机溶剂；
c2.用他克莫司可溶解的有机溶剂提取水相；
c3.从水相中分离有机相并且通过蒸发溶剂回收纯的他克莫司。
根据本发明优选的实施方案，用该方法纯化的他克莫司可以再进行该方法，应用相同的植物来源的载体作为第一个纯化步骤，或应用不同的载体。例如，在第一个纯化步骤中可以应用纤维素，而在第二个纯化步骤中可以应用碳，反之亦然。
对于本发明的目的，表达“有机溶剂”指的是水可混溶的或非混溶的溶剂，其选自酮类、醇类、脂族和脂环族烃；优选的溶剂是丙酮、甲醇、正己烷和环己烷。
他克莫司可溶解的并且用于从水相中回收他克莫司(步骤c2)的有机溶剂是非水可混溶的有机溶剂，例如乙酸乙酯、甲基-乙基-酮、***、二氯甲烷，优选乙酸乙酯。更详细的是，如下进行步骤c：将含有他克莫司-银π-络合物的混合物真空浓缩以除去有机溶剂(步骤c1)，随后用0.5-3体积他克莫司可溶解的有机溶剂提取(步骤c2)。将有机相用1体积去离子水洗涤2-3次，随后浓缩至小体积(步骤c3)。
步骤c3获得的包含银盐的水相可以回收并且再循环以制备他克莫司-银离子络合物。
与他克莫司的重量相比，植物来源的载体的重量是3÷100倍，优选15÷25倍。其中植物来源的载体是碳，其与他克莫司的重量相比使用量为3÷50倍，优选5÷15倍。在该情况中，将在水-有机溶剂混合物中的络合物他克莫司-银离子上样至包含碳的柱中并且用包含水和相同有机溶剂混合物(包含络合物)的混合物平衡。洗脱流速为0.5÷10体积/小时，其取决于所用的碳的体积，优选3.0÷5体积/小时。与碳的体积相比，洗涤溶液的体积是2÷10倍，优选3÷8倍。然后将洗脱液回收并且进行上述步骤a-d。
将进行纯化形成络合物的银离子从银盐中释放出来，所述的银盐优选硝酸银或高氯酸银。银离子的浓度范围优选0.05至1.30mol/L，最优选0.20至0.30mol/L。将来自链霉菌属的发酵产物溶于他克莫司可溶解的有机溶剂中制备进行第一个纯化循环的他克莫司-离子银复合物，所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、甲醇和乙腈。将不是碳的载体加入至溶液中，然后将有机溶剂蒸发并且将获得的固体用包含银盐的水-有机溶剂混合物提取。与水溶液的体积相比，在提取混合物中有机溶剂的量范围为0至60％，优选0至20％。与他克莫司的重量相比，提取混合物的重量是50÷500倍。固体-液体提取可以重复至多5次，以便获得纯的他克莫司的提取摩尔产率高于90％。
另一方面，当载体是碳时，将发酵产物直接用包含银盐的水-有机溶剂混合物处理，然后上样至柱上。
根据另外的实施方案，本发明方法还可以包括在非离子树脂上的色谱纯化，其根据例如EP0184162中描述的进行。树脂通常选自可商购获得的吸收树脂，优选Mitsubishi Chemical Corporation(SP200或SP800)或Rohm和Haas(系列XAD)。该另外的步骤可以在用植物来源的载体纯化之前或之后进行。根据特别优选的实施方案，该另外的步骤在用植物来源的载体纯化之前进行，如以下更详细的描述。
将适当过滤的发酵液或菌丝体用他克莫司可溶解的有机溶剂提取，所述的溶剂优选酮类或醇类，更优选丙酮或甲醇，并且将提取产物在非离子吸收树脂上进行吸收色谱，以从发酵液中包含的其它化合物中纯化他克莫司和杂质(II)和(III)，所述的其它物质例如在发酵过程中由微生物释放的物质、无机盐和衍生自原料的物质。
将产生的产物溶于进行本发明方法的包含银盐的水-有机溶剂混合物中。优选的是，包含他克莫司-银离子络合物的混合物首先如上述在碳上纯化，然后应用另外的植物来源的载体、优选纤维素重复纯化方法。
将用本发明方法获得的纯的他克莫司用已知方法进行结晶；通常将产物溶于有机溶剂、优选乙腈中，并且通过加入去离子水沉淀为一水合晶体。产生的晶体的特征在于高纯度(HPLC％面积＞99％，其根据在Y.Namiki等人，Chromatographia Vol.40，N°5/6 March 1995中报道的HPLC方法进行)。
本发明方法与已知方法比较特别有利，从产率和最终产品的耗费可见。
关于产率，本发明方法不需要在正常相硅胶上的重复的色谱纯化。文献中公开的在提取/纯化过程中需要的所述的纯化涉及应用显著量的溶剂和硅胶以及延长的时间。
最终产物的耗费确实比用已知方法获得的产物的耗费低，因为本发明方法包括应用可商购获得的植物来源的载体，该载体比在文献中公开的方法中应用的色谱载体的耗费低。另外，根据本发明方法，包含银离子的水溶液可以完全再循环，其保持环境影响低并且限制银盐在最终产物上耗费的发生。
本发明现在将通过某些实施例更详细说明。
实施例
实施例1-在吸收树脂上提取和纯化
在50L发酵液中加入50L丙酮和1kg过滤辅剂(Dicalite)。在室温下搅拌1小时后，将浆液过滤。将产生的澄清溶液吸收在2L吸收树脂XAD16(Pohm和Haas)上。将活性用6L水/丙酮25/75洗脱。将产生的溶液浓缩以除去丙酮。将水相(1.5L)用1.5L乙酸乙酯提取。分离各相并且将有机相浓缩至油状物。
实施例2-在粒状活性炭上纯化
在油相中加入包含13.5g AgNO3的180mL 50/50 水/丙酮溶液。将产生的溶液在包含100mL粒状活性炭GAC 1240 PLUS(CECA ITALIANA)的柱上渗滤，该柱预先用包含11.25g AgNO3的150mL 50/50 水/丙酮溶液调节。然后，将包含30g AgNO3的400mL 50/50 水/丙酮溶液通过柱洗脱。将产生的溶液蒸发至体积为350mL。加入350mL乙酸乙酯，分离各相并且将水相再循环，而有机相根据实施例3处理。
实施例3-在纤维素上纯化
在实施例2的有机相中加入160g纤维素SOLKA FLOC(DICALITE)。将悬浮液蒸发直至完全除去有机溶剂。在产生的固体中加入包含111.5gAgNO3的2L 75/25水/正己烷溶液并且在室温下搅拌30分钟，然后将固体过滤。将提取和过滤重复4次并且分离各相。在水相中加入1L乙酸乙酯并且分离各相。将水相再循环，而有机相用与有机相的体积相比的1体积去离子水洗涤3次，然后浓缩以获得白色固体(9.2g)。
实施例4-他克莫司一水合物的结晶
将固体产物(9.2g，包含8.5g他克莫司)溶于700mL乙腈中。在25℃下将1200mL去离子水缓慢加入(1-2小时)并且将溶液冷却至5℃，将其在5℃下放置12-14小时，然后过滤。获得7.0g高纯度的他克莫司(HPLC％面积＞99％)。
实施例5-用再循环的AgNO3水溶液在粒状活性炭上纯化
将残留的有机溶剂从实施例2的水相中除去形成290mL溶液，然后加入290mL丙酮。
在根据实施例1描述的方法获得的油相中加入180mL再循环的水/丙酮溶液。将产生的溶液上样至包含100mL粒状活性炭GAC1240PLUS(CECA ITALIANA)的柱上，该柱预先用包含11.25g AgNO3的150mL 50/50 水/丙酮溶液调节。然后，将400mL再循环的水/丙酮溶液洗脱。将产生的溶液蒸发至350mL并且加入350mL乙酸乙酯，然后分离各相并且将水相再循环，而有机相根据实施例6中报道的处理。
实施例6-用再循环的AgNO3水溶液在纤维素上纯化
将残留的有机溶剂从实施例3获得的待再循环的水相中除去，以获得6L溶液，在其中加入2L正己烷。
在实施例5的有机相中加入160g纤维素SOLKA FLOC(DICALITE)。将悬浮液蒸发直至有机溶剂除去。在产生的固体中加入从再循环获得的2L水/正己烷溶液并且在室温下搅拌30分钟，然后将固体过滤。将提取和过滤重复4次并且分离各相。在水相中加入1L乙酸乙酯并且分离各相。将水相再循环，而有机相用与有机相的体积相比的1体积去离子水洗涤3次，然后浓缩以获得白色固体产物(9.2g)。
实施例7-他克莫司一水合物的结晶
将固体产物(9.2g，包含8.5g他克莫司)溶于700mL乙腈中。在25℃下将1200mL去离子水缓慢加入(1-2小时)并且将溶液冷却至5℃，然后将其在5℃下放置12-14小时并且过滤。获得7.0g高纯度的他克莫司(HPLC％面积＞99％)。

Claims (14)

1.纯化他克莫司(I)的方法
该方法包括
a.将粗的他克莫司与溶于水-有机溶剂混合物中的银盐以及植物来源的载体接触，所述的载体选自纤维素、改良纤维素、淀粉、改良淀粉、具有作为单体的简单烃的天然聚合物和碳；
b.从载体中分离水/有机溶剂混合物；
c.从水相中回收他克莫司。
2.权利要求1中要求的方法，其中从水相中回收他克莫司通过以下方法实现：
c1.除去有机溶剂；
c2.用他克莫司可溶解的有机溶剂提取水相；
c3.从水相中分离有机相并且通过蒸发溶剂回收纯的他克莫司。
3.权利要求1或2中要求的方法，该方法进一步包括：
d.将纯的他克莫司用包含银盐的水/溶剂混合物处理并且重复步骤a-c。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中载体是纤维素。
5.权利要求1-3中任意一项的方法，其中载体是碳。
6.权利要求3中要求的方法，其中步骤a)第一次用碳进行并且第二次用纤维素进行。
7.权利要求3中要求的方法，其中步骤a)第一次用纤维素进行并且第二次用碳进行。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中溶剂是醇类或酮类。
9.权利要求8中要求的方法，其中溶剂是甲醇或丙酮。
10.权利要求1-9中任意一项的方法，其中有机溶剂是脂族或脂环族烃。
11.权利要求10中要求的方法，其中溶剂是正己烷或环己烷。
12.权利要求2或3中要求的方法，其中他克莫司可溶解的有机溶剂是乙酸乙酯。
13.权利要求2或3中要求的方法，其中从步骤d)的提取获得的水溶液再循环至步骤a)。
14.以上权利要求中任意一项的方法，该方法进一步包括他克莫司在非离子树脂上的色谱纯化。
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C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080806