CN112391455A - 一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒，利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测25个基因的变异情况，25个基因包括ARID1A、BRCA1、BRCA2、POLG、ATR、BRIP1、MSH2、RAD51C、ATM、MLH1、MRE11A、RAD50、ATRX、CHECK1、MUTYH、RAD51D、BAP1、CHECK2、NBN、SMARCB1、BARD1、FANCE、PALB2、WRN、BLM。

Description

一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种用于重组修复缺陷检测的试剂盒。

背景技术

癌症的发展需要一系列的病变阶段，它的发展过程由基因变异所主导，包括DNA、RNA、蛋白质等多个层面的病变，其中DNA的改变是癌症发生的重要因素，包括单核苷酸变异，小的***和缺失，大的结构性变异等常见的变异形式。随着对癌症的不断深入，同源重组缺失（HRD）机制在不同癌种当中的重要性不断被发现。超过50%的高级别浆液性卵巢癌患者存在明显的DNA修复基因缺失，20-25%***癌存在BRCA1/BRCA2或其它同源重组通路中涉及的基因失活突变。DNA在复制过程中，正常细胞通过同源重组机制修复DNA双链断裂，从而保持正常的生长周期，而癌症细胞中由于同源重组基因发生变异，从而发生同源重组缺失，导致DNA修复发生损伤，从而引起基因不平衡和肿瘤的无限增长。例如，BRCA1或者BRCA2突变的细胞，缺少野生基因型，从而导致DNA同源重组修复缺失，导致基因发生变异，从而导致癌症发生。

新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研究打开了新的局面，然而基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让研究人员倍感困难，目标序列捕获技术的出现，缓解了这些问题。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针后进行的测序。外显子组捕获测序则是其中的一个特例，它是专门针对基因组中全部外显子区域的研究。多基因全外显子测序是利用序列捕获技术将多基因全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度，能发现外显子区绝大部分疾病相关变异以及仅需要对约1%的基因组进行测序等优点，促使多基因全外显子测序成为如孟德尔疾病等疾病的致病基因最有效的策略，也被运用于复杂疾病易感基因的研究和临床诊断中。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒及其用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒，包含对25个基因进行的深度测序，包括如下基因：ARID1A、BRCA1、BRCA2、POLG、ATR、BRIP1、MSH2、RAD51C、ATM、MLH1、MRE11A、RAD50、ATRX、CHECK1、MUTYH、RAD51D、BAP1、CHECK2、NBN、SMARCB1、BARD1、FANCE、PALB2、WRN、BLM；该试剂盒包含建库试剂盒、杂交试剂盒、探针试剂盒和接头盒。

作为本发明进一步的方案：所述试剂盒的组分和含量包括建库试剂盒1盒、杂交试剂盒1盒、探针试剂盒1盒、接头试剂盒1盒，所述检测试剂盒供16人份检测应用，试剂盒的保存温度为-25℃~-15℃。

作为本发明进一步的方案：所述的建库试剂盒可进行DNA的片段化末端修复、连接反应和扩增富集。

作为本发明进一步的方案：所述的建库试剂盒包括1管末端修复反应液300μl、1管连接反应液500μl、1管连接酶100μl、1管扩增反应液1000μl、1管扩增引物200μl。

作为本发明进一步的方案：所述的杂交试剂盒可进行杂交捕获和杂交后清洗 。

作为本发明进一步的方案：所述的杂交试剂盒包括1管封闭液40μl、1管Cot-1 DNA100μl、1管杂交缓冲液170μl、1管杂交增强液54μl、1瓶2×磁珠清洗液5ml、1管10×清洗缓冲液1 600μl、1管10×清洗缓冲液2 400μl、1管10×清洗缓冲液3 400μl、1管10×清洗缓冲液4 800μl。

作为本发明进一步的方案：所述的探针试剂盒包括16管25基因的探针，每管4μl。

作为本发明进一步的方案：所述的接头盒包括16个index接头，每个接头1管，每管4μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明设计合理，结构简单，运用捕获探针技术实现了同时检测25个基因的目的；本发明将同源重组修复缺陷检测相关的25个基因整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒，包含建库试剂盒、杂交试剂盒、探针试剂盒和接头试剂盒。

建库试剂盒，包括包装盒体，建库试剂盒衬垫和试剂管，所述建库试剂盒衬垫设置在建库试剂盒包装盒体的内部并且衬垫上设有容器孔，试剂管包括1管末端修复反应液300μl、1管连接反应液500μl、1管连接酶100μl、1管扩增反应液1000μl、1管扩增引物200μl。

杂交试剂盒，包括包装盒体、杂交试剂盒衬垫、试剂管和试剂瓶，所述的杂交试剂盒衬垫设置在杂交试剂盒包装盒体的内部并且衬垫上设有容器孔，试剂管包括1管封闭液40μl、1管Cot-1 DNA 100μl、1管杂交缓冲液170μl、1管杂交增强液54μl、1管10×清洗缓冲液1 600μl、1管10×清洗缓冲液2 400μl、1管10×清洗缓冲液3 400μl、1管10×清洗缓冲液4 800μl，试剂瓶包括1瓶2×磁珠清洗液5ml。

探针试剂盒，包括包装盒体、探针试剂盒衬垫和试剂管，所述探针试剂盒衬垫设置在探针试剂盒包装盒体的内部并且衬垫上设有容器孔，试剂管包括16管25基因的探针，每管4μl。

接头试剂盒，包括包装盒体、接头试剂盒衬垫和试剂管，所述接头试剂盒衬垫设置在接头试剂盒包装盒体的内部并且衬垫上设有容器孔，试剂管包括16个index接头，每个接头1管，每管4μl。

本试剂盒中所述的特异性接头是指可以通过反应加在目的片段两端的特异性序列标签。试剂盒中，接头有16种，不同的样本添加不同的特异性序列标签。特异性序列标签可以使用二代测序测出，用以区分不同的样本。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

建库试剂盒1盒：

1管300μl/管的末端修复反应液，

1管500μl/管的连接反应液，

1管100μl/管的连接酶，

1管1000μl/管的扩增反应液，

1管200μl/管的扩增引物。

杂交试剂盒1盒：

1管40μl/管的封闭液，

1管100μl/管的Cot-1DNA，

1管170μl/管的杂交缓冲液，

1管54μl/管的杂交增强液，

1瓶5ml/瓶的2×磁珠清洗液，

1管600μl/管的10×清洗缓冲液1，

1管400μl/管的10×清洗缓冲液2，

1管400μl/管的10×清洗缓冲液3，

1管800μl/管的10×清洗缓冲液4。

探针试剂盒1盒：

16管4μl/管的25基因探针。

接头试剂盒1盒：

16种index，每种1管，1管4μl。

本检测试剂盒供16人份检测应用，试剂盒保存温度为-25℃~-15℃。

本发明的具体实施例如下。

1 基因组DNA的提取和片段化。

1.1 基因组DNA提取。对被检者进行组织提取，被检者组织的取材应取自表皮以下的真皮层，包含毛细血管为宜。

1.2 基因组DNA片段化。使用Covaris仪器，并按推荐操作流程进行操作，目标片段大小200-300bp。

2 片段化DNA末端补平。

2.1 反应体系如下。

2.2 反应程序如下。

3接头连接。

3.1 反应体系如下。

3.2 反应程序如下。

3.3 纯化。

注：配制足量新鲜的80%乙醇，现用现配，每个样品每次纯化需要400μl。

3.3.1 加80μl磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀。室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上。

3.3.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。

3.3.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。

3.3.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清。

3.3.5 重复步骤3.3.4，共漂洗两次。

3.3.6 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇。开盖在空气中干燥3-5分钟。

注意事项：确保磁珠只是刚刚晾干，磁珠此时看起来没有光泽。若磁珠没有完全晾干，酒精仍然残留在样品中，酒精会降低 DNA 的洗脱速率，并可能干扰下游反应。

3.3.7 加入22.5μl 灭菌水混匀后静置5分钟。

3.3.8 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。

3.3.9 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，将20μl上清液转移至新的 1.5mL的离心管中。

4 捕获前PCR。

4.1 反应体系如下。

4.2 反应程序如下。

4.3 纯化。

注：配制足量新鲜的80%乙醇，现用现配，每个样品每次纯化需要400μl。

4.3.1 加45μl磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀。室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上。

4.3.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。

4.3.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。

4.3.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清。

4.3.5 重复步骤4.3.4，共漂洗两次。

4.3.6 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇。开盖在空气中干燥3-5分钟。

注意事项：确保磁珠只是刚刚晾干，磁珠此时看起来没有光泽。若磁珠没有完全晾干，酒精仍然残留在样品中，酒精会降低 DNA 的洗脱速率，并可能干扰下游反应；若磁珠晾的太干，磁珠会开裂，建议在步骤4.3.8延长孵育时间使其充分水化，否则会降低DNA的洗脱效果，最终降低产量。

4.3.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入22.5μl水覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠。

4.3.8 室温孵育2分钟。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。

4.3.9 将离心管短暂离心后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清（约5分钟）。若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混匀未吸附的磁珠，使其重新悬浮，继续孵育直至没有磁珠残留在上清中。

4.3.10 小心吸取21μl上清转移至相应编号的新的小PCR管中。

4.3.11 进行Qubit定量。

5杂交捕获。

注：实验过程中用到的试剂在溶解后均需上下颠倒或轻轻震荡，瞬时离心，酶和探针仅需离心，无需震荡。全程放在冰上操作实验。

5.1 准备探针。

采用IDT Inc合成探针，探针区域见附表1。

XGen lockdown probes是水溶液。

a 室温（15-25℃）解冻试剂。

b 将其充分混匀，简单旋转混匀。

5.2 在0.2mL小PCR管中加如下试剂。

a Pool barcoded library的总量为500ng。

Pool barcoded library	500ng
		Cot-1 DNA	5μg
XGen universal Blockers-Tsmix	2μl

b 将上述溶液在抽真空仪里45℃抽干35分钟。

5.3 杂交DNA Capture probe和library。

a 解冻XGen lockdown试剂；2xHybridization Buffer有晶体，65℃加热直至溶解。

b 在抽干的小PCR管里加入。

2×Hybridization Buffer	8.5μl
		Hybridization Buffer Enhancer	2.7μl
Nuclease-free water	1.8μl

先室温放置5分钟，，吹打后再室温静置5分钟。

c 95℃，10分钟，有105℃盖温。结束后立刻拿出放在事先准备好的冰盒上，静置2分钟。

d 立即加入4μl XGen lockdown probe pool，快速吹打混匀10秒，短暂离心，终体积为17μl。

e 65℃，盖温75℃，过夜（至少4小时）。

5.4 杂交后处理。

a 准备1x工作液，在室温4周有效。

简称	试剂	Nuclease-free water
			B	2×Bead wash Buffer：250μl	250μl
I	10×wash Buffer I：30μl	270μl
			II	10×wash Buffer II：20μl	180μl
III	10×wash Buffer III：20μl	180μl
			S	10×stringent wash Buffer：40μl	360μl

如果有颗粒，65℃加热wash Buffer I。

b 将wash Buffer I和stringent wash Buffer进行等分。

5.5 准备Streptavidin Beads 270。

a 在室温平衡Beads 30分钟。

b 充分振荡混匀Beads 15秒。

c 在1.5mL管子中加100μl Beads，将管子放在磁力架上，Beads分层，弃去上清。

d 加入200μl 1×Bead wash Buffer，涡旋10秒，放回磁力架，分层，弃去上清。

e 重复d一遍。

f 加入100μl 1×Bead wash Buffer，振荡。

g 将重悬的100μl Beads加到0.2mLPCR管，放到磁力架，弃去上清，立即进入下一步。

5.6 杂交产物结合到Beads上。

a 将处理后的杂交样本放入有Beads的0.2mLPCR管中，吹打混匀10次。

b 65℃（75℃）45分钟。

c 每隔15分钟，涡旋3秒，2500rpm。

5.7 洗涤磁珠，弃除未结合的DNA。

a 65℃加热，1×Wash Buffer I和1×stringent wash Buffer。

b 加入100μl 1×Wash Buffer I到上述产物的的管子中，短暂涡旋后转移至1.5mL的管子中。

c 将管子放在磁力架上，弃去上清。

d 加入200μl 1×stringent wash Buffer上下吹打10次；金属浴65℃，5分钟；放到磁力架，弃去上清。

e 重复d一次。

f RT洗：加入200μl 1×wash Buffer I，涡旋2分钟，放到磁力架，弃去上清；加入200μl 1×wash Buffer II，涡旋1分钟，放到磁力架，弃去上清；加入200μl 1×washBuffer III，涡旋30秒，放到磁力架，弃去上清。

g 重悬Beads：从磁力架上拿下EP管，加入20μl Nuclease-free water（后带Beads做PCR），上下吹打10次。

6 捕获后PCR。

6.1 反应体系如下。

模板（含磁珠）	20μl
		PCR Primer Mix2	5μl
Amplification Mix3	25μl
		总体积	50μl

6.2 反应程序如下。

6.3 扩增后产物进行Qubit定量。

6.4 纯化。

注：取出磁珠，涡旋震荡混匀，在室温下静置30分钟；磁珠比较粘稠，用移液器时请确保取到足够的体积并缓慢打出；配制足量新鲜的80%乙醇，现用现配，，每个样品每次纯化约需要400μl。

6.4.1 涡旋磁珠使其充分混匀，各加75μl磁珠到上面的产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀。室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上。

6.4.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。

6.4.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠。

6.4.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μl新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清。

6.4.5 重复步骤6.4.4，共漂洗两次。

6.4.6 用2-10μl移液器吸走所有残留乙醇。开盖在空气中干燥3-5分钟。

注意事项：确保磁珠只是刚刚晾干，磁珠此时看起来没有光泽。若磁珠没有完全晾干，酒精仍然残留在样品中，酒精会降低DNA的洗脱效率，并可能干扰下游反应；若磁珠晾的太干，磁珠会开裂，建议在步骤6.4.8延长孵育时间使其充分水化，否则会降低DNA的洗脱效果，最终降低产量。

6.4.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入22μl IDTE覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠。

6.4.8 室温孵育2分钟。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。

6.4.9 将离心管短暂离心后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清（约5分钟）。若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混匀未吸附的磁珠，使其重新悬浮，继续孵育直至没有磁珠残留在上清中。

6.4.10 小心吸取20μl上清转移至相应编号的新的1.5mL离心管中，进行Qubit定量。

杂交捕获后产物可以在-80℃长期保存，等待最终上机测序。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充液应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

附表1探针区域。

Target	# Regions	Size bp	Chr	Start	Stop
						RAD50	26	3939	chr5	131893017	131978056
CHEK1	12	1431	chr11	125496664	125525215
						CHEK2	14	1875	chr22	29083885	29130709
FANCE	10	1611	chr6	35420323	35434122
						MLH1	20	2538	chr3	37035039	37092144
MRE11A	19	2267	chr11	94153291	94225967
						MSH2	17	3216	chr2	47630331	47739573
MUTYH	18	1879	chr1	45794999	45805926
						NBN	17	2761	chr8	90947810	90996842
ATM	62	9188	chr11	108098410	108236235
						POLG	23	3720	chr15	89859982	89876905
ATR	49	10597	chr3	142168271	142297546
						ATRX	37	8169	chrX	76763829	77041487
BARD1	11	2341	chr2	215593400	215674300
						RAD51C	9	1322	chr17	56770005	56811583
RAD51D	11	1166	chr17	33427972	33446632
						BLM	22	4254	chr15	91290623	91358509
SMARCB1	9	1212	chr22	24129455	24176367
						WRN	35	4299	chr8	30915964	31030618
PALB2	13	3561	chr16	23614780	23652478
						ARID1A	24	6858	chr1	27022895	27107247
BAP1	17	2259	chr3	52436304	52443894
						BRIP1	19	3750	chr17	59760657	59938900
BRCA1	23	5658	chr17	41197695	41276113
						BRCA2	26	10257	chr13	32890598	32972907

设计探针区域覆盖所有基因外显子编码区域,能够实现对设计基因的船覆盖。

Claims (8)

1.一种用于同源重组修复缺陷检测的试剂盒，其特征在于：对25个基因进行的深度测序，包括如下基因：ARID1A、BRCA1、BRCA2、POLG、ATR、BRIP1、MSH2、RAD51C、ATM、MLH1、MRE11A、RAD50、ATRX、CHECK1、MUTYH、RAD51D、BAP1、CHECK2、NBN、SMARCB1、BARD1、FANCE、PALB2、WRN、BLM；该试剂盒包含建库试剂盒、杂交试剂盒、探针试剂盒和接头盒。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的组分和含量包括建库试剂盒1盒、杂交试剂盒1盒、探针试剂盒1盒、接头试剂盒1盒，所述检测试剂盒供16人份检测应用，试剂盒的保存温度为-25℃~-15℃。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述建库试剂盒包含可进行DNA的片段化末端修复、连接反应和扩增富集。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述建库试剂盒的组分和含量包括1管300μl/管的末端修复反应液、1管500μl/管的连接反应液、1管100μl/管的连接酶、1管1000μl/管的扩增反应液、1管200μl/管的扩增引物，1个外包盒，1个内衬。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述杂交试剂盒包含可进行DNA序列的杂交捕获和杂交后清洗。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述杂交试剂盒的组分和含量包括1管40μl/管的封闭液、1管100μl/管的Cot-1 DNA、1管170μl/管的杂交缓冲液、1管54μl/管的杂交增强液、1瓶5ml/瓶的2×磁珠清洗液、1管600μl/管的10×清洗缓冲液1、1管400μl/管的10×清洗缓冲液2、1管400μl/管的10×清洗缓冲液3、1管800μl/管的10×清洗缓冲液4，1个外包盒，1个内衬。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针试剂盒的组分和含量包括16管25基因的探针，每管4μl，1个外包盒，1个内衬。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述接头试剂盒的组分和含量包括16个index接头，每个接头1管，每管4μl，1个外包盒、1个内衬。