CN112370474A - 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法 - Google Patents

一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112370474A
CN112370474A CN202011143041.8A CN202011143041A CN112370474A CN 112370474 A CN112370474 A CN 112370474A CN 202011143041 A CN202011143041 A CN 202011143041A CN 112370474 A CN112370474 A CN 112370474A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acanthopanax
extraction
complex enzyme
acanthopanax senticosus
enzymolysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011143041.8A
Other languages
English (en)
Inventor
苏建青
刘瑞雪
褚秀玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaocheng University
Original Assignee
Liaocheng University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaocheng University filed Critical Liaocheng University
Priority to CN202011143041.8A priority Critical patent/CN112370474A/zh
Publication of CN112370474A publication Critical patent/CN112370474A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
    • A61K36/254—Acanthopanax or Eleutherococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：(1)取刺五加茎皮，干燥、粉碎、过筛，于4℃密封备用；(2)取刺五加干粉，按料液比1:10加入pH为5～6.6的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液，浸泡，然后在45～60℃条件下加入50U/g复合酶酶解，复合酶中纤维素酶与果胶酶的酶活比为1～4：2；(3)酶解结束后，按料液比1:10加入无水乙醇，超声提取；(4)提取结束后，冷却、过滤，所得滤液即为所得刺五加提取物。本发明方法操作简便，与传统水提取法等相比，黄酮提取率可提高10％左右。

Description

一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法
技术领域
本发明属于中药提取技术领域，具体的涉及一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法。
背景技术
刺五加(Acanthopanax senticocus Harms)为五加科植物，野生资源丰富，全株均可入药。刺五加富含多种活性成分，主要有苷类、多糖、黄酮、木脂素和酚酸等。借助中药分子机制综合数据库(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID)，共检索到39种刺五加成分，从专业化学数据库中得到66种刺五加化学成分，同时通过查阅大量文献，共检索到241种刺五加化学成分。大量临床试验研究表明:刺五加具有保护心脑血管、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗疲劳、调节神经***等作用。随着国内外对中药活性成分研究的兴起,黄酮类化合物倍受科研人员的关注。黄酮类化合物属植物次生代谢产物，也称为维生素P，是广泛存在于自然界中的属于有机结构的化合物。大量的研究表明，黄酮类化合物具有抗自由基、抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗衰老等药理作用。不同植物中所含黄酮类化合物种类不尽相同，因此，黄酮类化合物提取工艺研究就显得至关重要。
现有技术中，提取刺五加总黄酮的方法有超声波提取、乙醇回流法、罐组式逆流提取、传统水提法、超高压法、机械化学法、微波法。如中国专利文献CN110721210A(CN2019-11095335.5)提供一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用，首次提出对刺五加茎皮部位的黄酮进行超声波辅助乙醇提取工艺，并提供了一套能够较大程度从刺五加茎皮中提取黄酮的工艺，具体为：乙醇浓度50％，提取时间65min，液料比40mL/g，提取温度65℃，吐温80浓度1.8％(体积分数)，提取功率300W的超声波提取工艺，优化后的黄酮提取率为24.75mg/g。但是，超声波提取真正应用与工业时将振子密封于不锈钢盒中，投入罐的中央，一方面不锈钢盒无法太大，否则装配、密封和维修都难以解决，另一方面太小功率达不到，超声波的作用就微乎其微，难以达到应有的效果。
中国专利文献CN1813834A(CN200610016616.3)公开一种治疗脑中风的刺五加叶总黄酮提取物的制备方法。将刺五加叶经除杂，碎断，置于提取罐中，加40％～95％乙醇回流提取2～4次，每次1～3小时，每次加乙醇的体积量L∶刺五加叶重量Kg为6～12∶1，提取液合并，浓缩，滤过，加入已处理好的聚酰胺柱中，以水洗脱至流出液近无色，再以10％～30％乙醇洗脱至流出液淡黄色，弃去上述洗脱液，再以40％～70％乙醇洗脱，收集洗脱液至流出液淡黄色，回收乙醇并浓缩，喷雾干燥，即得本发明的刺五加叶总黄酮提取物。以金丝桃苷计，总黄酮含量为50％～99％。但是，采用回流提取的工艺研究耗费时间太长、且提取效果不佳。
发明内容
为了解决现有技术中存在的提取时间长、提取过程易破坏黄酮本身的生物活性、黄酮取率低等问题，本发明提供一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法。并且通过得到了适合刺五加中总黄酮提取的纤维素酶，该纤维素酶来源于长柄木霉，与来源于里氏木霉的纤维素酶相比，其提取效率更高。为刺五加总黄酮的高效提取技术提供依据，同时促进刺五加总黄酮为主要原料的食品、药品的开发和刺五加产业的经济效益。
酶解法辅助提取的原理是指选用酶类作用于天然药物的细胞壁和细胞间质，破坏其内外部结构，使有效成分扩散的传质阻力减小，从而使提取率增加。酶解法辅助提取技术具有不破坏药物本身的生物活性、缩短提取时间、提高有效成分提取率、而且复合酶法能有选择地改变提取的目标成分，同时增强药物的生理活性。复合酶是指两种及以上酶种类的混合使用，本发明采用纤维素酶与果胶酶的按一定比例混合使用。
刺五加(Acanthopanax senticocus Harms)为五加科植物，野生资源丰富，全株均可入药。刺五加富含多种活性成分，主要有苷类、多糖、黄酮、木脂素和酚酸等。借助中药分子机制综合数据库，共检索到39种刺五加成分，从专业化学数据库中得到66种刺五加化学成分，同时通过查阅大量文献，共检索到241种刺五加化学成分。大量临床试验研究表明:刺五加具有保护心脑血管、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗疲劳、调节神经***等作用。
纤维素酶，纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)(英文：cellulase)是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。
果胶酶，果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)取刺五加茎皮，干燥、粉碎、过筛，于4℃密封备用；
(2)取刺五加干粉，按料液比1:10加入pH为5～6.6的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液，浸泡，然后在45～60℃条件下加入50U/g复合酶酶解，复合酶中纤维素酶、果胶酶的酶活比为1～4：2；
(3)酶解结束后，按料液比1:10加入无水乙醇，超声提取；
(4)提取结束后，冷却、过滤，所得滤液即为所得刺五加提取物。
优选的，步骤(1)中，将刺五加用粉碎机粉粹，粉碎粒径为40～60目，优选为60目。将中药粉碎至合适粒径，使中药与乙醇的反应更加充分，有利于提高中药有效活性成分的浸提效果。
优选的，步骤(1)中所述干燥温度为60℃～70℃。
步骤(2)和步骤(3)中，料液比为1:10，即每克刺五加干粉加10mL的液体。
优选的，步骤(2)中所述纤维素酶来源于长柄木霉。果胶酶来源于黑曲霉。
优选的，步骤(2)中，所述柠檬酸柠檬酸钠的pH为6。
优选的，步骤(2)中，浸泡时间为30min。
优选的，步骤(2)中，所述酶解温度为50℃。当其他条件保持不变时，温度为40℃～50℃时，总黄酮提取率呈稳定快速上升状态；温度为51℃～60℃时，总黄酮提取率缓慢上升甚至呈下降状态。
优选的，步骤(2)中，酶解时间为50～60min，进一步优选为55min。当其他条件保持不变时，时间为45min-55min时，总黄酮提取率呈稳定快速上升状态；温度为56min-65min时，总黄酮提取率缓慢上升甚至呈下降状态。
优选的，步骤(2)中，所述复合酶添加量为50U/g。当其他条件保持不变时，添加量为10U/g-50U/g时，总黄酮提取率呈稳定快速上升状态；添加量为60U/g-200U/g时，总黄酮提取率缓慢上升甚至呈下降状态。实验结果表明，在复合酶添加量为50U/g时，黄酮提取率效果最好。
优选的，步骤(2)中，所述复合酶添加量比例为3:2。
优选的，步骤(3)中，超声提取的条件为：40-50HZ，300-400W，55-65℃的超声波破碎机中超声45～55min。
优选的，步骤(4)中，所述冷却温度为37℃。
本发明的有益效果：
本发明采用来源于长柄木霉的纤维素酶和来源于黑曲霉的果胶酶提取刺五加中的总黄酮，与来源于里氏木霉的纤维素酶相比，提取效率更高，说明来源于长柄木霉的纤维素酶更有利于刺五加中总黄酮的提取。
本发明复合酶中纤维素酶与果胶酶的酶活比为1～4：2时，黄酮的提取效果较高，当两者酶活比为3:2时，刺五加中总黄酮的提取效率最高。
本发明提供的刺五加中总黄酮的提取工艺，操作简便，适合大规模生产，经过试验验证，所得刺五加总黄酮提取物中活性成分提取率较高，与传统水提取法等相比，提取率可提高10％左右。且复合酶提取法具有提取方法简便、条件可控、安全高效的优点，可为刺五加总黄酮的深入研究及应用提供依据。
附图说明
图1所述复合酶添加量对刺五加总黄酮提取率的影响；
图2所述复合酶添加量比例对刺五加总黄酮提取率的影响；
图3所述酶解温度对刺五加总黄酮提取率的影响；
图4所述酶解时间对刺五加总黄酮提取率的影响；
图5所述酶解pH对刺五加总黄酮提取率的影响；
图6所述纤维素酶添加量对刺五加总黄酮提取率的影响；
图7所述果胶酶添加量对刺五加总黄酮提取率的影响；
图8a酶添加量与酶解时间交互作用对总黄酮提取率影响的响应面；
图8b酶添加量与酶解温度交互作用对总黄酮提取率影响的响应面；
图8c酶添加量与酶解pH的交互作用对总黄酮提取率影响的响应面；
图8d酶解时间与酶解温度的交互作用对总黄酮提取率影响的响应面；
图8e酶解时间与酶解pH的交互作用对总黄酮提取率影响的响应面；
图8f酶解温度与酶解pH的交互作用对总黄酮提取率影响的响应面。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
本发明实施例中纤维素酶购自和氏璧生物科技有限公司和阿拉丁试剂有限公司，果胶酶购自阿拉丁试剂有限公司。对比例1所用纤维素酶来源于里氏木霉，实施例1～5和对比例2～3所用纤维素酶均来源于长柄木霉；果胶酶均来源于黑曲霉。
实施例1
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸柠檬酸钠缓冲液调节pH至5.0，浸泡30min，加入复合酶(10U/g、20U/g、50U/g、100U/g、200U/g，复合酶中纤维素酶和果胶酶的酶活比为3：2)，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经40-60目过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
当复合酶添加量为10U/g时，刺五加总黄酮的提取率为32.48mg/g；当复合酶添加量为20U/g时，刺五加总黄酮的提取率为33.32mg/g；当复合酶添加量为50U/g时，刺五加总黄酮的提取率为36.51mg/g；当复合酶添加量为100U/g时，刺五加总黄酮的提取率为34.10mg/g；当复合酶添加量为200U/g时，刺五加总黄酮的提取率为33.80mg/g；实例结果证明在复合酶添加量为50U/g时总黄酮提取率效果最好。结果如图1所示。
使用单一酶进行酶解时，纤维素酶9000U/g时，提取率为30.15mg/g，果胶酶1500U/g，总黄酮的提取率为26.55mg/g。而使用复合酶时，复合酶为50U/g，总黄酮的提取率为35.61mg/g，说明两种酶协同作用，可提高利用率。
实施例2
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过40目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸柠檬酸钠调节pH至5.0，浸泡30min，加入复合酶3000U/g(纤维素酶和果胶酶的酶活比分别为1:1、2:1、1:2、2:3、3:2)，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
当纤维素酶和果胶酶的添加量比例为1:1时，刺五加总黄酮的提取率为32.27mg/g；为2:1时，刺五加总黄酮的提取率为33.07mg/g；为1:2时，刺五加总黄酮的提取率为34.29mg/g；为2:3时，刺五加总黄酮的提取率为32.45mg/g；为3:2时，刺五加总黄酮的提取率为35.25mg/g；实例结果证明在复合酶中纤维素酶和果胶酶的添加量比例为3:2时总黄酮提取率效果最好。结果如图2所示。
实施例3
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸/柠檬酸钠调节pH至5.0，浸泡30min，加入复合酶(纤维素酶和果胶酶的酶活比例3:2)总添加量为50U/g，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取一定时间(45min、50min、55min、60min、65min)。
(3)提取完成，速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
在酶解时间为45min时，刺五加总黄酮的提取率为31.76mg/g；在酶解时间为50min时，刺五加总黄酮的提取率为35.65mg/g；在酶解时间为55min时，刺五加总黄酮的提取率为36.51mg/g；在酶解时间为60min时，刺五加总黄酮的提取率为34.46mg/g；在酶解时间为65min时，刺五加总黄酮的提取率为31.56mg/g；实例结果证明在酶解时间为55min时总黄酮提取率效果最好。结果见图3。
实施例4
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸柠檬酸钠调节pH至5.0，浸泡30min，加入复合酶(纤维素酶和果胶酶的酶活比例3:2)总添加量为50U/g，搅拌均匀，封口，在一定温度下(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液适量离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。结果见图4所示。
在酶解温度为40℃时，刺五加总黄酮的提取率为33.31mg/g；在酶解温度为45℃时，刺五加总黄酮的提取率为35.65mg/g；在酶解温度为50℃时，刺五加总黄酮的提取率为36.51mg/g；在酶解温度为55℃时，刺五加总黄酮的提取率为35.96mg/g；在酶解温度为60℃时，刺五加总黄酮的提取率为34.82mg/g；实例结果证明在酶解时间为50℃时总黄酮提取率效果最好。
实施例5
一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)加入刺五加茎皮烘干，粉碎，过60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液调节pH(5、5.8、6、6.2、6.6)，浸泡30min，加入复合酶(纤维素酶和果胶酶的酶活比例3:2)添加量为50U/g，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
在酶解pH为5时，刺五加总黄酮的提取率为36.51mg/g；在酶解pH为5.8时，刺五加总黄酮的提取率为36.23mg/g；在酶解pH为6时，刺五加总黄酮的提取率为36.82mg/g；在酶解pH为6.2时，刺五加总黄酮的提取率为36.59mg/g；在酶解pH为6.6时，刺五加总黄酮的提取率为36.51mg/g；实例结果证明在酶解pH为6时总黄酮提取率效果最好。结果见图5所示。
对比例1
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液调节pH至5.0，浸泡30min。加入复合酶50U/g，复合酶中纤维素酶和果胶酶的质量比为3：2，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经40-60目过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
测得黄酮提取率为24.47mg/g。
由实施例1和对比例1可以看出，来源于长柄木霉的纤维素酶与果胶酶复合使用提取刺五加中总黄酮时，其提取率远高于来源于里氏木霉的纤维素酶和果胶酶复合使用时对刺五加中总黄酮的提取效率。这可能是由于纤维素酶的来源不同，导致其对于刺五加中木质纤维的分解程度与反应程度的差异，从而使得二者对于刺五加中总黄酮的提取率上有明显差异；而来源于长柄木霉的纤维素酶更有利于刺五加中黄酮的提取。
对比例2
一种纤维素酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过40-60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，pH为5.0，浸泡30min，加入纤维素酶(3000U/g、6000U/g、9000U/g、12000U/g、15000U/g)，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
当纤维素酶添加量为3000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为25.44mg/g；当纤维素酶添加量为6000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为27.55mg/g；当纤维素酶添加量为9000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为30.15mg/g；当纤维素酶添加量为12000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为29.24mg/g；当纤维素酶添加量为15000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为28.35mg/g；实例结果证明在纤维素酶添加量为9000U/g时总黄酮提取率效果最好。如图6所示。
对比例3
一种果胶酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)刺五加茎皮烘干，粉碎，过40-60目筛，得恒重刺五加粉末，室温封存，备用。
(2)准确称取2.0g粉末于100mL锥形瓶，加入20mL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液调节pH至5.0，浸泡30min，加入果胶酶(100U/g、500U/g、1500U/g、3000U/g、6000U/g)，搅拌均匀，封口，在50℃恒温下提取55min。
(3)提取完成，迅速向锥形瓶加入20mL的无水乙醇，转至超声波在40HZ，300W，55℃的条件下超声55min。
(4)冷却，取溶液离心，上清液经过滤器过滤，得刺五加提取物，4℃冰箱保存，备用。
当果胶酶添加量为100U/g时，刺五加总黄酮的提取率为24.77mg/g；当果胶酶添加量为500U/g时，刺五加总黄酮的提取率为25.62mg/g；当果胶酶添加量为1500U/g时，刺五加总黄酮的提取率为26.55mg/g；当果胶酶添加量为3000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为25.03mg/g；当纤维素酶添加量为6000U/g时，刺五加总黄酮的提取率为24.67mg/g；实例结果证明在纤维素酶添加量为1500U/g时总黄酮提取率效果最好。结果如图7所示。
图8a～f据经Design-Expert.8.0.6软件设计处理。响应面试验设计以及结果见表1，得到回归模型的方差分析，结果见表2。
响应面可反映各项因素之间的影响程度，其中曲面越陡峭，影响越大。图8a～f反映了四个因素的交互作用对刺五加总黄酮提取率的影响。可见，复合酶的添加量与复合酶酶解温度、复合酶酶解时间与复合酶酶解温度对刺五加黄酮提取率的影响显著(P<0.05)；复合酶的添加量与复合酶酶解时间、复合酶的添加量与复合酶酶解pH值、复合酶酶解时间与复合酶酶解pH值和复合酶酶解温度与复合酶酶解pH值对刺五加总黄酮提取率的影响不显著(P>0.05)。根据对刺五加总黄酮提取率的二次多项回归方程求解，得到最佳提取工艺条件为:复合酶的添加量为69.60U/g、复合酶酶解时间为59.80min、复合酶酶解温度为53.70℃，复合酶酶解pH值为6.05，在此优化条件下，总黄酮提取率理论上可达36.90mg/g。
表1响应面试验设计及结果
Figure BDA0002738786220000101
Figure BDA0002738786220000111
Figure BDA0002738786220000121
表2响应面二次模型的方差分析
Figure BDA0002738786220000122
由表1和表2可知：响应面试验设计以及结果见表1。表中的实验数据经Design-Expert.8.0.6软件设计处理，得到回归模型的方差分析，结果见表2。经非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型如下：
Y＝36.69+0.41A+0.37B+0.072C+0.066D+0.095AB+0.17AC-0.12AD+0.16BC+0.045BD+0.065CD-0.51A2-0.50B2-0.32C2
由表2可知，该试验所建立的数学模型具有显著性(P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，校正决定系数R2为0.9239,表明有92.39％的刺五加总黄酮提取率能由此模型进行解释；方程的决定系数R2为0.9620，表明刺五加总黄酮提取率的变化而建立的方程对实验的拟合程度较好。各自变量因素对刺五加总黄酮提取率的影响如下：一次项因素A(复合酶的添加量)和B(复合酶酶解时间)，二次项因素A2、B2、C2、D2对刺五加黄酮提取率的影响均极显著(P<0.01)；交互项因素AC(复合酶的添加量与复合酶酶解温度)和BC(复合酶酶解时间与复合酶酶解温度)对刺五加黄酮提取率的影响显著(P<0.05)；一次项因素C(复合酶酶解温度)、一次项因素D(复合酶酶解pH值)，交互项因素AB(复合酶的添加量与复合酶酶解时间)、AD(复合酶的添加量与复合酶酶解pH值)、BD(复合酶酶解时间与复合酶酶解pH值)和CD(复合酶酶解温度与复合酶酶解pH值)对刺五加黄酮提取率的影响不显著(P>0.05)。模型的F值对响应值的影响成正比且随F值越大对响应值的影响也越大。可见，各因素对刺五加总黄酮提取率的影响程度为：A(复合酶的添加量)>B(复合酶酶解时间)>C(复合酶酶解温度)>D(复合酶酶解pH值)。

Claims (10)

1.一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取刺五加茎皮，干燥、粉碎、过筛，于4℃密封备用；
(2)取刺五加干粉，按料液比1:10加入pH为5～6.6的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液，浸泡，然后在45～60℃条件下加入50U/g复合酶酶解，复合酶中纤维素酶、果胶酶的酶活比为1～4：2；
(3)酶解结束后，按料液比1:10加入无水乙醇，超声提取；
(4)提取结束后，冷却、过滤，所得滤液即为所得刺五加提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶来源于长柄木霉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将刺五加用粉碎机粉粹，粉碎粒径为40～60目。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述柠檬酸柠檬酸钠的pH为6。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解温度为50℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解时间为55min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合酶添加量为50U/g。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合酶中纤维素酶和果胶酶的酶活比例为3:2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浸泡时间为30min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，超声提取的条件为：40-50HZ，300-400W，55-65℃的超声波破碎机中超声45～55min。
CN202011143041.8A 2020-10-23 2020-10-23 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法 Pending CN112370474A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011143041.8A CN112370474A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011143041.8A CN112370474A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112370474A true CN112370474A (zh) 2021-02-19

Family

ID=74580739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011143041.8A Pending CN112370474A (zh) 2020-10-23 2020-10-23 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112370474A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116115675A (zh) * 2022-12-07 2023-05-16 浙江工业大学 一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102977164A (zh) * 2012-11-05 2013-03-20 河南牧翔动物药业有限公司 一种刺五加叶中金丝桃苷的酶辅助提取工艺
CN110721210A (zh) * 2019-11-11 2020-01-24 聊城大学 一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102977164A (zh) * 2012-11-05 2013-03-20 河南牧翔动物药业有限公司 一种刺五加叶中金丝桃苷的酶辅助提取工艺
CN110721210A (zh) * 2019-11-11 2020-01-24 聊城大学 一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王向东等: "《发酵食品工艺》", 31 January 2011, 中国计量出版社 *
陈娜等: "产纤维素酶真菌混合发酵研究进展", 《中国土壤与肥料》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116115675A (zh) * 2022-12-07 2023-05-16 浙江工业大学 一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法
CN116115675B (zh) * 2022-12-07 2023-12-05 浙江工业大学 一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103981054B (zh) 一种生物酶酿造油茶酒的方法
CN1281628C (zh) 一种木耳多糖的提取方法
CN103013936B (zh) 复合酶提取花色素的方法及其复合酶制剂
CN102224879B (zh) 香菇多肽的制备方法和用途
CN104757564B (zh) 一种利用花生壳制备膳食纤维的方法
CN103193751A (zh) 一种连续提取葡萄籽中有效成分的工艺方法
CN102199225B (zh) 一种复合酶法制备茶树菇水解液的方法
CN112521523B (zh) 一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法
CN106632205A (zh) 一种从云南松树皮中提取原花青素的方法
CN101659917B (zh) 块菌酒生产工艺
CN104774228A (zh) 一种从柿子中制备柿单宁的方法
CN104788511A (zh) 一种从柿子中制备小分子单宁含量多的柿单宁的方法
CN108048495B (zh) 一种白藜芦醇的生物提取方法
CN110734809A (zh) 一种沉香精油的提取方法
CN112370474A (zh) 一种复合酶辅助超声提取刺五加总黄酮的方法
CN110882285A (zh) 桑黄中活性物质的高效制备方法
CN102492666A (zh) 一种酶制剂及其用于提取葛根总黄酮的应用和方法
CN111705091B (zh) 一种萝卜硫素提取物的制备方法
CN103695152B (zh) 提取沙棘果油的酶法-超临界co2萃取联用方法
CN108567836A (zh) 一种从山楂皮渣中联合提取分离黄酮和多糖的方法
CN109010505A (zh) 一种枸杞的生物酶解方法
CN106811303B (zh) 一种银杏外种皮同时提取精油和果胶的方法
CN109529404B (zh) 利用重瓣红玫瑰花渣制备多酚提取物的方法
CN101993902A (zh) 一种芦笋及其下脚料中黄酮类化合物的提取方法
CN104069191A (zh) 一种水辣蓼总黄酮的提取工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210219