CN112362711B - 一种微生物检测装置及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物检测装置及检测方法，该装置包括从上到下依次固定连接的盖板、基板一、基板二和底板，盖板一端设置有样品入口；基板一上设置有相连通的微流体通道一和微生物腔室，微流体通道一与样品入口相连通；基板二上设置有相连通的分离腔室、微流体通道二和反应腔室，微生物腔室和分离腔室之间固定连接有微生物分离膜，反应腔室内固定连接有微电极一；底板上设置有缓冲腔室，缓冲腔室和反应腔室之间固定连接有敏感元件，缓冲腔室内固定连接有微电极二，缓冲腔室两侧分别设置有缓冲液入口和缓冲液出口，缓冲液入口设置于反应腔室下方。该装置可有效解决现有的装置存在的灵敏度低，操作复杂费时的问题。

Description

一种微生物检测装置及检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种微生物检测装置及检测方法。
背景技术
微生物广泛存在于自然界中，病原微生物是指能引起感染的微生物的总称，也称病原体，主要包括病毒、细菌、真菌、支原体和朊病毒等，其中，病毒和细菌对人类的威胁最大。由致病细菌引起的食物及水源等安全事件严重威胁着人类的生命健康，全球54.3％的突发性感染疾病是由细菌或立克次氏体引起的。
现有技术中所采用的微生物的检测方法主要为微生物培养法，虽然目前市场上存在多种微生物培养装置，但这些装置需要较长的培养时间，在快速检测应用领域，受到严重制约。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种微生物检测装置及检测方法，该装置可有效解决现有的装置存在的灵敏度低，操作复杂费时的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种微生物检测装置，包括从上到下依次固定连接的盖板、基板一、基板二和底板，盖板一端设置有样品入口；
基板一上设置有相连通的微流体通道一和微生物腔室，微流体通道一与样品入口相连通；
基板二上设置有相连通的分离腔室、微流体通道二和反应腔室，微生物腔室和分离腔室之间固定连接有微生物分离膜，反应腔室内固定连接有微电极一，反应腔室内设置有样品出口；
底板上设置有缓冲腔室，缓冲腔室和反应腔室之间固定连接有敏感元件，缓冲腔室内固定连接有微电极二，缓冲腔室两侧分别设置有缓冲液入口和缓冲液出口，缓冲液入口设置于反应腔室下方。
上述方案所产生的有益效果为：盖板、基板一、微生物分离膜、基板二、敏感元件和底板之间粘结压合固定；微生物通道一和微生物通道二用于液体样本流动，微生物分离膜用于分离一定尺寸范围内的待检微生物，初步实现对体积较大的颗粒物和生物细胞等进行过滤，达到样本预处理的目的，反应腔室和缓冲腔室用于容纳待检测生物样本和电解质缓冲液，敏感元件分别与反应腔室和缓冲腔室内的待检测液体接触，反应腔室和缓冲腔室内分别设置有微电极一和微电极二，使得反应腔室与缓冲腔室之间构成电化学检测池，当含有待检测微生物的液体接触敏感元件时，形成纳米通道空间阻塞效应，产生电信号的变化，通过电信号的变化大小确定待检测样本的微生物含量。
进一步地，微生物分离膜上的孔径为200nm-2μm。
进一步地，敏感元件由大孔膜和小孔膜制成，大孔膜上的孔径为50-900nm，小孔膜上的孔径为1-500nm。
上述方案所产生的有益效果为：微生物分离膜和敏感元件上的孔径范围较宽，使得该装置可适用于多种尺寸大小的微生物的快速检测，具体操作时，可根据需要检测的微生物的种类选择所需孔径的微生物分离膜和敏感元件，提高该装置的适用性。
进一步地，大孔膜的材质为多晶硅、氮化硅、阳极氧化铝、聚碳酸酯、碳纳米管或石墨烯/氧化石墨烯。
进一步地，小孔膜的材质为介孔碳、介孔硅/介孔二氧化硅或石墨烯/氧化石墨烯。
进一步地，微生物分离膜的材质为对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、多孔硅或聚偏氟乙烯。
进一步地，微电极一和微电极二的材质为金属电极、金属/金属氧化物电极、碳电极或玻碳电极。
进一步地，微流体通道一和微流体通道二的截面形状为圆形、矩形、半圆形、半椭圆形或不规则多边形。
上述方案所产生的有益效果为：微流体通道一和微流体通道二用于待检测样本流通。
进一步地，微生物腔室、分离腔室、反应腔室和缓冲腔室的形状为圆柱形、正方体形或长方体形。
上述方案所产生的有益效果为：微生物腔室、分离腔室、反应腔室和缓冲腔室用于将待检测微生物样本进行暂存。
进一步地，敏感元件的制备方法为：
(1)将具有支撑介质PMMA的小孔膜利用大孔膜在去离子水中进行捕获，经干燥后完成小孔膜与大孔膜的紧密复合；
(2)将上述复合后的大孔膜与小孔膜置于丙酮中，以去除小孔膜上的支撑介质PMMA，完成敏感元件(14)的制备。
一种微生物检测方法，采用上述微生物检测装置进行检测，具体检测过程为：
(1)将待检测微生物的抗体或者适配体修饰在敏感元件上，具体操作为将敏感元件通过双氧水进行羟基化处理后，置于5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮或乙醇溶液中进行硅烷化交联以形成氨基化的敏感元件表面，并将一定浓度的待检测微生物的抗体或者适配体孵育至敏感元件表面，以完成敏感元件的功能化修饰；
(2)将含有电解质缓冲液的待检测的微生物样本通过样品入口加入微流体通道一内，微生物样本沿着微流体通道一进入微生物腔室内，并经过微生物分离膜分离后进入分离腔室内；
(3)分离腔室内的微生物样本沿着微流体通道二进入反应腔室内与敏感元件接触后经过样品出口排出，缓冲腔室内经缓冲液入口注入缓冲液，缓冲腔室内缓冲液液面与敏感元件接触，然后通过微电极一和微电极二检测电流信号。
上述方案所产生的有益效果为：通过特定孔径的微生物分离膜将一定尺寸的微生物样本筛选分离至反应腔室内，实现微生物的快速预处理；将待检测的微生物抗体或者适配体修饰在敏感元件上，当待检测样本中的待检测微生物接触敏感元件时，敏感元件上的特异性分子可以选择性地识别和捕获待检微生物，使得敏感元件上形成纳米通道空间阻塞效应，导致离子迁移率或电子转移速率极大变化，从而根据产生的电信号变化来确定待检测样本中的微生物含量。
本发明所产生的有益效果为：
1、本发明的装置中利用注射器等装置将待检测微生物样本通过样品入口注入，并给予一定的压力，使得待检测微生物样本通过微生物分离膜，实现了微生物的快速分离，便于后续检测进行。
2、本发明中将含有多孔纳米通道结构的敏感元件引入电化学传感检测中，且该纳米通道结构具有典型的不对称性，通过在其上部修饰特异性识别功能的分子来选择性识别与捕获待检测微生物，显著增强纳米空间阻塞效应，使得反应腔室和缓冲腔室之间的跨膜电流变化显著，提高了微生物分析检测的特异性，极大地提高检测的灵敏度，提高了微生物的分析速度，可满足微生物的快速灵敏分析检测应用的需求。
附图说明
图1为本发明的装置图；
图2基板一的截面剖视图；
图3基板二的截面剖视图；
图4电流扫描图；
附图标记：1、盖板；2、基板一；3、基板二；4、底板；5、样品入口；6、微流体通道一；7、微生物腔室；8、分离腔室；9、微流体通道二；10、反应腔室；11、微生物分离膜；12、微电极一；13、缓冲腔室；14、敏感元件；15、微电极二；16、缓冲液入口；17、缓冲液出口；18、样品出口。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明的一个实施例中，如图1-3所示，提供了一种微生物检测装置，包括从上到下依次固定连接的盖板1、基板一2、基板二3和底板4，盖板一2端设置有样品入口5；基板一2上设置有相连通的微流体通道一6和微生物腔室7，微流体通道一6与样品入口5相连通；基板二3上设置有相连通的分离腔室8、微流体通道二9和反应腔室10，微生物腔室7和分离腔室8之间固定连接有微生物分离膜11，优化地，微生物分离膜11上的孔径为200nm-2μm；优化地，微生物分离膜11的材质为对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、多孔硅或聚偏氟乙烯。
反应腔室10内固定连接有微电极一12，反应腔室10内设置有样品出口18；底板4上设置有缓冲腔室13，缓冲腔室13和反应腔室10之间固定连接有敏感元件14，敏感元件14由大孔膜和小孔膜制成，大孔膜上的孔径为50-900nm，小孔膜上的孔径为1-500nm。优化地，大孔膜的材质为多晶硅、氮化硅、阳极氧化铝、聚碳酸酯、碳纳米管或石墨烯/氧化石墨烯。优化地，小孔膜的材质为介孔碳、介孔硅/介孔二氧化硅或石墨烯/氧化石墨烯。缓冲腔室13内固定连接有微电极二15，缓冲腔室13两侧分别设置有缓冲液入口16和缓冲液出口17，缓冲液入口16设置于反应腔室10下方。优化地，微电极一12和微电极二15的材质为金属电极、金属/金属氧化物电机、碳电极或玻碳电极。
一种微生物检测方法，采用上述微生物检测装置进行检测，具体检测过程为：
(1)将待检测微生物的抗体或者适配体修饰在敏感元件上，具体操作为将敏感元件通过双氧水进行羟基化处理后，置于5％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮或乙醇溶液中进行硅烷化交联以形成氨基化的敏感元件表面，并将一定浓度的待检测微生物的抗体或者适配体孵育至敏感元件表面，以完成敏感元件的功能化修饰；
(2)将含有电解质缓冲液的待检测的微生物样本利用注射器等装置通过样品入口注入微流体通道一内，在推注过程中实现对微流体通道一内进行加压的目的，促进微生物样本液体在该装置内进行流动，微生物样本沿着微流体通道一进入微生物腔室内，并经过微生物分离膜分离后进入分离腔室内；
(3)分离腔室内的微生物样本沿着微流体通道二进入反应腔室内与敏感元件接触后经过样品出口排出，缓冲腔室内经缓冲液入口注入缓冲液，缓冲腔室内缓冲液液面与敏感元件接触，在反应腔室内敏感元件对微生物样本进行识和捕获作用，形成纳米通道空间阻塞效应，根据产生的电信号变化定量检测所述微生物样本中微生物的含量。
采用上述装置和方法对不同的待检测样本中的微生物进行检测，由于敏感元件的材质有多种，现在实施例中对不同敏感元件的制备方法进行阐述，具体如下：
实施例1
敏感元件由小孔膜和大孔膜制成，小孔膜为介孔硅膜，大孔膜为阳极氧化铝膜(AAO)；
小孔膜介孔硅膜的制备方法如下：通过溶液生长法制备获得，具体制备方法为：选择2cm×2cm的ITO玻璃玻璃作为介孔硅膜的生长基底，首先将ITO玻璃玻璃用1mol/L的NaOH乙醇溶液、丙酮溶液、乙醇溶液和去离子水依次超声洗涤15分钟，其次将清洗好的ITO玻璃玻璃浸入含有70mL水、30mL乙醇、10μL氨水、0.16g十六烷基三甲基溴化铵和80μL硅酸四乙酯的混合溶液中，并在60℃条件下反应20h；反应完成后，将ITO玻璃玻璃置于100℃条件下烘干过夜；随后，将生长好的介孔硅膜与ITO玻璃玻璃置于0.1mol/L的HCl乙醇溶液中以去除介孔硅膜内壁中的十六烷基三甲基溴化铵表面活性剂；在具有介孔硅膜的ITO玻璃玻璃上旋涂一滴PMMA溶液(5％)，在室温下溶剂蒸发后置于115℃的烘箱中烘烤20分钟；随后，将其置于2mol/L的HCl溶液中过夜去除ITO层，得到以PMMA作为支撑介质的介孔硅膜，最后将其转移至去离子水中洗净待用，最终得到小孔膜。
敏感元件的制备方法为：大孔膜的阳极氧化铝膜(AAO)可在市场上定制获得。首先，将大孔膜置于沸腾的30％双氧水溶液中进行羟基化处理，目的是在大孔膜内壁表面形成-OH官能团，随后将大孔膜置于10％的APTCS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)丙酮溶液中反应过夜，并在120℃下干燥2h以形成交联的硅烷层；其次，以大孔膜作为支撑介质在去离子水中对小孔膜进行捕获，并经室温干燥1h，100℃干燥2h完成大孔膜与小孔膜的复合以形成多层复合膜结构的纳米通道膜，随后将小孔膜的支撑介质PMMA采用丙酮溶解去除；最后，将适宜浓度的待检测微生物的抗体或适配体孵育至所述多层复合膜结构的纳米通道膜内壁表面，以形成具有特异性功能识别分子的所述敏感元件。
实施例2
敏感元件由介孔硅膜的小孔膜与多孔氮化硅膜(p-SiN)的大孔膜制成；
小孔膜介孔硅膜制备过程：通过溶液生长法制备获得，具体制备方法为：选择2cm×2cm的ITO玻璃玻璃作为介孔硅膜的生长基底，首先将ITO玻璃玻璃用1mol/L的NaOH乙醇溶液、丙酮溶液、乙醇溶液和去离子水依次超声洗涤15分钟，其次将清洗好的ITO玻璃×玻璃浸入含有70mL水、30mL乙醇、10μL氨水、0.16g十六烷基三甲基溴化铵和80μL硅酸四乙酯的混合溶液中，并在60℃条件下反应14h；反应完成后，将ITO玻璃置于100℃条件下烘干过夜；随后，将生长好的介孔硅膜与ITO玻璃置于0.1mol/L的HCl乙醇溶液中以去除介孔硅膜内壁中的十六烷基三甲基溴化铵表面活性剂；在具有介孔硅膜的ITO玻璃上旋涂一滴PMMA溶液(6％)，在室温下蒸掉溶剂后置于120℃的烘箱中烘烤15～20分钟；随后，将其置于2mol/L的HCl溶液中过夜去除ITO层，得到以PMMA作为支撑介质的介孔硅膜，最后将其转移至去离子水中洗净待用，最终得到小孔膜的介孔硅膜。
敏感元件的制备方法如下：大孔膜的多孔氮化硅薄膜(p-SiN)可在市场上定制获得。将大孔膜置于沸腾的30％双氧水溶液中进行羟基化处理，目的是在大孔膜内壁表面形成-OH官能团，随后将大孔膜置于10％的APTCS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)丙酮溶液中反应过夜，并在120℃下干燥2h以形成交联的硅烷层；其次，以大孔膜作为支撑介质在去离子水中对小孔膜进行捕获，并经室温干燥1h，100℃干燥2h完成大孔膜与小孔膜的复合以形成多层复合膜结构的纳米通道膜，随后将小孔膜的支撑介质PMMA采用丙酮溶解去除；最后，将适宜浓度的待检测微生物的抗体或适配体孵育至所述多层复合膜结构的纳米通道膜内壁表面，以形成具有特异性功能识别分子的所述敏感元件。
实施例3
敏感元件由小孔膜的介孔碳膜与大孔膜的阳极氧化铝膜制成；
小孔膜介孔碳膜的制备方法：该介孔碳膜主要在硅片上合成，以酚醛树脂为碳前驱体，三嵌段聚合物F127作为模板剂，采用溶液挥发自组装法制备有序的介孔碳膜，其具体制备过程如下：(1)将硅片(20mm×20mm)置于90℃的食人鱼酸(浓硫酸与30％双氧水的体积比为2:1)中清洗30分钟以去除硅片表面有机物或氧化层；(2)以NaOH为催化剂，苯酚和甲醛为原料(质量比1:6:10)合成水溶性的酚醛树脂溶液，并以无水乙醇为溶剂配制成质量分数为20％的酚醛树脂溶液；(3)在清洗后的硅片表面旋涂一滴包含0.06g的酚醛树脂溶液，0.03g Pluronic F127表面活性剂和0.24g乙醇的混合溶液，室温下缓慢蒸发6h后转移至105℃下生长24h；(4)将上述反应后的硅片置于氮气保护下的600℃的碳化炉中反应3h(氮气流速60cm3/分钟，升温速度1℃/分钟)，最后获得以硅片作为支撑介质的介孔碳膜；(5)在上述生长在硅片上的介孔碳膜表面旋涂一滴PMMA溶液(8％)，在室温下蒸掉溶剂后置于110℃的烘箱中烘烤20分钟，随后将其置于10％的KOH溶液中反应6h，目的是从硅片上剥离介孔碳膜获得以PMMA为支撑介质的介孔碳膜，最后将其转移至去离子水中切片待用。
敏感元件的制备：大孔膜的阳极氧化铝膜(AAO)可在市场上定制获得。首先，将大孔膜置于沸腾的30％双氧水溶液中进行羟基化处理，目的是在大孔膜内壁表面形成-OH官能团，随后将大孔膜置于10％的APTCS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)丙酮溶液中反应过夜，并在120℃下干燥2h以形成交联的硅烷层；其次，以大孔膜作为支撑介质在去离子水中对小孔膜进行捕获，并经室温干燥1h，100℃干燥2h完成大孔膜与小孔膜的复合以形成多层复合膜结构的纳米通道膜；最后，将适宜浓度的待检测微生物的抗体或适配体孵育至所述多层复合膜结构的纳米通道膜内壁表面，以形成具有特异性功能识别分子的所述敏感元件。
试验例
以实施例1中的制备方法制备敏感元件为例，采用该敏感元件和其他结构依次组装制备微生物检测装置，并对铜绿假单胞菌进行定量检测：
(1)功能化敏感元件的制备
将体积为20μL浓度为10μM的铜绿假单胞菌适配体滴涂至实施例1中的敏感元件上，室温下孵育4h；孵育完成后，采用PBS缓冲溶液(pH 7.4)清洗三次，随后向上述敏感元件表面滴涂20μL 1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液用以封阻敏感元件非特异性吸附位点；BSA溶液孵育1h后，采用PBS缓冲溶液清洗敏感元件三次，即完成了功能化敏感元件的制备。
(2)铜绿假单胞菌的定量检测
本试验例中微生物检测装置的微电极一采用自制的铂丝电极，微电极二采用三电极体系的丝网印刷电极(其包括金工作电极，铂对电极和银/氯化银辅助电极)；在进行微生物检测之前，将PBS缓冲溶液通过缓冲液入口注入缓冲腔室内；随后以PBS溶液为电解质，[Ru(NH3)6]3+为电化学探针，将含不同待检测浓度的铜绿假单胞菌的混合溶液分别通过微泵以20μL/分钟的流速注入样品入口；微生物的电化学定量检测采用微电极一为对电极，微电极二为工作电极和辅助电极，通过扫描偏置电压为0V时的离子电流与时间的曲线来对待检测微生物进行定量分析，其结果如图4(左)所示；同时经敏感元件30分钟稳定渗透后，以微电极二的工作电极、铂电极和银/氯化银电极进行DPV信号扫描，其结果如图4(右)所示。
图4(左)表明离子电流随着目标细菌浓度的增大呈逐渐减小的趋势；图4(右)表明电化学探针经敏感元件30分钟稳定渗透后，其在缓冲腔室的DPV信号随着敏感元件捕获目标细菌浓度的增大而呈逐渐减小的趋势；图4整体表明敏感元件在捕获目标细菌后其空间阻塞效应明显增大，从而导致离子电流和探针DPV信号逐渐降低，通过测量溶液中离子穿越敏感元件产生的离子电流和DPV信号可对目标细菌进行定量分析。

Claims (8)

1.一种微生物检测装置，其特征在于，包括从上到下依次固定连接的盖板（1）、基板一（2）、基板二（3）和底板（4），所述盖板（1）端部设置有样品入口（5）；
所述基板一（2）上设置有相连通的微流体通道一（6）和微生物腔室（7），所述微流体通道一（6）与所述样品入口（5）相连通；
所述基板二（3）上设置有相连通的分离腔室（8）、微流体通道二（9）和反应腔室（10），所述微生物腔室（7）和分离腔室（8）之间固定连接有微生物分离膜（11），所述反应腔室（10）内固定连接有微电极一（12），所述反应腔室（10）内设置有样品出口（18）；
所述底板（4）上设置有缓冲腔室（13），所述缓冲腔室（13）和反应腔室（10）之间固定连接有敏感元件（14），所述缓冲腔室（13）内固定连接有微电极二（15），所述缓冲腔室（13）两侧分别设置有缓冲液入口（16）和缓冲液出口（17），所述缓冲液入口（16）设置于所述反应腔室（10）下方；所述敏感元件（14）由大孔膜和小孔膜制成，所述大孔膜上的孔径为50-900nm，所述小孔膜上的孔径为1-500nm。
2.根据权利要求1所述的微生物检测装置，其特征在于，所述微生物分离膜（11）上的孔径为200nm-2µm。
3.根据权利要求1所述的微生物检测装置，其特征在于，所述大孔膜的材质为多晶硅、氮化硅、阳极氧化铝、聚碳酸酯、碳纳米管或石墨烯/氧化石墨烯。
4.根据权利要求3所述的微生物检测装置，其特征在于，所述小孔膜的材质为介孔碳、介孔硅/介孔二氧化硅或石墨烯/氧化石墨烯。
5.根据权利要求1或2所述的微生物检测装置，其特征在于，所述微生物分离膜（11）的材质为对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、多孔硅或聚偏氟乙烯。
6.根据权利要求1所述的微生物检测装置，其特征在于，所述微电极一（12）和微电极二（15）的材质为金属电极、金属/金属氧化物电极、碳电极或玻碳电极。
7.根据权利要求1所述的微生物检测装置，其特征在于，所述敏感元件（14）的制备方法为：
（1）将具有支撑介质PMMA的小孔膜通过大孔膜在去离子水中进行捕获，经干燥后完成小孔膜与大孔膜的紧密复合；
（2）将上述复合后的大孔膜与小孔膜置于丙酮中，以去除小孔膜上的支撑介质PMMA，完成敏感元件（14）的制备。
8.一种微生物检测方法，其特征在于，采用权利要求1-7中任一项所述微生物检测装置进行检测，具体检测过程为：
（1）将待检测微生物的抗体或者适配体修饰在敏感元件（14）上；
（2）将含有电解质缓冲液的待检测微生物样本通过样品入口（5）加入微流体通道一（6）内，微生物样本沿着微流体通道一（6）进入微生物腔室（7）内，并经过微生物分离膜（11）分离后进入分离腔室（8）内；
（3）分离腔室（8）内的微生物样本沿着微流体通道二（9）进入反应腔室（10）内与敏感元件（14）接触后经过样品出口（18）排出，缓冲腔室（13）内经缓冲液入口（16）注入缓冲液，缓冲腔室（13）内缓冲液液面与敏感元件（14）接触，然后通过微电极一（12）和微电极二（15）检测电流信号。
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