CN111690748A - 使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测方法，涉及基因检测技术领域，本发明提供的探针组，能够通过高通量测序同时捕获BAT26、BAT25、BAT‑34c4、BAT‑40、D2S123、D5S346、MONO‑27、NR21、NR24、NR27和D17S250这11个用于评价微卫星不稳定的位点，准确评估待测对象的微卫星不稳定状态，为肿瘤患者的预后及临床治疗方案的制定提供理论基础及指导。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测方法。
背景技术
微卫星是指人类基因组中普遍存在的短串联重复片段，一般重复单元为1至5个碱基，重复单元的重复次数从10至几十次不等。大多数微卫星序列位于基因组的非编码区。
DNA修复***是与肿瘤的发生密切相关的***。研究显示，经过多次的体细胞突变后，才能导致细胞从正常细胞向肿瘤细胞的转变。大约有50％以上的肿瘤中，均能检测到DNA修复和复制基因的突变。当DNA错配修复***功能正常时，如果微卫星重复序列发生复制错误，错配修复蛋白MutS的同系物会形成异源二聚体(hMutSα或hMutSβ)，两个异源二聚体可共同识别新合成的DNA核苷酸链上的碱基错配，并以ATP依赖的形式与错配位点结合。而hMLHl分别与hPMSl、hPMS2、hMLH3结合成MutL二聚体，在EX01和PCNA蛋白的作用下与DNA聚合酶结合，从而删除错配的碱基，然后由DNA连接酶将DNA链连接起来，从而完成错配碱基的DNA核酸链的修复。如果错误没有被修复，这些错误可能会导致永久性的突变，从而促进肿瘤发生。错配修复***通常会使复制精确性提高到1000～10000倍。错配修复缺陷细胞引起与微卫星不稳定(MSI)相关的基因组的不稳定性，患者肿瘤易感性会增加。
在1997年，为了便于研究中的比较，国家癌症研究所(Nmional CancerInstitute，NCI)推荐一组5个微卫星标记，称为贝塞斯达(Bethesda)标记，包括两个单核苷酸重复序N(BaT-25和BAT-26)和三个双核苷酸重复序列(D5S346，D2S123和D17S250)131最初选择的微卫星位点是高度多变的，并且在会议上确定了MSI的定义标准，样品中存在两个或两个以上的标记不稳定被定义为MSI-H，而那些有一个标志不稳定的被定义为MSI-L，没有标记不稳定则为MSS，当标记点超过5个时，则以>30％位点不稳定定义为MSI-H。后来Suraweera et al研究发现了一组5个单核苷酸重复序列(BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-22和NR-24)。
研究表明，MSI检测在肿瘤免疫治疗中也起到了重要的指导作用。2017年5月PD-1抗体药物(Pembrolizumab(Keytruda))获批治疗所有具有微卫星高度不稳定性(MSI-H)或者错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，成为第一个“广谱”抗肿瘤药物。
近期Clinical CancerResearch上一项研究表明，通过液体活检检测MSI状态，有助于为肿瘤患者的预后及临床治疗方案的制定提供指导。
现有的MSI检测主要使用方法是荧光PCR检测，即使用特异性引物，同时扩增多个与微卫星标记相关的位点，扩增产物经过毛细管电泳进行分析与正常组织进行比对，查看是否有无迁移率的改变，从而判定MSI的状态。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供一种微卫星不稳定的检测方法。
本发明提供了一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组，所述探针组包括同时捕获下述位点的探针：BAT26、BAT25、BAT-34c4、BAT-40、D2S123、D5S346、MONO-27、NR21、NR24、NR27和D17S250。
进一步的，所述探针包括正义链探针；
优选地，捕获BAT-34c4、BAT-40、BAT25、MONO-27、NR21、BAT26、D5S346、D2S123、NR24、D17S250和NR27位点的正义链探针依次具有如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.11-20、SEQ ID NO.21-32、SEQ ID NO.33-42、SEQ ID NO.43-53、SEQ ID NO.54-62、SEQ ID NO.63-72、SEQ ID NO.73-84、SEQ ID NO.85-93、SEQ ID NO.94-105和SEQ ID NO.106-117所示的核苷酸序列。
进一步的，所述探针经过标记物标记，优选经过生物素标记。
进一步的，所述探针为DNA探针或RNA探针。
本发明还提供了一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的试剂盒，所述试剂盒包括上述的探针组。
另外，本发明还提供了一种微卫星不稳定的检测方法，使用上述的探针组或试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
进一步的，构建目标基因组文库，然后使用上述的探针组或试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
进一步的，对目标的全基因组进行片段化后，通过末端修复，获得目标基因组文库。
进一步的，将探针组与磁珠混合并吸附后，通过洗脱处理得到目标基因片段。
进一步的，将洗脱处理得到的目标基因片段利用PCR进行片段扩增，取长度在220-320bp之间的扩增片段进行高通量测序并分析，得到微卫星不稳定结果。
本发明提供的探针组，能够通过高通量测序同时捕获BAT26、BAT25、BAT-34c4、BAT-40、D2S123、D5S346、MONO-27、NR21、NR24、NR27和D17S250这11个用于评价微卫星不稳定的位点，准确评估待测对象的微卫星不稳定状态，为肿瘤患者的预后及临床治疗方案的制定提供理论基础及指导。本发明提供的探针组能与常规探针混合使用，在检测常规突变的同时，不增加特殊流程的情况下，检测样本微卫星不稳定状态，降低检测成本。
本发明提供的微卫星不稳定的检测方法，使用本发明提供的探针组通过液相杂交对目标基因进行富集，大大提高了片段的捕获和富集效率，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，能够实现数据重复率低且有效深度高的效果，从而提高了高通量测序的效率。采用该探针组可以有效靶向富集肿瘤组织及游离DNA中微卫星不稳定相关位点，为微卫星不稳定的研究和应用提供了高效的基因分型技术。同时，使用液相杂交技术能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求，同时也能更好地控制测序成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为传统BAT26探针的设计方式的示意图；
图2为本发明提供的针对BAT26位点的探针设计方式的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组，所述探针组包括同时捕获下述位点的探针：BAT26、BAT25、BAT-34c4、BAT-40、D2S123、D5S346、MONO-27、NR21、NR24、NR27和D17S250。
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。其普遍具有灵敏度高。高通量、低成本的优势。典型的高通量测序平台包括但不限于大规模平行签名测序(Massively Parallel SignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。
本发明提供的探针组，能够通过高通量测序同时捕获BAT26、BAT25、BAT-34c4、BAT-40、D2S123、D5S346、MONO-27、NR21、NR24、NR27和D17S250这11个用于评价微卫星不稳定的位点，准确评估待测对象的微卫星不稳定状态。采用该探针组可以有效靶向富集肿瘤组织及游离DNA中微卫星不稳定相关位点，为肿瘤患者的预后及临床治疗方案的制定提供理论基础及指导。本发明提供的探针组能与常规探针混合使用，在检测常规突变的同时，不增加特殊流程的情况下，检测样本微卫星不稳定状态，降低检测成本。
在一些实施方式中，在液体活检中使用的样本为cfDNA，cfDNA的平均长度为160bp～170bp，且总量较低，对于探针要求更为严格。应用本发明提供的探针组能够高效、准确地检测出cfDNA样本中微卫星不稳定情况，应用场景更加广泛。
在一些优选的实施方式中，所述探针为包括正义链探针。
微卫星序列的突变方式主要为重复序列的***和缺失，常规探针设计方式只参考常规的基因组的正义链进行探针设计，例如，针对每个MSI微卫星位点设计三条探针，分别位于检测位点的侧翼和中间(如图1所示)。由于微卫星不稳定相关的位点，其主要的突变形式为重复单元的重复次数发生改变。如BAT-26，其序列为TTCAGGT(A)27GGGTT，当发生微卫星不稳定后，其中间的A重复数会随机减少，且减少的重复次数一般大于10个重复，产生突变型。而专利201710647677.8中针对该位点设计的探针其中一条为：AGTATATGAAATTGGATATTGCAGCAGTCAGAGCCCTTAACCTTTTTCAGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTTAAAAATGTTGAATGGTTAAAAAATGTTTTCATTGAC，当该位点发生突变后，会导致重复数远低于实际探针情况，导致探针捕获脱靶产生。本实施方式提出对目标的正义链设计探针进行杂交，将可能的***缺失方式均进行设计，具体地，本领域知晓，MSI主要是重复序列减少，本实施方式将所有的减少可能都考虑进去进行设计，例如AAAAAAA重复，本实施方式则针对1-7个重复序列减少(AAAAAA、AAAAA、AAAA、AAA、AA、A、-)的所有探针均进行针对性设计(如图2所示)，以提高探针的特异性，提高有效捕获信息，进而提高复杂疑难样本的检出能力。
优选地，捕获BAT-34c4、BAT-40、BAT25、MONO-27、NR21、BAT26、D5S346、D2S123、NR24、D17S250和NR27位点的正义链探针依次具有如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.11-20、SEQ ID NO.21-32、SEQ ID NO.33-42、SEQ ID NO.43-53、SEQ ID NO.54-62、SEQ ID NO.63-72、SEQ ID NO.73-84、SEQ ID NO.85-93、SEQ ID NO.94-105和SEQ ID NO.106-117所示的核苷酸序列。
在一些优选的实施方式中，所述探针经过标记物标记，优选经过生物素标记。
在一些优选的实施方式中，所述探针为DNA探针或RNA探针。
基于本发明提供的使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组的有益效果，本发明还提供了包括本发明提供的探针组的使用高通量测序检测微卫星不稳定的试剂盒。该试剂盒使用本发明提供的探针组作为有效检测物质，因此具有本发明提供的探针组的全部有益效果。此外，所述试剂盒还可以包括常规的检测试剂，本发明对此不做限定。
另外，本发明还提供了一种微卫星不稳定的检测方法，使用上述的探针组或试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
本发明提供的微卫星不稳定的检测方法，使用本发明提供的探针组通过液相杂交对目标基因进行富集，大大提高了片段的捕获和富集效率，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，能够实现数据重复率低且有效深度高的效果，从而提高了高通量测序的效率。采用该探针组可以有效靶向富集肿瘤组织及游离DNA中微卫星不稳定相关位点，为微卫星不稳定的研究和应用提供了高效的基因分型技术。同时，使用液相杂交技术能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求，同时也能更好地控制测序成本。
需要说明的是，本发明提供的微卫星不稳定的检测方法，仅用作科学研究，不属于疾病的诊断和/或治疗方法。
在一些优选的实施方式中，先构建目标基因组文库，使用上述的探针组或试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
需要说明的是，目标基因组文库为目标全基因组文库，具体地，可以从人类的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA，例如从外周血样本中提取基因组DNA，经处理得到目标基因组文库。优选地，对目标的全基因组进行片段化后，通过末端修复，获得目标基因组文库。
在一些优选的实施方式中，将探针组与磁珠混合并吸附后，通过洗脱处理得到目标基因片段。例如，可以先将本发明提供的探针组中的各个探针进行生物素标记，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，通过探针上的生物素和链霉亲和素的结合被吸附到磁珠上，再从磁珠上释放出富集的微卫星不稳定相关微卫星位点片段。
在一些优选的实施方式中，将洗脱处理得到的目标基因片段利用PCR进行片段扩增，取长度在220-320bp之间的扩增片段进行高通量测序并分析，得到微卫星不稳定结果。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是，实施例中的反应体系和反应条件仅是一种举例。实施例中各步骤中的反应体系和反应条件均可以在可接受的范围内进行调整，以优化反应条件，本发明对此不做限制；探针长度根据合成的平台长度会有差异，本实施例中探针的长度为121bp，可以理解的是，只要复合本发明提供的探针的设计规则即可。
实施例1捕获探针的制备
采用本领域公知方法合成探针序列，均匀混合在总体积1ml的TE中，取其中1μl利用如下表中所示的通用PCR引物进行PCR扩增，PCR扩增体系：上述探针溶液，1μl；正向引物(20μM)，1μl；反向引物(20μM)，1ul；47μL Platinum PCR Supermix，总体积50μL。扩增条件：95℃，2min；(94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s)20个循环；72℃，5min。
| 序列(5’-3’) |
| TAATACGACTCACTATAGGGATCGCACCAGCGTGT |
| AGAAGAGTCACATAC |
将PCR产物用MinElute PCR Purification Kit纯化试剂盒纯化后，-20℃保存。取500ng，用Ambion SP6 megascript kit对PCR纯化后产物进行体外转录。体外转录的RNA使用Qiagen RNeasy minikit进行纯化，纯化后产物即得到生物素标记的本实施例的探针。
实施例2特异性捕获及测序
本实施例使用了实施例1提供的捕获探针组，并且基于液相杂交的序列捕获技术对靶序列进行富集。液相杂交技术路线是：1)制备杂交探针库，2)使用探针对目标基因进行富集，3)将富集后的DNA序列用高通量测序仪进行测序。
该文库构建方法包括如下步骤：
1.DNA提取和打断
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取4个外周血样本中DNA。
使用Bioruptor Pico DNA打断仪，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数ON 30s，OFF 30s为1个循环，每10cycles为一轮，共进行3轮，每组结束后将样品置于振荡器上充分混匀，短暂离心后进行下一轮打断。
取1μl样品使用QSEP 100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
2.末端修复
预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×T4 PNK Buffer和Natural dNTP Mix，将其置于冰上融化并用Vortex充分混匀直至Buffer中没有任何固体不溶物，将酶从-20℃冰箱取出置于-20℃冰盒上。
在1.5ml的离心管中分别配制末端修复反应体系，如下所示：20℃温浴30min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化，溶解于20μl TE中。
3.末端加“A”(A-Tailing)
在1.5ml的离心管中分别配制末端加“A”反应体系，如下所示：37℃温浴30min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化，溶解于25μl TE中。
| 试剂 | 体积 |
| 来自2的样品 | 19.5μl |
| 10×Blue Buffer | 2.5μl |
| 1mM dATP | 2.5μl |
| Klenow(3’-5’exo-) | 0.5μl |
| Total | 25μl |
4.Adapter连接
在1.5ml的离心管中配制Adapters连接反应体系。20℃温浴15min。反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化，溶解于21μl TE中：
| 试剂 | 体积 |
| 来自步骤3的样品 | 25μl |
| 2×Rapid ligation Buffer | 25μl |
| Adaptes | 1μl |
| T4 DNA ligase | 1μl |
| Total | 52μl |
5.PCR扩增加index
PCR反应体系及反应条件如下：
| 试剂 | 体积 |
| 来自步骤4的样品 | 21μl |
| HiFi Mix | 25μl |
| Index primers 1 | 2μl |
| Index primers 2 | 2μl |
| Total | 50μl |
在PCR仪中运行下列程序：
反应后产物使用Ampure XP磁珠进行纯化。溶解于50μl TE中。使用NanoDrop 1000检测PCR产物浓度。使用Qubit 3.0进行文库定量，文库浓度>25ng/μl参考为合格文库。使用QSEP 100检测，文库主峰要在220-320bp左右，主峰前后无杂峰。
6.杂交
将Hyb Block及Hyb Buffer从冰箱取出，冰上融化，融化后将Hyb Buffer置于金属浴上65℃预热。
按照以下体系将样品文库与Hyb block混匀，标记为B。
| Component | Volume for capture |
| 样品文库 | 600ng |
| Hyb Block | 5μl |
将Hyb Buffer置于室温融化，未加热前会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl Hyb Buffer置于新的200μl PCR管内，盖好管盖，标记为A，继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
取5μl RNase Block与2μl Probe置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为C。
设置PCR仪参数，heat lid 100℃，95℃，5min；65℃，hold；
将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序。
PCR仪温度降至65℃时，将PCR管A置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖；5min后，将C置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖；将PCR管C放置入PCR仪2min后，把移液器调至13μl，从PCR管A中吸取13μl Hyb Buffer移至PCR管C中，吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜(8-16h)。
7.捕获
提前分装Wash Buffer 2(每个捕获需要1.8ml)，并置于ThermoMixer上65℃预热。
保持杂交产物PCR管C在PCR仪上，将杂交后PCR管C的产物加入到200μL Biotin-bed中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上(10rpm/min)室温结合30min后将离心管置于磁力架上2min，然后移除上清液。
向离心管内加入500μL的Wash Buffer 1，轻轻吸打6次混匀，重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5s混匀样品，室温下孵育样品15min。
加入500μl的65℃预热的Wash Buffer 2，涡旋混匀5s，置于ThermoMixer上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。
短暂离心，将离心管放于磁力架上2min，移除上清。重复洗2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除Wash Buffer2(可用10μl移液器移除残留)。
向离心管中加入25μL Nuclease-free water，从磁力架上取下离心管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
8.富集
捕获后需要对DNA文库进行富集，根据下表配制Mix：
| Component | Volume for 4capture |
| 来自上一步的样品 | 30μl |
| Post PCR Buffer | 18μl |
| Post PCR Primer(25μM) | 1μl |
| Post DNA Polymerase | 1μl |
| Total volume | 50μl |
将PCR产物纯化后，文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，使用QSEP 100进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间。使用Illumina测序仪进行测序。
使用XY_MSIfinder软件对数据进行分析，并获得MSI分型结果。
实施例3
收集已知MSI型别的结直肠癌样本20例及对应患者的血浆样本，按实施例2所示流程进行检测，检测结果如下所示。
从上述结果可以得出，使用本发明的探针对不同样本微卫星状态进行检测，组织样本的准确性达到100％，特异性达到100％，血浆样本的准确性达到97.5％，特异性达到100％。
根据以上所述表明，本发明具有以下优点：1、准确性高，灵敏度强，高通量，能有效准确的检测出肿瘤患者的微卫星不稳定性。2、基于二代测序数据的微卫星不稳定性检测方法可以消除需要对MSI状态进行单独的、专门的检测，可以在检测其他基因上的敏感突变同时，检测微卫星不稳定性这一临床上重要的肿瘤表型。3、此方法项较于常规检测方法能检测更多的微卫星位点。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州祥音医学检验实验室有限公司
张光谋
<120> 使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测
方法
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagcgagga tcaacttcct ttttttgttg ttgcttgtgt ggttttcttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttgagacaa ggtggtcttg ctctaccacc caggccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 2
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagcgagga tcaacttcct ttttttgttg ttgcttgtgt ggttttcttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttgagaca aggtggtctt gctctaccac ccaggcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 3
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaagcgagga tcaactcctt tttttgttgt tgcttgtgtg gttttctttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttgagaca aggtggtctt gctctaccac ccaggcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 4
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaagcgagga tcaactcctt tttttgttgt tgcttgtgtg gttttctttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttgagac aaggtggtct tgctctacca cccagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 5
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaagcgagga tcaactcttt ttttgttgtt gcttgtgtgg ttttcttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttgagac aaggtggtct tgctctacca cccagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 6
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaagcgagga tcaactcttt ttttgttgtt gcttgtgtgg ttttcttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttttgaga caaggtggtc ttgctctacc acccacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 7
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaagcgagga tcaacttttt tttgttgttg cttgtgtggt tttctttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttttgaga caaggtggtc ttgctctacc acccacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 8
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaagcgagga tcaacttttt tttgttgttg cttgtgtggt tttctttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttgag acaaggtggt cttgctctac caccccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 9
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaagcgagga tcaactctca agccaagatt aacttcctac accacaaccc tgcttttgtt 60
cctttttttg ttgttgcttg tgtggttttc tttttttttt tttttttttt tttttcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 10
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaagcgagga tcaacttttt tttttttttt tttttttttt tgagacaagg tggtcttgct 60
ctaccaccca ggctagagtg cagaggtgtg atcttggctc actgccagga accagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 11
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaagcgagga tcaactttgg ccaactaaaa aagaaaaaaa agtaaaacca ggattttttt 60
tttttttttt tttttttgag gcagagtctt gctctgtctc ccacgctgga gtgcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 12
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaagcgagga tcaactttgg ccaactaaaa aagaaaaaaa agtaaaacca ggattttttt 60
tttttttttt ttttttttga ggcagagtct tgctctgtct cccacgctgg agtgccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 13
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaagcgagga tcaacttggc caactaaaaa agaaaaaaaa gtaaaaccag gatttttttt 60
tttttttttt ttttttttga ggcagagtct tgctctgtct cccacgctgg agtgccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 14
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaagcgagga tcaacttggc caactaaaaa agaaaaaaaa gtaaaaccag gatttttttt 60
tttttttttt tttttttttg aggcagagtc ttgctctgtc tcccacgctg gagtgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 15
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaagcgagga tcaactggcc aactaaaaaa gaaaaaaaag taaaaccagg attttttttt 60
tttttttttt tttttttttg aggcagagtc ttgctctgtc tcccacgctg gagtgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 16
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaagcgagga tcaactggcc aactaaaaaa gaaaaaaaag taaaaccagg attttttttt 60
tttttttttt tttttttttt gaggcagagt cttgctctgt ctcccacgct ggagtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 17
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaagcgagga tcaactgcca actaaaaaag aaaaaaaagt aaaaccagga tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt gaggcagagt cttgctctgt ctcccacgct ggagtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 18
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gaagcgagga tcaactgcca actaaaaaag aaaaaaaagt aaaaccagga tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tgaggcagag tcttgctctg tctcccacgc tggagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 19
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaagcgagga tcaactgatg tggttctgtc tcctttctta agggtggatc aaatttcact 60
tggccaacta aaaaagaaaa aaaagtaaaa ccaggatttt tttttttttt tttttcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 20
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gaagcgagga tcaacttttt tttttttttt tttttgaggc agagtcttgc tctgtctccc 60
acgctggagt gcagtggcgc aatctcagct cactgcaatc tccaccccct gggttcattg 120
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<210> 21
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaagcgagga tcaactgata ttgcagcagt cagagccctt aacctttttc aggtaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaggg ttaaaaatgt tgaatggtta aaaaatgttt tcattcattg 120
cgtgaaccga 130
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gaagcgagga tcaactatat tgcagcagtc agagccctta acctttttca ggtaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaggg ttaaaaatgt tgaatggtta aaaaatgttt tcattcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 23
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaagcgagga tcaactatat tgcagcagtc agagccctta acctttttca ggtaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaagg gttaaaaatg ttgaatggtt aaaaaatgtt ttcatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 24
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaagcgagga tcaacttatt gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag gtaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaagg gttaaaaatg ttgaatggtt aaaaaatgtt ttcatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 25
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gaagcgagga tcaacttatt gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag gtaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggttaaaaat gttgaatggt taaaaaatgt tttcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 26
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gaagcgagga tcaactattg cagcagtcag agcccttaac ctttttcagg taaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggttaaaaat gttgaatggt taaaaaatgt tttcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 27
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaagcgagga tcaactattg cagcagtcag agcccttaac ctttttcagg taaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gggttaaaaa tgttgaatgg ttaaaaaatg ttttccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 28
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gaagcgagga tcaactttgc agcagtcaga gcccttaacc tttttcaggt aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gggttaaaaa tgttgaatgg ttaaaaaatg ttttccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 29
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gaagcgagga tcaactttgc agcagtcaga gcccttaacc tttttcaggt aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agggttaaaa atgttgaatg gttaaaaaat gttttcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 30
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gaagcgagga tcaactagtt tgaactgact acttttgact tcagccagta tatgaaattg 60
gatattgcag cagtcagagc ccttaacctt tttcaggtaa aaaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 31
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gaagcgagga tcaacttttg aactgactac ttttgacttc agccagtata tgaaattgga 60
tattgcagca gtcagagccc ttaacctttt tcaggtaaaa aaaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 32
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaaa aaaaagggtt aaaaatgttg aatggttaaa 60
aaatgttttc attgacatat actgaagaag cttataaagg agctaaaata ttttgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 33
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gaagcgagga tcaactacat tgctggaagt tctggccaga gaaattagaa cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca ctattttata gatagataga tggtatccaa gtcagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 34
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gaagcgagga tcaactgctg gaagttctgg ccagagaaat tagaacacac acacacacac 60
acacacacac acacacacac acacactatt ttatagatag atagatggta tccaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 35
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gaagcgagga tcaactctgg aagttctggc cagagaaatt agaacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca cacacactat tttatagata gatagatggt atccacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 36
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gaagcgagga tcaacttgga agttctggcc agagaaatta gaacacacac acacacacac 60
acacacacac acacacacac acacacacta ttttatagat agatagatgg tatcccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 37
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gaagcgagga tcaactggaa gttctggcca gagaaattag aacacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca cacacacact attttataga tagatagatg gtatccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 38
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gaagcgagga tcaactgaag ttctggccag agaaattaga acacacacac acacacacac 60
acacacacac acacacacac acacacacac tattttatag atagatagat ggtatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 39
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gaagcgagga tcaactaagt tctggccaga gaaattagaa cacacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca cacacacaca ctattttata gatagataga tggtacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 40
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaagcgagga tcaactaaaa caggatgcct gcctttaaca ctgctattca acattgctgg 60
aagttctggc cagagaaatt agacacagtg atacacacac acacacacac acacacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 41
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gaagcgagga tcaactcaca cacacacaca cacacacaca cacatatttt atagatagat 60
agatggtatc caagtcagaa agggagaagt aaaactatcc ctattgtaga tgacacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 42
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gaagcgagga tcaactcaca cacacacaca cacacacaca cacacacata ttttatagat 60
agatagatgg tatccaagtc agaaagggag aagtaaaact atccctattg tagatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 43
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gaagcgagga tcaactctga ctccaaaaac tcttctcttc cctgggccca gtcctatttt 60
tttttttttt ttttgtgaga cagagtctca ctctgtcacc caggttggaa tgcaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 44
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gaagcgagga tcaactctga ctccaaaaac tcttctcttc cctgggccca gtcctatttt 60
tttttttttt tttttgtgag acagagtctc actctgtcac ccaggttgga atgcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 45
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gaagcgagga tcaacttgac tccaaaaact cttctcttcc ctgggcccag tcctattttt 60
tttttttttt tttttgtgag acagagtctc actctgtcac ccaggttgga atgcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 46
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gaagcgagga tcaacttgac tccaaaaact cttctcttcc ctgggcccag tcctattttt 60
tttttttttt ttttttgtga gacagagtct cactctgtca cccaggttgg aatgccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 47
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gaagcgagga tcaactgact ccaaaaactc ttctcttccc tgggcccagt cctatttttt 60
tttttttttt ttttttgtga gacagagtct cactctgtca cccaggttgg aatgccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 48
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gaagcgagga tcaactgact ccaaaaactc ttctcttccc tgggcccagt cctatttttt 60
tttttttttt tttttttgtg agacagagtc tcactctgtc acccaggttg gaatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 49
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gaagcgagga tcaactactc caaaaactct tctcttccct gggcccagtc ctattttttt 60
tttttttttt tttttttgtg agacagagtc tcactctgtc acccaggttg gaatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 50
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gaagcgagga tcaactactc caaaaactct tctcttccct gggcccagtc ctattttttt 60
tttttttttt ttttttttgt gagacagagt ctcactctgt cacccaggtt ggaatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 51
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gaagcgagga tcaactctcc aaaaactctt ctcttccctg ggcccagtcc tatttttttt 60
tttttttttt ttttttttgt gagacagagt ctcactctgt cacccaggtt ggaatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 52
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gaagcgagga tcaacttaag gtctgcctta acgtgatccc cattgctgaa ttttacctcc 60
tgactccaaa aactcttctc ttccctgggc ccagtcctat tttttttttt tttttcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 53
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gaagcgagga tcaacttttt tttttttttt ttgtgagaca gagtctcact ctgtcaccca 60
ggttggaatg caatggcaca atctccgctc actgcaagct ccgcctcccg ggttccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 54
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gaagcgagga tcaactgtgg gagtgattct ctaaagagtt ttgtgttttg tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tgagaacaga gcattttaga gccatagtta aaatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 55
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gaagcgagga tcaacttggg agtgattctc taaagagttt tgtgttttgt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tgagaacaga gcattttaga gccatagtta aaatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 56
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gaagcgagga tcaacttggg agtgattctc taaagagttt tgtgttttgt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttgagaacag agcattttag agccatagtt aaaatcattg 120
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<210> 57
<211> 130
<212> DNA
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<400> 57
gaagcgagga tcaactggga gtgattctct aaagagtttt gtgttttgtt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttgagaacag agcattttag agccatagtt aaaatcattg 120
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<210> 58
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gaagcgagga tcaactggga gtgattctct aaagagtttt gtgttttgtt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttgagaaca gagcatttta gagccatagt taaaacattg 120
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<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gaagcgagga tcaactggag tgattctcta aagagttttg tgttttgttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttgagaaca gagcatttta gagccatagt taaaacattg 120
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<210> 60
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
gaagcgagga tcaactggag tgattctcta aagagttttg tgttttgttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttgagaac agagcatttt agagccatag ttaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 61
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
gaagcgagga tcaactcagg tggcaaaggg catggctttc ctcgcctcca agaatgtaag 60
tgggagtgat tctctaaaga gttttgtgtt ttgttttttt gatttttttt tttttcattg 120
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<210> 62
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gaagcgagga tcaacttttt tttttttttt ttttttttga gaacagagca ttttagagcc 60
atagttaaaa tgcagaatgt cattttgaag tgtggtaacc aaaagcagag gaaatcattg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
gaagcgagga tcaacttttt tcagggaatt gagagttaca ggttactctg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg taaatttccc gatttatcac tagagtgagt aactacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 64
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gaagcgagga tcaacttttt cagggaattg agagttacag gttactctgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtaaatttcc cgatttatca ctagagtgag taactcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 65
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gaagcgagga tcaacttttc agggaattga gagttacagg ttactctgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtaaatttc ccgatttatc actagagtga gtaaccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 66
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gaagcgagga tcaactttca gggaattgag agttacaggt tactctgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaaattt cccgatttat cactagagtg agtaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 67
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gaagcgagga tcaacttcag ggaattgaga gttacaggtt actctgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtaaatt tcccgattta tcactagagt gagtacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 68
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gaagcgagga tcaactcagg gaattgagag ttacaggtta ctctgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtaaat ttcccgattt atcactagag tgagtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 69
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
gaagcgagga tcaactaggg aattgagagt tacaggttac tctgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtaaa tttcccgatt tatcactaga gtgagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 70
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
gaagcgagga tcaactggga attgagagtt acaggttact ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtaa atttcccgat ttatcactag agtgacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 71
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gaagcgagga tcaactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt aaatttcccg atttatcact 60
agagtgagta actaactaac taactgcttt ataaagctat cctggtattc atatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 72
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gaagcgagga tcaactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaaattt cccgatttat 60
cactagagtg agtaactaac taactaactg ctttataaag ctatcctggt attcacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 73
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
gaagcgagga tcaactctgt gagatccagg aaaccatgct tgcaaaccac tggtaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaagcc acagtgactt gcttattggt cattgctagt attatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 74
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gaagcgagga tcaacttgtg agatccagga aaccatgctt gcaaaccact ggtaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaagcc acagtgactt gcttattggt cattgctagt attatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 75
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
gaagcgagga tcaacttgtg agatccagga aaccatgctt gcaaaccact ggtaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaagc cacagtgact tgcttattgg tcattgctag tattacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 76
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
gaagcgagga tcaactgtga gatccaggaa accatgcttg caaaccactg gtaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaagc cacagtgact tgcttattgg tcattgctag tattacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 77
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gaagcgagga tcaactgtga gatccaggaa accatgcttg caaaccactg gtaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ccacagtgac ttgcttattg gtcattgcta gtattcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 78
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
gaagcgagga tcaacttgag atccaggaaa ccatgcttgc aaaccactgg taaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ccacagtgac ttgcttattg gtcattgcta gtattcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 79
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gaagcgagga tcaacttgag atccaggaaa ccatgcttgc aaaccactgg taaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gccacagtga cttgcttatt ggtcattgct agtatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 80
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gaagcgagga tcaactgaga tccaggaaac catgcttgca aaccactggt aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gccacagtga cttgcttatt ggtcattgct agtatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 81
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gaagcgagga tcaactcctg gaaacaaagc attgaagtct gcagttgaaa agcccaacgt 60
ctgtgagatc caggaaacca tgcttgcaaa ccactggtaa aaaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 82
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gaagcgagga tcaacttgga aacaaagcat tgaagtctgc agttgaaaag cccaacgtct 60
gtgagatcca ggaaaccatg cttgcaaacc actggtaaaa aaaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 83
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaaa aaagccacag tgacttgctt attggtcatt 60
gctagtatta tcgactcaga acctctttac taatggctag taaatcataa ttgagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 84
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaaa aaaaagccac agtgacttgc ttattggtca 60
ttgctagtat tatcgactca gaacctcttt actaatggct agtaaatcat aattgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 85
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gaagcgagga tcaactttct ggtcactcgc gtttacaaac aagaaaagtg ttgctaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaggcca ggggagacat acatttaaat ataaaaatag aactgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 86
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gaagcgagga tcaactttct ggtcactcgc gtttacaaac aagaaaagtg ttgctaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaggcc aggggagaca tacatttaaa tataaaaata gaactcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 87
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
gaagcgagga tcaacttctg gtcactcgcg tttacaaaca agaaaagtgt tgctaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaggcc aggggagaca tacatttaaa tataaaaata gaactcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 88
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gaagcgagga tcaacttctg gtcactcgcg tttacaaaca agaaaagtgt tgctaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaggc caggggagac atacatttaa atataaaaat agaaccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 89
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gaagcgagga tcaactctgg tcactcgcgt ttacaaacaa gaaaagtgtt gctaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaggc caggggagac atacatttaa atataaaaat agaaccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 90
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
gaagcgagga tcaactagca gataaaagag aacacgaaaa atattcctac tccgcattca 60
cactttctgg tcactcgcgt ttacaaacaa gaaaagtgtt gctaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 91
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gaagcgagga tcaactcaga taaaagagaa cacgaaaaat attcctactc cgcattcaca 60
ctttctggtc actcgcgttt acaaacaaga aaagtgttgc taaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 92
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaagg ccaggggaga catacattta aatataaaaa 60
tagaactgtg ccagcgactc cggctggaat tctgctgaaa gggatgtgtc ttcagcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 93
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaaa ggccagggga gacatacatt taaatataaa 60
aatagaactg tgccagcgac tccggctgga attctgctga aagggatgtg tcttccattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 94
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gaagcgagga tcaactagct ggccatatat atatttaaac catttgaaag tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttgaaacca tttgaaagtt tatgtatgtg tatatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 95
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
gaagcgagga tcaactgctg gccatatata tatttaaacc atttgaaagt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtttgaaacc atttgaaagt ttatgtatgt gtatacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 96
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gaagcgagga tcaactctgg ccatatatat atttaaacca tttgaaagtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtttgaaac catttgaaag tttatgtatg tgtatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 97
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
gaagcgagga tcaacttggc catatatata tttaaaccat ttgaaagtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttgaaa ccatttgaaa gtttatgtat gtgtacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 98
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gaagcgagga tcaactggcc atatatatat ttaaaccatt tgaaagtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttgaa accatttgaa agtttatgta tgtgtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 99
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
gaagcgagga tcaactgcca tatatatatt taaaccattt gaaagtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtttga aaccatttga aagtttatgt atgtgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 100
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
gaagcgagga tcaactccat atatatattt aaaccatttg aaagtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtttg aaaccatttg aaagtttatg tatgtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 101
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
gaagcgagga tcaactcata tatatattta aaccatttga aagtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttt gaaaccattt gaaagtttat gtatgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 102
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
gaagcgagga tcaactctca gcctccgaaa gtgctgggat tacaggcatg agccactcag 60
ctggccatat atatatttaa accatttgaa agtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 103
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gaagcgagga tcaactgcct ccgaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc actcagctgg 60
ccatatatat atttaaacca tttgaaagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 104
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gaagcgagga tcaactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttgaaaccat ttgaaagttt 60
atgtatgtgt atatatatat ataaacacac acatattttt attgtctatt tgattcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 105
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
gaagcgagga tcaactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttgaaa ccatttgaaa 60
gtttatgtat gtgtatatat atatataaac acacacatat ttttattgtc tatttcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 106
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
gaagcgagga tcaactccag cctgggcaac aaagcgagac ccagtctcaa agaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaga aattgaccct gagcataaaa caagtcttgg tggatcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 107
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gaagcgagga tcaactccag cctgggcaac aaagcgagac ccagtctcaa agaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaattgaccc tgagcataaa acaagtcttg gtggacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 108
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
gaagcgagga tcaactcagc ctgggcaaca aagcgagacc cagtctcaaa gaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaattgaccc tgagcataaa acaagtcttg gtggacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 109
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
gaagcgagga tcaactcagc ctgggcaaca aagcgagacc cagtctcaaa gaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaaattgacc ctgagcataa aacaagtctt ggtggcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 110
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
gaagcgagga tcaactagcc tgggcaacaa agcgagaccc agtctcaaag aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaaattgacc ctgagcataa aacaagtctt ggtggcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 111
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gaagcgagga tcaactagcc tgggcaacaa agcgagaccc agtctcaaag aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaattgac cctgagcata aaacaagtct tggtgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 112
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
gaagcgagga tcaactgcct gggcaacaaa gcgagaccca gtctcaaaga aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaattgac cctgagcata aaacaagtct tggtgcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 113
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
gaagcgagga tcaactgcct gggcaacaaa gcgagaccca gtctcaaaga aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagaaattga ccctgagcat aaaacaagtc ttggtcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 114
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
gaagcgagga tcaactgggg aggcaaaggc tgcagtaagc caagatcacg ccactccact 60
ccagcctggg caacaaagcg agacccagtc tcaaagaaaa agaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 115
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gaagcgagga tcaactggag gcaaaggctg cagtaagcca agatcacgcc actccactcc 60
agcctgggca acaaagcgag acccagtctc aaagaaaaag aaaaaaaaaa aaaaacattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 116
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaga aaaaagaaat tgaccctgag cataaaacaa 60
gtcttggtgg atccagatca tcatatacaa gagatgaaat cctccagggt gtgggcattg 120
cgtgaaccga 130
<210> 117
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
gaagcgagga tcaactaaaa aaaaaaaaaa gaaaaaagaa attgaccctg agcataaaac 60
aagtcttggt ggatccagat catcatatac aagagatgaa atcctccagg gtgtgcattg 120
cgtgaaccga 130
Claims (10)
1.一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组，其特征在于，所述探针组包括同时捕获下述位点的探针：BAT26、BAT25、BAT-34c4、BAT-40、D2S123、D5S346、MONO-27、NR21、NR24、NR27和D17S250。
2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针包括正义链探针；
优选地，捕获BAT-34c4、BAT-40、BAT25、MONO-27、NR21、BAT26、D5S346、D2S123、NR24、D17S250和NR27位点的正义链探针依次具有如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.11-20、SEQ IDNO.21-32、SEQ ID NO.33-42、SEQ ID NO.43-53、SEQ ID NO.54-62、SEQ ID NO.63-72、SEQID NO.73-84、SEQ ID NO.85-93、SEQ ID NO.94-105和SEQ ID NO.106-117所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针经过标记物标记，优选经过生物素标记。
4.根据权利要求1-3任一项所述的探针组，其特征在于，所述探针为DNA探针或RNA探针。
5.一种使用高通量测序检测微卫星不稳定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的探针组。
6.一种微卫星不稳定的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的探针组或权利要求5所述的试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，构建目标基因组文库，然后使用权利要求1-4任一项所述的探针组或权利要求5所述的试剂盒，通过液相杂交对目标基因进行富集，将富集得到的DNA序列进行高通量测序，得到微卫星不稳定结果。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，对目标的全基因组进行片段化后，通过末端修复，获得目标基因组文库。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，将探针组与磁珠混合并吸附后，通过洗脱处理得到目标基因片段。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，将洗脱处理得到的目标基因片段利用PCR进行片段扩增，取长度在220-320bp之间的扩增片段进行高通量测序并分析，得到微卫星不稳定结果。
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