CN112358978B - 一株曲霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株曲霉菌及其应用。本发明的曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX‑S1，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020216；从杉木人工林根际土壤中筛选获得，具有高效的解磷能力；在不同初始pH下，JX‑S1菌株具有较好的生长和适应能力，对5种难溶性磷酸盐磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、磷酸氢钙、植酸钙具有较强的溶解效果；该菌制成的液体菌剂对杉木地径和苗高具有显著的促生长作用。因此，本发明为开发环境友好型杉木生物专用肥料提供了优良的菌株资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物和生物肥料领域，具体涉及一株曲霉菌及其应用。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方最重要的速生优良用材树种，我国东南各省森林总面积的60％-80％，是经济与生态效益俱佳的木材生产物种。杉木多代连栽会导致林地生产力下降，土壤肥力降低，加上近些年来随着对杉木林滥砍滥伐，不合理经营导致林地养分耗竭的现象日益严重。当前，地力衰弱、养分供应不足是杉木资源培育中面临主要问题之一，如研究表明土壤磷的有效性已成为限制杉木人工林生产力提高的重要因素。
根际微生物是根际过程的关键参与者和调控者。根际土壤微生物通过改变土壤养分的有效性以及与植物根系共生的方式直接或间接影响植物群落结构及生产力。植物根际存在有大量微生物，其中部分微生物具有解磷、溶钾和分泌IAA等功能从而促进植物生长。解磷真菌作为土壤磷循环中一类重要的微生物，能够改善土壤的磷素供应。利用解磷微生物来提升杉木土壤磷素的吸收和提高杉木林生产力的能力，缓解了我国南方杉木林土壤磷缺乏的问题，也可解决化学肥料带来污染竹林生态环境、土壤板结等一系列问题。目前，有关杉木根际高效解磷真菌菌株的筛选及应用研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株杉木根际高效解磷真菌曲霉菌及其应用。
发明人从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1。
曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1主要形态和生物学特征：在PDA培养基平板上菌落黑褐色，具有辐射状沟纹，质地丝绒状；分生孢子在菌落中间密集产生，呈黑褐色；分生孢子头呈辐射状，分生孢子球形或近球形。
曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1的ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示，BenA片段序列如SEQ ID NO.2所示，CaM片段序列如SEQ ID NO.3所示。将所测ITS、BenA及CaM序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析。结果显示，JX-S1菌株与曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)同源性很高，相似度达到99％。结合形态及ITS、BenA及CaM序列分析，鉴定JX-S1菌株为曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)。
本发明的曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1对难溶性磷酸盐具有较好的溶解能力，可将土壤中难溶性磷转变为可溶性磷，提高土壤中有效磷含量，促进杉木对土壤磷素的吸收利用，可明显促进植物，如杉木实生苗的生长发育。
因此，本发明的第一个目的是提供一株曲霉菌JX-S1，其保藏编号为：CCTCC NO：M2020216。
本发明的第二个目的是提供所述的曲霉菌JX-S1在将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐中的应用。
优选，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝和/或植酸钙。
本发明还提供所述的曲霉菌JX-S1在将难溶性钾盐转化为可溶性钾盐中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的曲霉菌JX-S1在促进植物生长中的应用。
优选，所述的的植物为杉木。
本发明的第四个目的是提供一种菌剂，其含有所述的曲霉菌JX-S1。
本发明的第五个目的是提供一种生物肥料，其含有所述的曲霉菌JX-S1。
优选，所述的生物肥料的剂型为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的杉木根际高效解磷真菌曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1在液体摇培的条件下，对难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)具有较强的溶解效果，与对照(CK)相比，解磷能力差异极显著；本发明的杉木根际高效解磷真菌曲霉菌JX-S1菌株制成液体菌剂接种杉木实生苗，结果表明，该菌剂能明显促进杉木的生长发育，因此，本发明为将来开发杉木专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。
本发明的曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1于2020年06月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072；保藏编号为：CCTCC NO：M 2020216。
附图说明
图1是JX-S1菌株在PDA培养基上的菌落形态。
图2是JX-S1菌株在NBRIP培养基上产生的溶磷圈。
图3是JX-S1菌株的分生孢子梗及分生孢子。
图4是JX-S1菌株的***发育树。
图5为JX-S1菌株对5种对难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)的溶解能力。
图6是JX-S1菌株的解钾能力。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌JX-S1菌株。
JX-S1菌株主要形态和生物学特征：在PDA培养基平板上培养8天，菌落黑褐色，具有辐射状沟纹，质地丝绒状(图1)；分生孢子在菌落中间密集产生，呈黑褐色；分生孢子头呈辐射状，分生孢子球形或近球形(图3)。
图2是JX-S1菌株在NBRIP培养基上培养7天产生的溶磷圈，说明JX-S1具有解磷能力。
分子生物学鉴定：
提取JX-S1菌株的DNA，用相应的引物PCR扩增获得其ITS、BenA及CaM片段后送基因测序，测得ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示，测得BenA片段序列如SEQ ID NO.2所示，测得CaM片段序列如SEQ ID NO.3所示。将所测ITS、BenA及CaM序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析。然后基于ITS、BenA和CaM多基因联合使用贝叶斯方法构建***发育树。结果显示，JX-S1菌株与曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)同源性很高，相似度达到99％(图4)。结合形态及ITS、BenA及CaM序列分析，鉴定JX-S1菌株为曲霉菌(Aspergillusviolaceofuscus)。
本发明的曲霉菌(Aspergillus violaceofuscus)JX-S1于2020年06月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072；保藏编号为：CCTCC NO：M 2020216。
实施例2：曲霉菌JX-S1在不同初始pH下生物量的测定
将活化的JX-S1菌株接种在PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将PDA液体培养基的pH设置为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5六个梯度，分装于250ml三角瓶中，装液量为100mL。随后，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到PDA液体培养基中，各处理3个重复，25℃，120r/min振荡培养8d。菌丝过滤后在65℃下烘干48h，称重。结果见表1，JX-S1菌株在pH 1.5、2.5、3.5、4.5、5.5及6.5的不同酸性条件下生长较好，菌丝生物量并无差异，以上表明，JX-S1菌株能适应不同的酸性的环境，具备在不同酸性土壤环境中生长的能力。
表1不同pH对JX-S1菌株菌丝生物量发酵液pH的影响
实施例3：曲霉菌JX-S1对不同磷源的溶解能力试验
解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基B：用磷酸铝(AlPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基C：用磷酸铁(FePO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基D：用磷酸氢钙(CaHPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基E：用植酸钙(C6H6Ca6O24P6)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)2，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
将活化的JX-S1菌株接种PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到装有50mL且pH分别调至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.2的解磷培养基A、B、C、D或E的100mL三角瓶中，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理三个重复，25℃，121r/min培养8d后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见图5。
由图5可知，在振荡培养8d后，菌株JX-S1对5种难溶性磷酸盐磷酸钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)的均具有较强的溶解能力，解磷能力分别为537.82mg/L、627.19mg/L、721.54mg/L、472.18mg/L、363.21mg/L。以上结果表明，菌株JX-S1对五种难溶性磷源均具有较强的溶解能力，显示该菌株红壤、石灰岩等不同类型土壤中具有较强的解磷能力。
实施例4：曲霉菌JX-S1的解钾能力
将菌株JX-S1接入装有50mL解钾培养基(解钾培养基的配方是：钾长石粉0.1g，Na2HPO42.0g，FeCl3 0.005g，MgSO4·7H2O 0.5g，蔗糖5.0g，Ca2CO3 0.1g，琼脂18.0g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0。)的100mL三角瓶中，28℃、180r/min条件下振荡培养7d得到发酵液，将发酵液先在500r/min，10min条件下除去发酵液中的不溶性物质，然后在10 000r/min，10min条件下离心收集上清液，采用火焰分光光度计法测定上清液中有效钾的含量。结果如图6所示，菌株JX-S1解钾量为12.45mg/L，具有较好的解钾能力。
实施例5：曲霉菌JX-S1温室盆栽试验：
(1)杉木苗的培育
杉木种子以0.5％高锰酸钾溶液浸泡2h进行表面消毒，再用自来水冲洗1h后，播种于灭菌沙子中，置于25℃温室中培养，待其长到子叶期时进行芽苗截根移苗。
(2)盆栽基质：
基质土壤采自江西农业大学校园后山，按照土壤：砂子：蛭石＝2：1：1的配比，在165℃条件下灭菌2h，冷却后备用。
(3)液体菌剂的制备
将保存的菌株JX-S1菌种接入PDA固体平板培养基中，于25℃培养6d，待菌丝长满平板，在无菌条件下，用打孔器(d＝7mm)在菌落边缘打成菌饼，再转接装有250mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中扩繁，每瓶挑取10粒菌饼。置于培养温度25℃和培养转速120r·min-1培养条件下培养至菌丝体旺盛期，用灭菌的匀浆机粉碎，制备成液体菌剂。
(4)液体菌剂接种的盆栽试验
采用芽苗截根法移栽杉木苗，菌剂接种量为10ml/株。具体方法如下：取适量无菌的盆栽基质装入花盆中，将杉木苗轻轻地从育苗盆中取出，尽量不伤及根系，并用清水将幼苗根部的沙子冲洗干净，用解剖刀将芽苗截去少量主根后移栽至花盆中，将菌剂放入杉木根际周围，压实基质，再覆基质土浇水定根。以只接种液体培养基、不接种菌种处理作为对照，每处理10个重复。置于25℃温室培养，适时浇水，统一管理。杉木根际基质接种后180d杉木生长情况见表2，可以看出，接种JX-S1能够显著促进杉木苗的生长。与对照相比，接种JX-S1的处理在苗高和茎粗上的增长率分别达到了33.44％和38.53％，促生效果显著。
表2 JX-S1菌株对杉木实生苗生长的影响
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一株曲霉菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 602
<212> DNA
<213> 曲霉菌JX-S1(Aspergillus Violaceofuscus JX-S1)
<400> 1
tggaagtaaa agtcgtaaca aggctttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattaccga 60
gtgctgggtc cttcggggcc caacctccca cccgtgctta ccgtaccctg ttgcttcggc 120
gggcccgcct tcgggcggcc cggggcctgc ccccgggacc gcgcccgccg gagaccccaa 180
tggaacactg tctgaaagcg tgcagtctga gttgattgat accaatcagt taaaactttc 240
aacaatggat ctcttggttc cggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataactaatg 300
tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt 360
ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattt ctcccctcca gccccgctgg ttgttgggcc 420
gcgccccccc gggggcgggc ctcgagagaa acggcggcgc cgtccggtcc tcgagcgtat 480
ggggctctgt cacccgctct atgggcccgg ccggggcttg cctcgacccc caatcttctc 540
agattgacct cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg 600
aa 602
<210> 2
<211> 408
<212> DNA
<213> 曲霉菌JX-S1(Aspergillus Violaceofuscus JX-S1)
<400> 2
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accccaatca ccatggctaa cacccaccag gcagaccatc tccggcgaac atggcctcga 120
cggcgacggc gtgtcagtga tcccgcgggc actcgactcc ttccccttct gacatccttc 180
ctagatacaa tggctcctcc gacctccagc tggaacgcat gaacgtctac ttcaacgaag 240
ccggcaacaa caagtacgtg ccccgcgcgg tgctggttga tttggagccc ggtacgatgg 300
acgctctgcg ctccggcccc atgggcggcc tgttccgtcc cgacaactac gtgttcggcc 360
agtccggtgc cggcaacaac ttgggccaag ggtcactaca ctgagggt 408
<210> 3
<211> 760
<212> DNA
<213> 曲霉菌JX-S1(Aspergillus Violaceofuscus JX-S1)
<400> 3
agatgccgac tctttgactg aagagcaagt ttcatcgagt acaaggaggc cttctccctc 60
tttgtaagcg accccgatgc tttctcgtct gctatgaaac actgtttact gattcatttc 120
tcgtgatccc tgataggaca aggatggcga tggttagtgt agttccttac ccctcaacga 180
aacacgcctg gcaccactat agccaccaca ctgcaaatgc caccgaaacc gctgagaatc 240
gatcgcattt ctgacagaat ctatgttaca ggacaaatta ccaccaagga gttgggtacc 300
gtcatgcgtt ccctcggcca gaacccctcc gagtctgagc ttcaggacat gatcaacgag 360
gtcgacgctg acaacaacgg cactatcgat tttcccggta tgtgatagcc atgtatggga 420
ctccggacat agtattgaca gctgcccaga attccttacc atgatggccc gtaagatgaa 480
ggataccgac tccgaggagg agatccgtga ggccttcaag gttttcgatc gcgataataa 540
cggcttcatc tctgccgcgg agctgcgcca cgtcatgacc tctatcggtg agaagctcac 600
cgatgacgaa gtcgatgaga tgatccgtga ggcggaccag gacggtgacg gccgtattga 660
ctgtatgttc cacacattcc ctgcttaaat gttcttctcg atgactaact tttactatct 720
taagtttacc agacaatgag ttcgtccagc tcatgatgca 760
Claims (9)
1.一株曲霉菌（Aspergillus violaceofuscus）JX-S1，其保藏编号为：CCTCC NO：M2020216。
2.权利要求1所述的曲霉菌JX-S1在将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的难溶性磷酸盐为磷酸钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝和/或植酸钙。
4.权利要求1所述的曲霉菌JX-S1在促进植物生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物为杉木。
6.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的曲霉菌JX-S1。
7.一种生物肥料，其特征在于，含有权利要求1所述的曲霉菌JX-S1。
8.根据权利要求7所述的生物肥料，其特征在于，所述的生物肥料的剂型为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。
9.权利要求1所述的曲霉菌JX-S1在将难溶性钾盐转化为可溶性钾盐中的应用。
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