CN112341411B - 一种类罗非昔布衍生物、制备的有机荧光染料骨架及用途 - Google Patents

一种类罗非昔布衍生物、制备的有机荧光染料骨架及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种类罗非昔布衍生物，并进一步公开其制备的有机荧光染料骨架，以及其在生物学成像领域的应用。本发明所述类罗非昔布系列衍生物，通过计算化学和量子轨道理论推测技术，仅在COX‑2抑制剂罗非昔布结构的基础上进行一步缩合修饰，采用全新的设计策略合成得到多个有临床开发前景的小分子荧光染料和COX‑2抑制剂荧光探针，使其在保持强COX‑2酶抑制活性的基础上，有效提高和改善了荧光染料的光物理和光化学性能，表现出优越的荧光性能，将为今后荧光染料和探针的设计提供一种更理想的选择。

Description

一种类罗非昔布衍生物、制备的有机荧光染料骨架及用途
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种类罗非昔布衍生物，并进一步公开其制备的有机荧光染料骨架，以及其在生物学成像领域的应用。
背景技术
荧光染料是染料化学中的一个重要的分支，尤其是近几十年来，荧光染料及其衍生物在材料、生物和医学等方面均取得了很多突破性进展，逐渐成为了染料化学中一个关键的研究方向。其中，有机荧光染料作为一类重要的荧光染料，更具有***的结构。从本质上来看，由于有机荧光染料的结构通常包含可发射荧光的母核以及能改变荧光波长和增强荧光的助色基团，而伴随分析化学、生物科学、生命科学和医学等学科的飞速发展，有机荧光染料已经被广泛地应用在生物分子标记、酶分析、环境分析、细胞染色和临床检验诊断等诸多方面，是化学、生物学、环境科学和医学研究中不可缺少的荧光信号报告团。
荧光探针是在荧光染料结构特性的基础上，通过将分子识别事件通过荧光信号有效表达的分子，它是建立在选择性分子识别和荧光技术两者有机结合的基础上，利用特定的识别反应实现目标分子的辨认并获得分子的相关信息(如种类、浓度等)，进而通过相应的信号传递机制将这种分子识别信息转换为容易检测到的荧光信号，从而实现对分析对象的识别检测。荧光探针具有灵敏度高、专一性好，快速准确、原位测定等优点，并已在核酸、蛋白质、细胞检测、免疫分析等领域得到了重要的应用。尤其是近年来，随着荧光探针技术与激光扫描共聚焦显微技术、双光子荧光成像技术、活体成像技术等相结合，更是将检测提高到单细胞水平和亚细胞水平，有效地实现了活细胞和组织内活性物质的实时、动态、可视监测，为人们探索生命的奥秘，认识生命的过程发挥了重要的作用；同时，亦可为疾病的早期诊断与治疗提供技术支撑。因此，作为化学及生物学中的主要研究内容-荧光探针的构建及发现，必将成为国际国内的研究热点。因此，开发具有实用价值的功能性有机荧光染料和荧光探针已成为当前倍受关注的研究课题。
目前，人们在有机荧光染料及其衍生物的光学性能研究和生物成像应用方面已取得很大成就，但是，在多数已被广泛使用的商业化有机荧光染料中，在光物理和光化学性能等方面存在不同的缺陷，已无法满足当前化学生物学研究和复杂体系分析检测的需求。因此，发展新型荧光染料以及对商业化荧光染料进行改性工作具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种更具应用价值的有机荧光染料骨架--类罗非昔布衍生物及其可接受的盐、异构体，该物质显示出优越的荧光特性，同时对特定COX-2酶具有强的识别能力，其结构本身可以开发成为新型有机荧光染料，也具备直接开发成为荧光探针的条件。
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述类罗非昔布衍生物的制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种类罗非昔布衍生物及其可接受的盐、异构体，所述衍生物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
其中，
所述Ar1、Ar2和Ar3彼此独立的选自芳环；
所述R、R1和R2彼此独立的选自π共轭体系和/或不同类型的供电子基团或吸电子基团。各芳环及取代基的电子特性和互相协同效应构建的电子推拉体系(pull-pushsystem)，可以产生优越的荧光性能。
具体的，所述Ar1、Ar2和Ar3彼此独立的选自苯环，或者，所述Ar1、Ar2和Ar3彼此独立的选自杂芳环。
具体的，所述R、R1和R2彼此独立的选自供电子基团或吸电子基团，或者，所述R、R1和R2彼此独立的选自π共轭体系，且所述π共轭体系上具有不同类型的供电子基团或吸电子基团的取代基。
具体的，所述供电子基团或吸电子基团包括氢、卤素、氨基、羧基、氰基、三氟甲磺酰基、三氟甲氧基、甲磺酰基、(C1-C6)烷基、(C1-C4)烷基羟基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烯基、(C1-C4)炔基、N-(C1-C9)烷基氨基、N，N-二(C1-C9)烷基氨基、(C1-C4)烷基硫基、(C1-C4)烷基亚磺酰基、(C1-C4)烷基磺酰基、(C1-C4)烷氧基甲基、(C1-C4)烷氧基乙基、(C1-C4)烷基酰基、氨基甲酰基、N-(C1-C4)基氨基甲酰基、N，N-二(C1-C4)烷基氨基甲酰基或者(C1-C3)亚烷基二氧基等。
优选的，所述供电子基团或吸电子基团包括氢、氨基、氰基、三氟甲磺酰基、甲磺酰基、N-(C1-C9)烷基氨基、N，N-二(C1-C9)烷基氨基或者(C1-C4)烷基硫基和(C1-C4)烷基亚磺酰基。
具体的，所述衍生物包括如下结构的化合物：
具体的，所述衍生物包括具有如所述式(Ⅰ)所示化合物的盐、溶剂合物、异构体、酯或前体物。
本发明还公开了一种制备所述类罗非昔布衍生物的方法，包括以选定R为氢基或甲氧基结构的罗非昔布骨架经反应得到目标化合物；
具体的，以(2a，2b)所示化合物与选定的R2芳基取代的炔类化合物经碘化亚铜和N，N-二异丙基乙胺反应得到式(Ⅰ)所示化合物。
本发明还公开了所述类罗非昔布衍生物及其可接受的盐、异构体用于制备有机荧光染料骨架的用途。
本发明还公开了一种含有机荧光染料或探针的组合物，包括所述类罗非昔布衍生物及其可接受的盐、异构体，以及生物学可接受的载体或辅料。
本发明还公开了所述含有机荧光染料或探针的组合物在生物成像领域中的应用。
本发明所述类罗非昔布系列衍生物，通过计算化学和量子轨道理论推测技术，仅在COX-2抑制剂罗非昔布结构的基础上进行一步缩合修饰，采用全新的设计策略合成得到多个有临床开发前景的小分子荧光染料和COX-2抑制剂荧光探针，使其在保持强COX-2酶抑制活性的基础上，有效提高和改善了荧光染料的光物理和光化学性能，表现出优越的荧光性能，包括高量子产率、大斯托克斯位移、双光子活性及近红外发光等特性，同时具备传统经典染料中所不具备的优良特性，克服传统染料诸多缺点，有效解决了现有近红外荧光染料的稳定性差，调控位点不足和双光子荧光染料可选择发射波段少等问题，将为今后荧光染料和探针的设计提供一种更理想的选择。由于此类探针的设计理念完全突破了传统荧光探针偶联策略，有效克服传统偶联探针存在的酶响应差和药代动力学不佳等缺点，为今后成功开发此类新型近红外NIR有机COX-2荧光探针奠定坚实基础，同时为其它针对不同靶位的荧光探针的设计与开发指明了新的思路和方向。同时，该系列荧光染料制备方法简单，将为荧光染料领域提供一种全新的染料骨架，可应用于肿瘤早期诊断的探针设计和开发。
本发明所述类罗非昔布系列衍生物，作为有机荧光染料骨架材料，其制备的荧光探针HXRF-1与现有偶联荧光探针相比，荧光性能更为突出，以本发明所述骨架材料开发出的部分化合物具有近红外NIR发光能力、双光子特性、大斯托克斯位移、光稳定性好和量子产率强等显著优点，双光子特性使其具备激发到发射区域都分布在近红外区，从而穿透很深的组织，给医生检测活体正常组织之下的癌位点带来极大便利，为今后开展活体成像研究打下坚实的基础；同时，由于骨架本身即有酶识别活性，其部分荧光染料本身即可以直接开发为荧光，探针为罗非昔布的衍生物，其对COX-2酶的抑制能力和结合能力较罗非昔布虽略有下降，但与传统的偶联COX-2探针比较，其与COX-2酶的结合能力强数十倍，可在超低浓度对酶快速响应，具有蛋白结合力强的优势；另外，由于罗非昔布本身为经典的COX-2酶抑制剂，作为消炎药物大量广泛使用，作为罗非昔布衍生物，荧光染料的使用和探针使用剂量低，无细胞毒性，具有良好的生物级组织相溶性；再者，所述系列衍生物可以对COX-2广谱表达，由于COX-2在多种癌中表达升高，如果能够将HXRF-1成功开发为癌症早期的诊断试剂，将可用于多种不同类型的癌症的早期诊断，具有较广泛的使用范围。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1-20目标化合物的结构和参数特征；
图2为本发明化合物分别在白光和365nm下的粉末及溶液状态图；
图3为本发明化合物的荧光光谱图；
图4为本发明化合物的荧光吸收和发射波长图谱；
图5为本发明化合物的细胞毒性检测结果；
图6为本发明化合物的成像能力结果；
图7为本发明化合物的双光子激发性能结果；
图8为本发明化合物的综合排放系数与激发强度的函数图；
图9为本发明化合物的不同溶剂效应结果；
图10为本发明化合物的荧光发射波长可调节性测试结果；
图11为本发明化合物的不同取代基的可调节性测试结果；
图12为本发明不同吡咯烷基取代基化合物的发射光谱；
图13为本发明不同羟基取代基化合物的发射光谱；
图14为本发明化合物的聚集诱导发光效应结果；
图15为本发明化合物的细胞荧光成像实验结果。
具体实施方式
在本发明中，基团“C1-C4烷基”、“C1-4烷基”、“(C1-C4)烷基”等，它们具有相同含义，均表示具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，其它情况亦可作类似理解。
在本发明中，基团“C1-4烷基”，包括其单独表述的、以及与其它基团组合存在的，例如可以选自C1-3烷基、C1-2烷基。同样地，C1-4烷氧基例如可以选自C1-3烷氧基、C1-2烷氧基。
在本发明合成式I化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。或者，本领域技术人员也可以根据本发明第二方面方法合成本发明未具体列举的其它式I化合物。
本发明下述实施例中：
所制备化合物的核磁共振氢谱用BrukerARX-300测定，质谱用Agilent 1100LC/MSD测定；
所用试剂均为分析纯或化学纯。
下述实施例1-20中涉及的目标合成反应物的结构和结构参数分别见附图1和表1所示，各实施例按照相应的目标化合物的结构选择相应的原料，按照本申请方法进行合成。
表1实施例1-20中目标化合物的结构式
本发明下述实施例中，各所述目标化合物的合成按照如下反应方程式进行，本领域技术人员根据目标化合物的结构选择合适的起始原料1a或1b进行相应化合物的合成。
实施例1：化合物2a1((5Z)-5-(4-氰基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
将哌啶0.12g(0.0014mol)滴加到0.4g(0.0013mol)化合物1a或1b与0.0026mol芳香醛的甲醇混合溶液中，反应在室温和黑室下搅拌12小时，反应液经检测后反应完毕，经冷却抽滤，甲醇洗涤得产品0.28g(89％)，淡黄色固体粉末。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.5Hz,2H),7.96(d,J＝8.6Hz,2H),7.88(d,J＝8.6Hz,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,2H),7.35–7.31(m,5H),6.16(s,1H),3.28(s,3H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ167.77,149.99,149.06,142.31,138.10,135.11,133.20,131.37,130.90,129.95,129.93,129.72,129.07,128.95,128.19,127.59,119.23,111.32,111.12,43.78.HR-MS(ESI):calcd for C25H17NNaO4S:450.0776([M+Na]+),found:450.0772。可见，产物结构正确。
实施例2：化合物2a2((5Z)-5-(苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a2的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为86％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.7Hz,2H),7.79(d,J＝7.4Hz,2H),7.67(d,J＝8.8Hz,2H),7.47–7.39(m,3H),7.38–7.27(m,2H),6.06(s,1H),3.28(s,3H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.12,149.44,147.98,142.21,135.46,133.47,131.02,130.88,129.87,129.65,129.51,129.22,129.02,128.15,126.28,113.39,43.79.HR-MS(ESI):calcd for C24H18NaO4S:425.0823([M+Na]+),found:425.0817。可见，产物结构正确。
实施例3：2a3((5Z)-5-(4-甲磺酰基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a3的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为88％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09–8.00(m,4H),7.96(d,J＝8.5Hz,2H),7.68(d,J＝8.5Hz,2H),7.39–7.25(m,5H),6.19(s,1H),3.28(s,3H),3.22(s,3H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ167.86,149.90,149.12,142.30,140.78,138.35,135.14,131.42,130.92,129.73,129.70,129.11,129.08,128.97,128.19,127.99,127.97,127.55,111.10,43.79.HR-MS(ESI):calcd for C25H20NaO6S2:503.0599([M+Na]+),found:503.0588。可见，产物结构正确。
实施例4：2a4((5Z)-5-(2,6-二甲基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a4的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为68％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.3Hz,2H),7.70(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(d,J＝8.1Hz,2H),7.45–7.40(m,3H),7.37–7.30(m,5H),6.16(s,1H),3.28(s,3H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ167.42,149.96,147.27,142.50,134.78,134.66,134.65,131.57,130.88,130.78,130.09,129.82,129.11,128.91,128.73,128.65,128.33,107.79,43.72.HR-MS(ESI):calcd for C24H16Cl2NaO4S:493.0044([M+Na]+),found:493.0034。可见，产物结构正确。
实施例5：2a5((5Z)-5-(2,6-二氯苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a5的制备步骤同实施例1，以化合物1b为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为73％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.73(d,J＝8.6Hz,2H),7.37–7.27(m,5H),7.21–7.01(m,3H),6.38(s,1H),3.27(s,3H),2.20(s,6H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.00,148.43,148.07,142.27,136.87,135.43,132.01,130.82,129.76,129.70,129.05,128.17,127.89,127.25,112.78,43.75,20.90.HR-MS(ESI):calcd for C26H22NaO4S:453.1136([M+Na]+),found:453.1125。可见，产物结构正确。
实施例6：2a6((5Z)-5-(4-羟基苯亚甲基e)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a6的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为89％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.08(s,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,2H),7.68–7.59(m,4H),7.32–7.23(m,5H),6.81(d,J＝8.4Hz,2H),5.95(s,1H),3.27(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.27,159.54,149.57,145.74,142.10,135.77,133.20,130.84,129.54,129.32,128.96,128.09,124.65,124.50,116.57,114.29,43.80.HR-MS(ESI):calcd for C24H18O5SNa:441.0773([M+Na]+),found:441.0784。可见，产物结构正确。
实施例7：2a7((5Z)-5-(3-羟基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a7的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到浅黄色粉末，计算产物收率为86％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.03(d,J＝7.1Hz,2H),7.66(d,J＝7.1Hz,2H),7.37–7.26(m,6H),7.19(t,J＝7.2Hz,1H),7.12(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(d,J＝7.6Hz,1H),5.94(s,1H),3.28(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.15,158.13,149.47,147.80,142.18,135.49,134.51,130.87,130.38,129.64,129.26,129.00,128.13,126.13,122.58,117.33,117.00,113.68,43.80.HR-MS(ESI):calcd forC24H18NaO5S:441.0773([M+Na]+),found:441.0764。可见，产物结构正确。
实施例8：2a8((5Z)-5-(2-羟基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a8的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为91％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.09(s,1H),8.05(d,J＝7.6Hz,2H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.67(d,J＝7.6Hz,2H),7.34–7.26(m,5H),7.18(t,J＝7.6Hz,1H),6.91(t,J＝7.5Hz,1H),6.86(d,J＝8.0Hz,1H),6.32(s,1H),3.30(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.24,156.76,149.58,147.22,142.30,135.83,131.61,130.94,130.83,129.59,129.49,129.37,128.99,128.10,125.47,120.39,120.28,116.20,107.74,43.68.HR-MS(ESI):calcd for C24H18NaO5S:441.0773([M+Na]+),found:441.0763。可见，产物结构正确。
实施例9：2a9((5Z)-5-(2-羟基-5-氟苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a9的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为82％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),8.05(d,J＝7.6Hz,2H),7.73(d,J＝10.1Hz,1H),7.66(d,J＝7.5Hz,2H),7.36–7.22(m,5H),7.06(t,J＝8.3Hz,1H),6.91–6.82(m,1H),6.25(s,1H),3.30(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ167.94,156.61,155.06,153.14,149.30,147.97,142.38,135.58,130.80,129.65,129.61,129.18,129.03,128.15,126.15,121.10,121.05,118.21,118.05,117.23,117.18,116.06,115.90,106.48,43.67.HR-MS(ESI):calcd for C24H18FO5S:437.0853([M+H]+),found:437.0851。可见，产物结构正确。
实施例10：2a10((5Z)-5-(2-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a10的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到浅黄色粉末，计算产物收率为81％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.68(d,J＝8.0Hz,2H),7.62(d,J＝7.9Hz,1H),7.33–7.26(m,5H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),6.85(t,J＝8.0Hz,1H),6.35(s,1H),4.03(q,J＝6.8Hz,2H),3.30(s,3H),1.28(t,J＝6.9Hz,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.23,149.61,147.35,147.17,146.44,142.32,130.84,129.58,129.50,129.36,129.00,128.07,122.39,120.71,120.04,114.75,107.78,64.84,43.67,15.08.HR-MS(ESI):Calcd for C26H22NaO6S:485.1034([M+Na]+),found:485.1020。可见，产物结构正确。
实施例11：2a11((5Z)-5-(2-羟基-5-氯苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a11的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为73％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.44(s,1H),8.05(d,J＝7.7Hz,2H),7.97(s,1H),7.66(d,J＝7.8Hz,2H),7.36–7.26(m,5H),7.23(d,J＝8.7Hz,2H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),6.22(s,1H),6.22(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ167.98,155.56,149.29,148.06,142.39,135.56,130.92,130.80,129.65,129.62,129.16,129.04,128.15,126.20,123.65,121.97,117.87,105.98,43.67.HR-MS(ESI):calcd forC24H17ClNaO5S:475.0377([M+Na]+),found:475.0372。可见，产物结构正确。
实施例12：2a12((5Z)-5-(4-(二甲胺基)苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a12的制备步骤同实施例1，以化合物1a或1b为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为86％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.01(d,J＝7.8Hz,2H),7.69–7.59(m,4H),7.27(s,5H),6.72(d,J＝8.0Hz,2H),5.93(s,1H),3.28(s,3H),2.96(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.36,151.30,149.38,144.54,141.98,136.09,132.94,130.83,129.89,129.43,129.01,128.91,128.07,122.88,120.95,115.33,112.50,43.81.HR-MS(ESI):calcd for:446.1426([M+H]+),found:446.1419.Chemical Formula:C26H24NO4SExact Mass:446.1426。可见，产物结构正确。
实施例13：2a13((5Z)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基-5-(4-(吡咯-1-基)苯亚甲基)呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a13的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到红色粉末，计算产物收率为78％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.01(d,J＝8.0Hz,2H),7.63(d,J＝6.9Hz,4H),7.34–7.18(m,5H),6.57(d,J＝8.6Hz,2H),5.92(s,1H),3.31–3.20(m,7H),1.96–1.89(m,4H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.38,149.37,148.80,144.19,141.96,136.17,135.30,133.15,130.83,129.98,129.40,128.91,128.06,122.49,120.50,115.71,112.56,47.77,43.81,25.48.HR-MS(ESI):calcd for C28H25NNaO4S:472.1577([M+H]+),found:472.1574。可见，产物结构正确。
实施例14：2a14((5Z)-5-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯亚甲基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a14的制备步骤同实施例1，以化合物1a或1b为起始原料合成，得到橙色粉末，计算产物收率为72％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.01(s,2H),7.63(d,J＝7.7Hz,2H),7.27(s,5H),6.95(s,2H),5.94(s,1H),3.30–3.19(m,8H),2.38(s,3H),2.17(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.29,151.71,149.41,145.29,142.03,135.92,132.73,130.83,129.72,129.48,129.16,128.93,128.08,123.68,123.29,123.07,114.81,114.63,54.88,47.11,46.27,43.81；HR-MS(ESI):calcd for C29H29N2O4S:501.1848([M+H]+),found:501.1834。可见，产物结构正确。
实施例15：2a15((5Z)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-3-苯基-5-(2-(吡咯-1-基)苯亚甲基)呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a15的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为71％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.7Hz,2H),7.85(d,J＝9.9Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.37–7.28(m,5H),7.25–7.14(m,1H),6.99–6.86(m,2H),6.02(s,1H),3.28(s,3H),3.11–2.98(m,4H),1.75–1.71(m,4H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.33,150.35,149.54,146.56,142.22,136.02,131.62,130.70,130.66,129.47,129.43,129.03,128.07,124.92,123.07,120.63,116.88,112.36,52.68,43.75,24.96.HR-MS(ESI):calcd for C25H20NaO6S:471.0878([M+Na]+),found:471.0863。可见，产物结构正确。
实施例16：2a16((Z)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-5-(2-***啉苯亚甲基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a16的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为76％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.10(d,J＝7.3Hz,2H),8.01(d,J＝7.3Hz,1H),7.71(d,J＝7.3Hz,2H),7.38–7.28(m,6H),7.17(t,J＝6.9Hz,1H),7.08(d,J＝7.6Hz,1H),6.18(s,1H),3.43(s,4H),3.27(s,3H),2.77(s,4H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.24,152.57,149.80,148.03,142.25,136.15,131.15,131.02,130.79,129.63,129.46,129.28,129.08,128.16,126.58,125.38,123.96,119.79,109.59,66.94,53.20,43.85.HR-MS(ESI):calcd for C28H25NNaO5S:510.1351([M+Na]+),found:510.1357。可见，产物结构正确。
实施例17：2a17((Z)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)-5-(4-吗啉基苯亚甲基)-3-苯基呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2a17的制备步骤同实施例1，以化合物1a为起始原料合成，得到红色粉末，计算产物收率为89％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02(d,J＝8.5Hz,2H),7.67(d,J＝9.1Hz,2H),7.63(d,J＝8.6Hz),7.32–7.25(m,5H),6.97(d,J＝9.2Hz,2H),5.95(s,1H),3.71–3.66(m,4H),3.28(s,3H),3.23–3.19(m,4H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ168.29,151.84,149.43,145.47,142.04,135.89,132.68,130.84,129.68,129.50,129.21,128.95,128.09,123.89,123.56,114.69,114.50,66.41,47.45,43.80.HR-MS(ESI):calcd forC28H26NO5S:488.1532([M+H]+),found:488.1523。可见，产物结构正确。
实施例18：2b1((Z)-5-(4-羟基苯亚甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2b1的制备步骤同实施例1，以化合物1b为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为89％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.04(s,1H),8.03(d,J＝7.2Hz,2H),7.64(s,4H),7.23(d,J＝8.1Hz,2H),6.87(d,J＝8.0Hz,2H),6.80(d,J＝7.7Hz,2H),5.88(s,1H),3.70(s,3H),3.28(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.48,160.12,159.36,147.75,145.87,142.00,136.12,133.02,130.89,130.82,128.16,124.74,124.04,121.69,116.53,114.54,113.41,55.72,43.83.HR-MS(ESI):calcd for C25H20NaO6S:471.0878([M+Na]+),found:471.0868。可见，产物结构正确。
实施例19：2b2((Z)-5-(3-羟基苯亚甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)呋喃-2(5H)-酮)
/>
本实施例化合物2b2的制备步骤同实施例1，以化合物1b为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为86％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.61(s,1H),8.04(d,J＝7.9Hz,2H),7.66(d,J＝7.9Hz,2H),7.31(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),7.18(t,J＝7.8Hz,1H),7.09(d,J＝7.6Hz,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),5.87(s,1H),3.70(s,3H),3.28(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.35,160.34,158.11,147.92,147.56,142.08,135.88,134.61,131.04,130.85,130.35,128.21,125.58,122.43,121.41,117.14,116.91,114.58,112.83,55.75,43.84.HR-MS(ESI):calcd for C25H20NaO6S:471.0878([M+Na]+),found:471.0871。可见，产物结构正确。
实施例20：2b3((Z)-5-(2-羟基苯亚甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-(甲磺酰基)苯基)呋喃-2(5H)-酮)
本实施例化合物2b3的制备步骤同实施例1，以化合物1b为起始原料合成，得到黄色粉末，计算产物收率为78％。
所得化合物的核磁数据为：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),8.06(d,J＝8.0Hz,2H),8.00(d,J＝7.7Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(d,J＝8.5Hz,2H),7.17(t,J＝7.5Hz,1H),6.91–6.83(m,4H),6.26(s,1H),3.70(s,3H),3.31(s,3H).13C-NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.45,160.24,156.61,147.70,147.34,142.19,136.20,131.38,130.97,130.82,128.18,124.96,121.52,120.50,120.25,116.16,114.57,106.90,55.74,43.72.HR-MS(ESI):calcd for C25H20NaO6S:471.0878([M+Na]+),found:471.0863。可见，产物结构正确。
实验例
1、溶液状态
分别观察上述化合物2a1-2a17及2b1-2b3分别在白光和365nm下的粉末及溶液状态，上述化合物2a1-2a17及2b1-2b3分别在白光和365nm下的粉末及溶液状态图和荧光光谱图分别见图2中(a)-(t)所示。
需要说明的是，各化合物溶解于二甲基亚砜(0.1mM)中制得溶液，左边部分照片的黑色背景是在手持式紫外灯下拍摄的，而后边部分照片的是在正常光照条件下肉眼拍摄。
可见，在固体状态下，多数化合物在紫外365nm紫外灯照射下表现出强的荧光特性。在溶液状态下，大多数化合物也表现出类似的荧光性能。
2、归一化吸收和荧光发射光谱
分别测定上述制备的化合物2a1-2a17及2b1-2b3的荧光光谱，测试结果分别见附图3中(a)-(t)所示。
上述制备的化合物2a1-2a17及2b1-2b3的荧光吸收和发射波长图谱分别见附图4中(a)和(b)所示。
上述制备的化合物2a1-2a17及2b1-2b3的荧光参数见下表2所示。
表2化合物2a1-2a17及2b1-2b3的荧光参数
Dye λmax(nm)a λmax(nm)b Stokes shift[c] Фf d
2a1 365 455 90 0.38
2a2 364 462 98 0.26
2a3 361 453 92 0.06
2a4 329 449 120 0.03
2a5 335 471 136 0.04
2a6 394 541 148 0.23
2a7 372 483 111 0.02
2a8 387 556 169 0.01
2a9 394 580 186 <0.01
2a10 382 664 282 0.01
2a11 394 587 193 0.03
2a12 474 661 187 0.11
2a13 487 656 169 0.18
2a14 454 649 195 0.18
2a15 432 680 248 0.25
2a16 391 677 286 0.94
2a17 446 652 206 0.40
2b1 398 537 139 <0.01
2b2 386 500 114 0.03
2b3 385 530 145 0.02
a.最强吸收波长.b.最强的发射波长.c.单位:nm.d.Фf：用FLS980 spectrometer(Edinburgh)测定固态荧光量子产率.
可见，在近红外区的化合物表现出较高的荧光量子产率，其中2a16的量子产率高达0.94。由于其具备较高的量子产率，从而具备了成为商业化荧光染料的潜能。
3、细胞毒性检测
本发明所述类罗非昔布衍生物作为一种新的类型有机荧光染料，其组织相溶性和生物学毒性是首先要考察的指标之一，本实验例通过对上述荧光特性优越的化合物2a12、2a13和2a16开展体外细胞毒活性检测。
方法：选择RAW 264.7和HeLa cells等细胞株，采用MTT法，测定目标化合物对肿瘤细胞的生长抑制率。A.选用对数生长的人肿瘤细胞，胰酶消化后，用10％小牛血清的RPMI1640培养液配成40000个/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，37℃5％CO2培养24h。B.实验组换新的含5ng/mL测试样品的培养液，设对照组，37℃5％CO2培养3d。C.弃上清液，加入100μL的0.5mg/mL MTT，培养4h。弃上清液，加入200μL DMSO溶解MTT沉淀，混匀，测定波长544nm处的光密度值。
上述制备的化合物2a12、2a13和2a16的细胞毒性检测结果见附图5中(a)和(b)所示。其中，图5中(a)为以HeLa细胞分别在浓度为3.125-12.5μM浓度化合物2a12、2a13和2a16中37℃培养24h后，以MTT法检测的细胞毒性结果；图(b)为以Raw 264.7细胞分别在浓度为3.125-12.5μM浓度化合物2a12、2a13和2a16中37℃培养24h后，以MTT法检测的细胞毒性结果。
可见，本发明化合物的细胞毒性低，具有强的生物组织相溶性，为成功开发为有机荧光染料和有机荧光探针奠定基础。
4、化合物透膜能力荧光成像实验
分别对上述化合物2a2、2a10和2a16进行透膜能力荧光成像实验，分别取HeLa细胞置于浓度为5μM的化合物2a2、2a10和2a16中处理2h(放大倍数×40，λex:405nm；Greenλem：500-550nm；Redλem：570-1000nm)。
化合物2a2、2a10和2a16的成像能力结果见附图6所示。
可见，本发明所述衍生物中，发现三个不同发射波长的化合物均具有较强的透膜能力，为后期将它们成功开发成为新型有机荧光染料和新型有机荧光探针铺平道路。
5、双光子荧光特性
本实施例中分别以化合物2a1和2a17为例，测试化合物的双光子荧光特性，化合物2a1和2a17的双光子激发性能分别见附图7中(a)和(b)所示。其中，图7中(a)为化合物2a1在730nm激发下的光致发光光谱，图7中(b)为化合物2a17在900nm激发下的光致发光光谱；双光子吸收和光致发光过程示意图(右)，730nm/900nm脉冲激光激发2a1/2a17的强蓝光发射(下)。
进一步的，化合物2a1和2a17的发射与激发强度的函数图分别见图8中(a)和(b)所示。
可见，本发明发现的有机荧光染料表现出强的双光子特性，如上图7和8中的化合物2a1和2a17等有机染料，其双光子现象通过多个实验给予证实。双光子特性使本发明的新型荧光染料具备更强的生物成像应用价值，使其在激发波长和发射波长都处在近红外区，具备强的组织穿透能力，为将来开发成为生物成像及诊断试剂打下坚实基础。
6、化合物溶剂效应
分别对上述化合物2a13、2a14、2a16和2a17进行不同溶剂效应的测试，测试结果分别见附图9中(a)-(d)所示。其中，极性测试溶剂分别为DCM、Tol、DMF、DMSO和EtOH，均配成浓度为0.1M的溶液，分别记录各目标化合物在不上述同溶剂中的发射光谱，图像是以手持紫外线灯(365nm)进行拍摄。
可见，本发明开发的系列有机荧光染料化合物，具有化合物溶剂效应，在不同极性溶剂下表现出不同的发射光谱特性，具有开发成为感知生物体内微环境变化的荧光探针的潜力。
7、荧光染料荧光发射波长可调节性
分别对化合物2a1、2a2、2a3、2a6、2a8、2a9、2a12、2a13、2a16和2b3进行荧光发射波长可调节性测试，测试结果见附图10所示。可见，本发明发现的系列有机荧光染料化合物，具有强的发射波长可调节性。
分别以2a1、2a2、2a3、2a6、2a12和2a13为例，通过改变取代基的类型对其进行分析，测试其荧光性能的可调节性，测试结果见附图11所示。可见，通过对化合物取代基的类型进行改变，使系列化合物表现出从蓝光到近红外发射波长的能力，可以通过对取代基类型进行分析，通过Hammett方程构建了结构与荧光的“构荧”关系，为后期开发出更为优越的荧光探针提供强有力的科学指导和依据。
8、取代基位置效应对荧光发射波长和荧光强度的影响
以化合物2a16和2a17为例，研究含吡咯烷基的化合物的发射光谱(即取代基位于苯环的邻位和对位)，测试结果见附图12所示。
以化合物2a1-2a3为例，研究OH基在Ar3苯环不同位置对荧光发射性能的影响，其中，附图13中(a)为不同位置OH基结构对发射光谱的影响结果，附图13中(b)为不同位置OH基结构对荧光强度的影响结果。
可见，通过对相同取代基、不同取代位置的化合物结构会对荧光特性产生显著的影响；如化合物2a16和2a17同为***啉取代的化合物，邻位取代效应，使其发射波长红移并且荧光量子产率提高明显；同样，化合物2b1、2b2、2b3也表现出同样的现象，同为羟基取代的化合物，由于羟基位置不同，其发射波长和荧光强度会发生改变，为后期该新型有机荧光染料的深入开发提供指导。
9、聚集诱导发光效应(AIE)
从AIE概念的提出到现在，全世界已经有80余个国家和地区超过1500个国际团队进入该领域，2016年，AIE材料及相关研究先后被英国《自然》，美国《***》和CNBC(美国全球性财经电视频道)等杂志和媒体进行亮点报道。在《自然》发表的“纳米光革命正在来临”(The nanolight revolution is coming)的科学新闻深度分析长文中，AIE纳米材料(AIE点)被列为支撑即将来临的纳米光革命的四大纳米材料体系之一。目前大部分商业化荧光探针的知识产权都由国外企业把控，如美国一家生物荧光标记和检测产品的提供商，其生物用荧光产品价格昂贵、利润高，仅2012年，整个公司的年产值就高达38亿美元，收益率大于29％；另外，现在大部分商用荧光探针效率都不是十分理想。因此，开发具有AIE性能优势的材料和技术，并进行产业化和市场化，使AIE材料体系及其在应用领域的突破切实为人民生活质量的提高和医疗条件的改善贡献力量非常重要。
以化合物2a16为例，测试其聚集诱导发光效应(AIE)，测试结果见附图14所示，其中，图14中(a)为不同激发波长下的荧光强度值，图14中(b)为不同含水率下的荧光强度值。
可见，本发明制得化合物2a16表现出聚集诱导发光效应(AIE)，可以克服传统有机荧光染料中的聚集淬灭效应(ACQ)。
10、识别癌细胞的能力
以化合物2a16为例，测试本发明系列化合物识别癌细胞的能力，通过对细胞荧光成像实验，测试结果见附图15所示。可见，本发明所述化合物2a16本身具备识别HeLa癌细胞的能力，这种新型的有机荧光染料不仅可以作为一种新的荧光染料骨架，开发成为新的商业化的荧光染料，由于具有COX-2酶的强的靶向能力，有望开发成为新型的癌症早期诊断试剂。
11、利用TDDFT预测化合物的激发谱和发射谱
利用TDDFT(Time-Dependent Density Functional Theory)模型测试化合物2a2、2a6和2a12的激发谱和发射谱，
我们使用Gaussian 09软件包，根据含时密度泛函理论(TDDFT)，在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平，预测了化合物2a2、2a6 2a12在DMSO溶剂中的吸收光谱和发射光谱。DMSO的溶剂效应通过使用默认的IEFPCM模型来模拟。在基态下的LUMO和HOMO分子轨道能之间的差异被用来计算最大吸收波长。发射光谱是根据Franck-Condon原理来计算第一激发态与第二激发态之间的能量差所对应的波长。计算得到的光谱如表3所示。
表3化合物的激发谱和发射谱结果
可见，与实验值相比，理论值与实测值数值较为接近，充分说明利用能量轨道计算能较为准确的预测化合物的吸收和发射光谱值。
12、利用计算模拟化合物对COX-2的酶的结合能力
以化合物2a12-2a17为例，对化合物与COX-2的酶的结合能力进行测试，结果见下表4。
COX-2配合物的实验晶体结构从蛋白质数据库中获得(PDB：5KIR)。化合物的分子模型为由Discovery Studio 3.5构建。蛋白质和配体通过AutoDockTools 1.5.6来添加极性氢原子和它们的部分电荷。分子对接工作是通过AutoDock 4.2进行的。网格点在x，y，z轴处设置为50。Dock的运行次数设置为20.所有其他参数保留为默认值。
表4结合自由能结果
可见，在近红外区的多个化合物均表现出较强的与COX-2的结合能力，使其具备成为COX-2荧光探针的极大潜能。综上，本发明涉及的类罗非昔布系列化合物作为一种新的有机荧光染料，不仅表现出优越的荧光学特性，如双光子特性，近红外发光，大的斯托克斯位移和高量子产率等；同时，通过对细胞荧光成像实验，发现化合物2a16本身具备识别HeLa癌细胞的能力，并具有COX-2酶的强的靶向能力，这种新型的有机荧光染料不仅可以作为一种新的荧光染料骨架，开发成为新的商业化的荧光染料，并有望开发成为新型的癌症早期诊断试剂，具有极大的应用价值。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种类罗非昔布衍生物用于制备COX-2有机荧光探针的用途，其特征在于，所述衍生物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
其中，
所述Ar1、Ar2和Ar3均为苯环；
所述R为甲磺酰基；
所述R1和R2彼此独立的选自氢、卤素、甲基、氰基、甲氧基、乙氧基或二甲基氨基。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述衍生物的制备方法包括以选定R为甲磺酰基结构的罗非昔布骨架化合物经反应得到目标化合物的步骤；
3.一种类罗非昔布衍生物用于制备COX-2有机荧光探针的用途，其特征在于，所述衍生物包括如下结构的化合物：
4.一种含COX-2有机荧光探针的组合物用于制备生物成像试剂的用途，其特征在于，所述组合物包括具有如下式(Ⅰ)所示结构的类罗非昔布衍生物，以及生物学可接受的载体或辅料；
其中，
所述Ar1、Ar2和Ar3均为苯环；
所述R为甲磺酰基；
所述R1和R2彼此独立的选自氢、卤素、甲基、氰基、甲氧基、乙氧基或二甲基氨基。
5.一种含COX-2有机荧光探针的组合物用于制备生物成像试剂的用途，其特征在于，所述组合物包括具有如下结构的类罗非昔布衍生物，以及生物学可接受的载体或辅料；
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