CN109796444B

CN109796444B - 一种近红外双荧光探针化合物及制法和应用

Info

Publication number: CN109796444B
Application number: CN201910058164.2A
Authority: CN
Inventors: 陈海燕; 袁振伟; 李瑞熙; 桂丽娟
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN109796444A

Abstract

本发明公开了一种能够特异性响应生物硫醇并能发出双波段荧光的近红外双荧光探针化合物、制备方法及其在诊断试剂盒上的应用。所述的近红外荧光探针化合物如式(I)所示，初步的体外表征及细胞实验证明该化合物可以用于区分生物硫醇及其肿瘤部位成像，实现在制备诊断试剂盒中的应用。

Description

一种近红外双荧光探针化合物及制法和应用

技术领域

本发明涉及高等有机合成物及其制法和应用，具体涉及一类基于花菁染料的近红外双荧光探针化合物，该探针化合物能响应识别生物硫醇并释放可见和近红外双波段荧光，可以实现对肿瘤部位的定位，在诊断试剂盒的开发中有良好的应用。

背景技术

在生物体中，主要通过由生物硫醇组成的生物分子维持氧化还原平衡。谷胱甘肽(GSH)，高半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)是体内三种生物硫醇，虽然它们具有相似的反应，但这三种生物硫醇的功能和分布却截然不同。由于三种生物硫醇类似的化学结构，很难将GSH与Hcy以及Cys区分，因此设计能够将其区分开的小分子荧光探针，对于研究生物硫醇具体的功能和分布具有重要的价值。

荧光成像已成为在具有高时空分辨率的生命***环境中实时监测生物硫醇和生物过程的一种重要的非侵入性技术。尤其是近红外荧光成像具有无损、在位、强穿透生物组织等优点。近年来已经成为分子诊断、肿瘤早期检测等领域的有力工具。迄今为止，已经开发了许多荧光成像探针用于检测生物硫醇。然而，由于Cys/Hcy具有与GSH类似的分子结构和反应性的事实，很少的小分子探针能够选择性区分的每种特定硫醇。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种近红外双荧光探针化合物，所述结构的化合物能够特异性区分生物硫醇，实现肿瘤部位成像，为肿瘤早期诊断试剂盒的开发提供了重要的工具。

技术方案：本发明所述的近红外双荧光探针化合物的化学结构式如式(I) 所示：

本发明制备近红外双荧光探针化合物的方法如下，包括步骤(1)和步骤(2)：

在于步骤(1)中，所采用的溶剂为有机溶剂的混合溶剂，化合物1和化合物2的摩尔比为1:1-4，反应时间8-14h，反应温度为110-130℃。经过反复的实验摸索，确认选用乙醇和苯作为混合溶剂，并且在乙醇和苯体积比为1:1，化合物1和化合物2的摩尔比为1:2，反应时间为12h，反应温度为120℃时为最佳。

在步骤(2)中，2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-色烯-4-亚基-丙二腈和化合物3的摩尔比例为1-2:1，所选用的反应催化剂为无机碱，所选用的溶剂优选 DMF，反应时间8-14h；反应温度为20-40℃。经过反复的实验摸索，确认在步骤(2)中，反应条件选择2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-色烯-4-亚基-丙二腈和化合物3的摩尔比例为1:1，反应时间为12h，反应温度为25℃为最佳。

制备过程中，选用氢化钠为催化剂。氢化钠比化合物3的摩尔比例为2:1。

有益效果：本发明通过制备一种基于双波段荧光检测生物硫醇、结构新颖、具有较好的理化性质的小分子的近红外双荧光探针化合物，探针在与GSH反应后发出近红外和可见的双通道荧光。当它与Hcy/Cys反应时，仅观察到可见的通道荧光。探针对生物硫醇的选择性监测能力通过其在细胞水平上的独特光学特性得到证实。探针通过区分和监测细胞水平和动物水平的生物硫醇，为相关疾病的诊断提供信息，在诊断试剂盒中有良好的应用前景。

附图说明：

图1式(I)化合物的与硫醇的反应机理；

图2式(I)化合物的吸收光谱、荧光光谱；

图3化合物4细胞毒性实验；

图4细胞共聚焦成像实验；

图5化合物4在荷瘤小鼠的体内分布；

图6化合物3的质谱表征；

图7化合物3的氢谱表征；

图8化合物4的质谱表征；

图9化合物4的氢谱表征；

图10化合物4的碳谱表征。

具体实施方式

以下实施例，用于详细描述本发明的内容，而不是对本发明保护范围的限制。如无特别说明，所用的原料和试剂均为普通市售产品，所采取的方法和操作方式均为本领域常规方式。

实施例1

1.化合物1合成

将三氯氧磷(15.6g,9.32mL，101.89mmol)滴加到10mL二氯甲烷(DCM) 溶液和20ml二甲基甲酰胺(DMF)(7.33g,7.7mL,100mmol)的溶液中，冰浴 0℃条件下，搅拌30分钟后，将环己酮(5g，5.26mL，50.95mmol)的10mL DCM 溶液加入上述混合物中，氮气保护，并在80℃下搅拌4小时。然后将其冷却至室温并倒入冰水，静置过夜，得到黄色固体粉末(5g，56.9％，m.p.121℃)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:10.86(s,1H),10.15(s,1H),7.56(s,1H),, 2.38(m,4H),1.57-1.62(qui,2H,J＝5Hz)；HRMS(ESI):(M+H)+calcd for C₈H₁₀ClO₂,172.0291；found 172.0294.

2.化合物2合成

将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.48mmol)和3-溴-丙酸(5.73g，37.44mmol) 的加到15mL乙腈中，氮气保护，100℃下搅拌15小时。冷却至室温后，将反应混合物滴加到冰***中。收集红色沉淀物并用石油醚(30mL)洗涤。通过柱色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷和甲醇(30：1，v/v)作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到浅紫色固体粉末(1.62g，55.9％，m.p.186℃)。

HRMS(ESI):m/z,calcd for C₁₄H₁₉NO₂ 233.1410(M+H)⁺,found 233.1401.

3.化合物3合成

将化合物2(1.64g，7.07mmol)和化合物1(0.61g，3.53mmol)溶解在装有Dean-Stark分水器的烧瓶中的50mL溶剂(乙醇/苯＝1：1)中。将反应混合物，氮气保护，回流12小时，得到深绿色溶液。反应完成后，减压除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷和甲醇(40：1，v/v) 作为洗脱剂，得到绿色固体粉末(1.41g，60.39％，m.p.208℃)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.27-8.30(d,2H,J＝15Hz),7.64-7.66(d,2 H,J＝10Hz,Ar-H),7.46(m,4H,Ar-H),7.30-7.32(t,2H,J＝5Hz,Ar-H),6.40-6.43 (d,2H,J＝10Hz,Ar-H),4.50-4.52(t,4H,J＝5Hz),4.02-4.07(q,4H,J＝5Hz, -OCH2),2.84-2.86(t,4H,J＝5Hz),2.75(m,4H),1.81(t,2H,J＝5Hz),1.69(s,12 H),1.10-1.13(t,6H,J＝5Hz)；HRMS(ESI):m/z,calcd for C₄₀H₄₈ClN₂O₄ 655.3297 (M+H)+,found 655.3295

4.化合物4合成

将2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-色烯-4-亚基-丙二腈(95.2mg，0.3mmol) 和NaH(14.6mg，0.6mmol)溶于10mL无水DMF中，在室温下搅拌15分钟后，将化合物3(200mg，0.3mmol)加入到含上述反应溶液缓慢的反应烧瓶中，氮气保护，在室温下搅拌12h。然后减压除去溶剂，粗产物用二氯甲烷/甲醇(20： 1,v/v)通过硅胶色谱法纯化，得到深绿色固体化合物4(198.8mg，69.7％)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.74-8.76(d,J＝10Hz,1H),7.79-7.94(m,7 H),7.62-7.64(t,J＝5Hz,1H),7.50-7.52(d,J＝10Hz,2H),7.44(s,1H),7.38-7.40 (m,4H),7.29-7.31(d,J＝10Hz,2H),7.21-7.23(t,J＝5Hz,2H),7.02(s,1H), 6.29-6.32(d,J＝15Hz,2H),4.43-4.45(t,J＝5Hz,4H),3.99-4.03(td,J＝5Hz,10 Hz,4H),2.78-2.80(d,J＝10Hz,8H),1.99(s,2H),1.69(s,2H),1.31(m,10H), 1.09-1.13(t,6H)；¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:172.27,171.02,162.53,161.45, 158.73,153.45,152.54,142.17,141.32,141.15,135.94,131.17,129.97,128.92, 126.68,125.40,125.15,122.88,122.23,119.51,118.86,117.59,116.38,115.73, 111.76,106.93,101.46,60.98,60.54,49.07,32.08,27.97,27.69,24.23,21.11,15.65, 14.36；HRMS(ESI):m/z,calcd for C₆₀H₅₉N₄O₆931.4429(M+H)⁺,found 931.4437.

实施例2

1.化合物1合成方法同实施例1完全一致

2.化合物2合成方法同实施例1完全一致

3.化合物3合成

将化合物2(1.64g，7.07mmol)和化合物1(0.61g，3.53mmol)溶解在装有Dean-Stark分水器的烧瓶中的50mL溶剂(乙醇/苯＝1：1)中。将反应混合物，氮气保护，温度100℃下反应12小时，得到深绿色溶液。反应完成后，减压除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷和甲醇(40：1，v/v)作为洗脱剂，得到绿色固体粉末(1.2g，51.4％，m.p.208℃)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.27-8.30(d,2H,J＝15Hz),7.64-7.66(d,2 H,J＝10Hz,Ar-H),7.46(m,4H,Ar-H),7.30-7.32(t,2H,J＝5Hz,Ar-H),6.40-6.43 (d,2H,J＝10Hz,Ar-H),4.50-4.52(t,4H,J＝5Hz),4.02-4.07(q,4H,J＝5Hz, -OCH2),2.84-2.86(t,4H,J＝5Hz),2.75(m,4H),1.81(t,2H,J＝5Hz),1.69(s,12 H),1.10-1.13(t,6H,J＝5Hz)；HRMS(ESI):m/z,calcd for C₄₀H₄₈ClN₂O₄ 655.3297 (M+H)+,found 655.3295.

4.化合物4合成

将2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-色烯-4-亚基-丙二腈(95.2mg，0.3mmol) 和NaH(14.6mg，0.6mmol)溶于10mL无水DMF中，在室温下搅拌15分钟后，将化合物3(200mg，0.3mmol)加入到含上述反应溶液缓慢的反应烧瓶中，氮气保护，在15℃下搅拌12小时。然后减压除去溶剂，粗产物用二氯甲烷/甲醇 (20：1，v/v)通过硅胶色谱法纯化，得到深绿色固体化合物4(170mg，59.7％)。

实施例3

1.化合物1合成方法同实施例1完全一致

2.化合物2合成方法同实施例1完全一致

3.化合物3合成

将化合物2(1.64g，7.07mmol)和化合物1(0.61g，3.53mmol)溶解在装有Dean-Stark分水器的烧瓶中的50mL溶剂(乙醇/苯＝1：1)中。将反应混合物，氮气保护，温度130℃下反应12小时，得到深绿色溶液。反应完成后，减压除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，使用二氯甲烷和甲醇 (40：1，v/v)作为洗脱剂，得到绿色固体粉末(1.3g，56.1％，m.p.208℃)。

4.化合物4的合成

将2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-色烯-4-亚基-丙二腈(95.2mg，0.3mmol) 和NaH(14.6mg，0.6mmol)溶于10mL无水DMF中，在室温下搅拌15分钟后，将化合物3(200mg，0.3mmol)加入到含上述反应溶液缓慢的反应烧瓶中，氮气保护，在40℃下搅拌12小时。然后减压除去溶剂，粗产物用二氯甲烷/甲醇 (20：1，v/v)通过硅胶色谱法纯化，得到深绿色固体化合物4(180mg，63.4％)。

实施例4

本例包含本发明的化合物的反应机理、光学性质、细胞、动物模型实验及结果。

1.化合物反应机理

通过质谱验证了所合成的近红外双荧光探针化合物与GSH、Hcy/Cys的反应机理。从图1可以看到，探针与GSH反应以后，生成了具有近红外荧光性质的 Cy-SG以及具有可见波段荧光性质的DCM。而当探针与Cys/Hcy反应后生产的产物中一个片段在近红外波段只有微弱荧光，而在可见波段显示出明显的荧光。通过不同的荧光效应，探针可以区分GSH与Cys/Hcy。

2.光学性质

基于反应机理，我们在体外测定了探针的光学性质。测试体系选用 PBS(pH＝7.4,10mmol,50％DMSO)。测定结果如图2所示，探针分别于GSH、Cys、Hcy反应，从图2中的 A和图2中的 B我们看到探针与GSH反应后，在560nm(Ex＝488 nm)、810nm(Ex＝700nm)出现两个通道的明显的荧光增强。而探针与Cys/Hcy反应后,仅在560nm(Ex＝488nm)出现荧光增强。810nm(Ex＝700nm)的荧光强度几乎没有增强。图2中的 C,图 2中的 D显示了探针与GSH反应的时间依赖性曲线。图2中的 E,图 2中的 F 显示了探针与GSH反应的浓度依赖性曲线。通过以上光谱结果，我们看到探针在体外测定中具有良好的双荧光发射光学特性，可以进一步应用于体内外研究。

3.细胞毒性

通过MTT测定在四种细胞系(L02，A549，MCF-7和U87细胞)中评估体外细胞毒性。将细胞接种到96孔细胞培养板(1×10⁴/孔)中，随后在CO₂培养箱中孵育24小时，加入化合物4(100μL/孔)，浓度范围为0至20μM后，将细胞在5％CO₂、37℃培养条件下继续培养24小时。将每个孔用PBS(pH＝7.4) 洗涤三次，加入100μL培养基，再加入MTT溶液(15μL，5.0mg mL^-1)一起孵育4小时。取出96孔细胞培养板，将培养基从孔中吸出，每孔加入150μL的 DMSO溶液，置摇床上低速振荡20min，将96孔细胞培养板放入酶标仪中检测在490nm处吸光度。如图3所示，当探针浓度低于10μM时，U87细胞和L02 细胞的细胞活力分别高于90％和80％。这种差异可能是由癌细胞的耐药性引起的。基于以上，化合物4可以进一步应用于细胞成像实验，因为它具有相对较低的细胞毒性，良好的生物安全性和理想的生物相容性。

4.细胞共聚焦成像实验

将U87、L02细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种在共聚焦培养皿中，随后在 37℃下在5％CO₂、37℃培养条件中培养。当整个细胞占据培养皿的70％-80％空间时，将细胞用DMSO/HEPES缓冲液(1：99，v/v)中的化合物4(100μL， 1μM)处理不同时间(0.5小时，1小时，2小时和4小时)。将细胞用Mito-Tracker Red(1.0μM)染色30分钟，进行线粒体染色，然后用PBS缓冲液洗涤三次以除去游离染料。在FV1000激光共聚焦荧光显微镜(LCFM，Olympus，Japan)上记录荧光图像。在NIR荧光通道(780±20nm，λ_ex＝690nm)和绿色荧光通道 (520±20nm，λ_ex＝488nm)，蓝色荧光通道(610±20nm，λ_ex＝579nm)下分别收集荧光信号。通过U87和L02细胞评估探针化合物4的细胞内生物硫醇响应能力。相对高比例的生物硫醇存在于U87细胞的细胞质中，U87细胞是恶性增殖性神经胶质瘤细胞。如图4所示，探针在与细胞中的生物硫醇反应后发出近红外和可见的双通道荧光。此外，随着探针和细胞之间共培养时间的增加，荧光强度增强。1小时后观察到最大强度。因此，验证了定量区分Hcy/Cys和GSH的能力。L02细胞(正常人肝细胞)中细胞生物硫醇的量低于癌细胞，因此L02细胞用作对照组以进一步检查探针对肿瘤细胞的成像能力。如图4所示，探针在与 L02细胞中的生物硫醇反应后也发出双通道荧光，但荧光强度明显弱于U87细胞。以上结果表明探针化合物4可用于癌细胞内的生物硫醇成像，以及体外识别癌细胞。

5.荷瘤小鼠的体内分布

当肿瘤(EAC)体积达到约100mm³时，给携带肿瘤的小鼠静脉注射化合物 4(200μL，10μM)。以预定间隔(10分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时， 8小时，12小时，24小时和48小时)获取NIR荧光图像，并且在样品注射之前拍摄小鼠的背景图像。为了进一步比较探针的肿瘤靶向能力，使用Scion Image 软件的感兴趣区域(ROI)功能计算不同时间点的肿瘤与正常组织对比率(T/N)。此外，还在注射后24小时解剖荷瘤小鼠，并收集器官(肿瘤，肠，肾，肺，脾，肝和心脏)的荧光图像。如图5中的 A所示，在尾静脉注射化合物4半小时后，在荷瘤小鼠的腹部观察到明显的荧光，其在72小时后几乎消失。在肿瘤部位，注射后8小时出现微弱的荧光信号，但在24小时后明显增加。这种现象可能是由于相对旺盛的代谢和肿瘤部位的硫醇含量增加，导致更多的游离探针通过血液循环聚集。探针注射后24小时的体外组织的荧光强度示于图5中的 B中。此时荧光信号在肿瘤，肝脏和肠道部位更强，表明探针在体内通过肝肠循环代谢。探针在剧烈代谢肿瘤部位的分布表明，化合物4可以对肿瘤部位过表达的硫醇产生反应。

6.化合物谱图表征

图6-10是探针及其合成中的关键中间体的¹H-NMR、HRMS、¹³C-NMR谱图。

Claims

1.一种近红外双荧光探针化合物，其特征在于该化合物如式(I)所示：

。

2.一种权利要求1所述的近红外双荧光探针化合物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)-(2)：

。

3.一种组合物或诊断试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述近红外双荧光探针化合物。

4.一种权利要求1所述近红外双荧光探针化合物在制备生物硫醇检测试剂中的应用。