CN112305104A - 一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，用于测定36种兽药中的1种或多种在禽畜肉中的残留量，包括如下步骤：(1)样品前处理：取待测样品进行酶解，得酶解液；向所述酶解液中加入均质子和甲酸乙腈溶液，涡旋，离心，得第一上清液；将所述第一上清液加入分散固相萃取管中，涡旋，离心，得第二上清液；向第二上清液中加入均质子和无水硫酸盐，混匀，离心，得第三上清液；将第三上清液与水混合，过滤，得待测样液；(2)液相色谱‑质谱测定：将所述待测样液进行液相色谱‑质谱分离测定；(3)根据测定结果定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量。

Description

一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法

技术领域

本发明属于食品添加剂检测领域，具体涉及一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法。

背景技术

β-受体激动剂类药物由于其可促进动物体肌肉生长、脂肪分解，增加瘦肉比例，被滥用于畜牧养殖过程中。此类药物也被称之为“瘦肉精”。传统意义上的“瘦肉精”主要是盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等，近年来又出现了新型“瘦肉精”如苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定和巴氯芬等药物，我国农业部已禁止此类传统和新型瘦肉精药物在畜牧生产中的使用，然而其滥用情况却屡禁不止。同时，为了降低在动物运输过程中由于动物应激而造成的突然死亡，***、阿替洛尔和美托洛尔等β-受体阻滞剂类药物被用作镇静剂非法注射到动物体内。我国有关禁止将β-阻断剂作为兽药使用的明确规定很少，然而在《世界反***条列》中将其作为***在体育赛事中的禁止使用。目前禽畜肉中上述多组分兽药残留的同时测定方法较少，从而导致其不能被有效监控。

公开号为CN110208394A的中国专利文献公开了一种畜肉中莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗的检测方法。该方法包括如下步骤：(1)待测样品前处理：向待测样品中加入乙酸盐缓冲液和第一酶，混匀后放置于水浴中酶解，得到酶解液；向所述酶解液中加入氨水乙腈溶液和无水硫酸盐，混匀，离心，得到第一上清液；将所述第一上清液进行基质分散性固相萃取，得到第二上清液，经氮气吹干后复溶，滤膜过滤，得到待测样品液。(2)在所述待测样品前处理之后，采用超高效液相色谱-串联质谱法来检测待测样品液中多种特定成分的含量；所述待测样品为畜肉，所述多种特定成分为莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗。该方法仅限于莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗，满足不了实际检测工作中同时测定多组分兽药残留量的需要，并且需要氮吹、复溶等操作耗时且容易使得相应兽药残留量损失。因此，亟需开发一种简便快速测定禽畜肉中多组分兽药残留量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术仅限于对莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗进行测定，以及现有方法中需要氮吹、复溶，操作步骤耗时并且容易使得相应兽药残留量损失等问题的不足，提供一种可以实现多达36种药物残留检测的用于禽畜中兽药残留量测定的方法。

其所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实施。

一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，用于测定以下36种兽药中的1种或多种在禽畜肉中的残留量：马布特罗、克伦潘罗、克伦丙罗、溴氯布特罗、溴布特罗、奥西那林、赛布特罗、异克舒令、克仑塞罗、妥布特罗、马喷特罗、非诺特罗、福莫特罗、拉贝特罗、异克伦潘罗、丙卡特罗、特布他林、塞曼特罗、氯丙那林、喷布特罗、齐帕特罗、班布特罗、利托君、苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定、巴氯芬、沙美特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、R-美托洛尔、多巴胺、甲氧酪胺、***和阿替洛尔，其特点为，包括如下步骤：

(1)样品前处理：

取待测样品进行酶解，得酶解液；向所述酶解液中依次加入均质子和甲酸乙腈溶液，涡旋，离心，得第一上清液；

将所述第一上清液加入分散固相萃取管中，涡旋，离心，得第二上清液；

向第二上清液中依次加入均质子和无水硫酸盐，混匀，离心，得第三上清液；

将第三上清液与水混合，过滤，得待测样液；

(2)液相色谱-质谱测定：

将所述待测样液进行液相色谱-质谱分离测定；

(3)根据测定结果定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量。

作为本技术方案的进一步改进，步骤(2)中的液相色谱条件如下：

a)色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)或者性能相当；

b)柱温：30～40℃(优选40℃)；

c)流动相：A为0.1％(体积百分比)甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)，B为乙腈；

d)流速：0.3～0.4mL/min(优选0.4mL/min)；

e)进样量：1～5μL(优选1μL)；

f)洗脱方式：梯度洗脱；

步骤(2)中的质谱条件如下：

a)电喷雾离子源(ESI)；

b)正离子扫描方式；

c)动态多反应监测(DMRM)模式；

d)气帘气：172～207kPa(优选207kPa)；

e)干燥气：276～379kPa(优选379kPa)；

f)喷针电压：4500～5500V(优选5500V)；

g)离子源温度：400～550℃(优选550℃)；

h)碰撞气：41～62kPa(优选62kPa)。

作为本发明的优选实施例之一，所述均质子为陶瓷均质子，其规格为适用于50mL萃取管，加入量为1～2粒；待测样品与所述甲酸乙腈溶液的比例为每5g待测样品对应体积百分比为5％的10ml甲酸乙腈溶液。

也作为本技术方案的进一步改进，所述甲酸乙腈溶液中甲酸与乙腈的体积比为1:99-5:95(优选5:95)。

还作为本技术方案的进一步改进，所述分散固相萃取管中添加有增强型脂质去除剂。

也作为本发明的优选实施例之一，所述第三上清液与水混合体积比为1:1～1:2(优选1:1)。

作为本技术方案的更进一步改进，所述梯度洗脱程序为：初始流动B为5％(体积百分比，下同)，保持1min；1.0～2.0min，B由5％升至20％；2.2～5.0min，B由20％升至30％；5.0～7.0min，B由30％升至95％，保持1min；8.0～8.1min，B由95％降至5％，保持到10min。

进一步，定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量时，其中，马布特罗、溴氯布特罗、溴布特罗、西布特罗、克仑塞罗、妥布特罗、马喷特罗、非诺特罗、福莫特罗、丙卡特罗、特布他林、西马特罗、氯丙那林、班布特罗、利托君、可乐定、赛庚定、苯乙醇胺A、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、R-美托洛尔、多巴胺、***和阿替洛尔采用内标法定量。

也进一步，定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量时，其中，克伦潘罗、克伦丙罗、奥西那林、异克舒令、拉贝特罗、异克伦潘罗、齐帕特罗、巴氯芬、沙美特罗、喷布特罗和甲氧酪胺采用基质加标曲线法定量。

其中，所述禽畜肉为牛肉、羊肉、猪肉或鸡肉。

采用上述技术方案的测定方法，相比于现有技术，具有以下优点：

1、本发明所述的样品前处理方法，利用有机溶液对禽畜肉样品中36种性质差别大的兽药进行提取，并用增强型脂质去除剂进行净化，所得待测样液通过液相色谱-质谱联用法进行多组分兽药残留量的检测；该方法可快速提取并测定常规禽畜肉中可能残留的36种兽药，较之现有技术，本发明具有节约时间、提高测定准确度，能够最大程度对禽畜肉中目前可能使用的瘦肉精类药物和β-受体阻滞剂类药物进行监管的特点。

方法中，采用先酶解将部分结合态兽药转变为游离态再进行有机溶液提取，有利于充分有效地监测目标多组分兽药残留，进一步采用陶瓷均质子进行样品提取时间，有利于样品提取过程的均匀性，提高检测化合物的回收率。

2、本发明所述的样品前处理方法,采用甲酸乙腈溶液进行提取，甲酸与乙腈的体积比为1:99-5:95(优选5:95)，甲酸乙腈溶液不仅可以有效提取禽畜肉中的36种兽药，同时还可以沉淀酶解液中大量的蛋白质；由于所述36种兽药大部分含有羟基，加入甲酸有利于抑制羟基离子化，增加其在乙腈中的分配比例，从而提高提取效率。

3、本发明所述的样品前处理方法，所述分散固相萃取管中添加的增强型脂质去除剂，是一种新型吸附剂材料，能够选择性去除高脂肪含量基质样品中的主要脂质组分，而不会造成待测兽药意外损失。然后向萃取管中加入无水硫酸盐(例如无水硫酸镁)进行反萃取，有效去除水分且不与甲酸反应，保证待测样品溶液能够和流动相更好地融合，从而提高待测兽药的回收率，并且降低基质效应以增强质谱响应。

4、本发明采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用对所述禽畜肉中36种兽药残留进行测定，待测兽药残留在10min内完成分离并测定，采用内标法和基质加标曲线法可以更好地去除样品基质效应，提高检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法的工艺流程图；

图2是本发明的牛肉阴性样品添加36种兽药的提取离子流色谱图，图2a至图2d分别给出了多种兽药的提取离子流色谱图；

图3是本发明的猪肉阳性样品中克伦特罗(图3b)、莱克多巴胺(图3a)、沙丁胺醇(图3c)和特布他林(图3d)的提取离子流色谱图；

图4是本发明的前处理方法与对比例1中经过氮吹、复溶等操作对于部分兽药回收率的影响对比图；

图5是本发明的内标法定量和对比例2中外标法定量对于部分兽药回收率影响的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细地阐述本发明的技术特点。

仪器与试剂

ExionLCTMAD-SCIEX Triple Quad^TM6500超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国SCIEX公司)；

CU-600电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)；

WH-861涡旋混合器(太仓市华利达实验设备有限公司)；

TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；

ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱(安捷伦科技(中国)有限公司)；

36种兽药的标准品和内标物质二苯拉明、盐酸可乐定-D4、克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3以及沙丁胺醇-D3均购自北京振翔科技有限公司，以甲醇为溶剂分别配制成36种兽药的1000mg/L混合标准储备液和5种内标物质的100mg/L混合内标储备液，使用时稀释至所需要的浓度；乙酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(质谱纯，美国Fisher公司)；甲醇(色谱纯，美国Merk公司)；乙腈(色谱纯，美国Merk公司)；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(上海安谱实验科技股份有限公)；EMR-Lipid分散固相萃取管(15mL,内含增强型脂质去除剂，安捷伦科技(中国)有限公司)；陶瓷均质子(适合15mL的萃取管，安捷伦科技(中国)有限公司)；无水硫酸镁(分析纯)；试验用水由Milli-Q超纯水***制备。

1、质谱条件的优化

36种兽药化合物结构中含有胺基，在电喷雾正离子模式下分别将质量浓度为1mg/L的36种混合标准溶液和5种内标溶液针泵进样进行扫描获得[M+H]+分子离子峰。然后以分子离子为母离子进行子离子扫描，选择响应较高的两个子离子，以动态多反应监测模式(DMRM)进行检测，并优化去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)，使得母离子和子离子响应最优。同位素内标物质只选择信噪比最强的子离子，二苯拉林选择响应较好的两个子离子。西马特罗的子离子响应不高，基质干扰容易造成其线性差，在分析时选择三个子离子进行定性和定量分析。优化的质谱参数见下表1。

表1：36种兽药的质谱参数

备注：表1中的“*”表示定量离子

2、标准曲线和线性范围

(1)将采用本发明所述样品前处理所得空白基质提取液稀释36种混合标准溶液，得到质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/L的混合标准溶液系列,各个质量浓度混合标准溶液中内标浓度均为2μg/L，上机测定得到36种兽药化合物各自的色谱峰，以本发明所述25种兽药化合物的峰面积与相应内标的峰面积之比为纵坐标，其对应质量浓度为横坐标绘制标准曲线，以本发明所述11种兽药化合物的峰面积为纵坐标，其对应质量浓度为横坐标绘制标准曲线；

(2)上述所得36种兽药化合物的标准曲线，其线性相关系数r2均大于0.988,36种兽药化合物在0.1-5μg/L质量浓度范围内具有良好线性关系。

(3)以3倍标准偏差作为方法的检出限，10倍标准偏差作为方法的定量限，得到36种兽药化合物的检出限在0.026-0.30μg/kg之间，定量限在0.087-1.0μg/kg之间。

3、样品的测定

实施例1

本实施例所述禽畜肉样品为加入36种兽药混合标准溶液的牛肉阴性样品，加标量为4μg/kg，所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，如图1所示，具体包括如下步骤：

(1)样品前处理，具体包括如下步骤：

称取5g牛肉阴性样品肉糜，添加36种兽药混合标准溶液适量，使得样品中加标量为4μg/kg，涡旋混匀，放置约30min后，加入0.2moL/L乙酸钠(pH5.2)溶液5.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液50μL，200μL100μg/L内标标准溶液，涡旋混匀，于37℃±2℃下恒温水浴16h进行酶解；

待上述酶解液冷却至室温后，加入1粒陶瓷均质子和10mL5％(体积百分比)甲酸乙腈溶液，涡旋，离心，得第一上清液；

取上述第一上清液到EMR-Lipid分散固相萃取管(内含增强型脂质去除剂)中，涡旋，离心，得第二上清液；

取上述第二上清液到50mL离心管中，加入1粒陶瓷均质子和3mg无水硫酸镁，涡旋，离心，得第三上清液；

取上述第三上清液1mL，加入1mL水混合，过0.22μm有机滤膜，制得待测样液。

(2)采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪对上述待测样液进行36种兽药的检测：

所述超高效液相色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；

柱温：40℃；

流动相：A为0.1％(体积百分比)甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)，B为乙腈；

流速：0.400mL/min；

进样量：1μL；

洗脱方式：梯度洗脱；

其中，梯度洗脱程序为：按体积百分比，初始流动B为5％，保持1min；1.0～2.0min，B由5％升至20％；2.2～5.0min，B由20％升至30％；5.0～7.0min，B由30％升至95％，保持1min；8.0～8.1min，B由95％降至5％，保持到10min。

三重四极杆质谱条件：

质谱采用电喷雾离子源(ESI)；

正离子扫描方式；

动态多反应监测(MRM)模式；

气帘气压力：207kpa；

干燥气压力：379kpa；

喷针电压：5500V；

离子源温度：550℃；

碰撞气压力：62kpa；

其中，监测离子对、去簇电压和碰撞电压等参数见表1。

测定结果见图2，表明了采用本发明方法可对36种兽药残留的同时检出。

实施例2

本实施例所述禽畜肉样品为猪肉阳性样品，所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，具体包括如下步骤：

称取1.25g猪肉阳性样品粉末，加入3.75g超纯水搅拌15min混匀，得到肉糜状复原样品5.00g，加入0.2moL/L乙酸钠(pH5.2)溶液8.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液50μL，200μL 100μg/L内标标准溶液，涡旋混匀，于37℃±2℃下恒温水浴16h进行酶解；

待上述酶解液冷却至室温后，加入1粒陶瓷均质子和10mL5％甲酸乙腈溶液，快速振摇涡旋提取2min，4000rpm离心5min，得第一上清液；

取上述第一上清液到EMR-Lipid分散固相萃取管(内含增强型脂质去除剂)中，快速振摇涡旋2min，4000rpm离心5min，得第二上清液；

取上述第二上清液到50mL离心管中，加入1粒陶瓷均质子和3mg无水硫酸镁，涡旋，离心，得第三上清液；

取上述第三上清液1mL，加入1mL水混合，过0.22μm有机滤膜，制得待测样液。

(2)采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪对上述待测样液进行36种兽药残留的检测：

所述超高效液相色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；

柱温：40℃；

流动相：A为0.1％(体积百分比)甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)，B为乙腈；

流速：0.400mL/min；

进样量：1μL；

洗脱方式：梯度洗脱；

其中，梯度洗脱程序为：按体积百分比，初始流动B为5％，保持1min；1.0～2.0min,B由5％升至20％；2.2～5.0min，B由20％升至30％；5.0～7.0min，B由30％升至95％，保持1min；8.0～8.1min，B由95％降至5％，保持到10min。

三重四极杆质谱条件：

电喷雾离子源(ESI)；

正离子扫描方式；

动态多反应监测(DMRM)模式；

气帘气压力：207kpa；

干燥气压力：379kpa；

喷针电压：5500V；

离子源温度：550℃；

碰撞气压力：62kpa；

其中，监测离子对、去簇电压和碰撞电压等参数见表1。

测定结果见图3，表明了该猪肉阳性样品中含有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林，采用内标法定量，测得该猪肉阳性样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林含量分别为2.75、3.42、3.84和4.44μg/kg。

4、方法的验证：

4.1回收率

将36种兽药的100μg/L混合标准溶液加入到空白牛肉样品(即牛肉阴性样品)中，使得加标量分别为0.5、1、5μg/kg，按照本发明实施例1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法进行试验，每个加标浓度下进行6次平行测定，取平均值，根据加标量和测定结果计算牛肉样品中36种兽药的回收率，见表2，在3个加标浓度水平下，牛肉样品种36种兽药的回收率在67.4％-116％之间。

4.2精密度

准确称取三份5.0g添加有1.0μg/kg的羊肉肉糜状样品，分别标记为1、2、3，按照本发明实施例1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法进行试验，且每份进行平行测定，结果见表3，36种兽药在羊肉样品中的相对标准偏差(RSD)在1.22％-13.6％范围内。

表2：牛肉样品中36种兽药的回收率

表3：羊肉样品的测定值精密度

对比例1

本对比例的禽畜肉样品为实施例1中牛肉阴性样品添加36种兽药混合标准溶液所得加标量分别为0.5、1.0、5.0μg/kg的样品，采用与实施例1相同的测定流程，区别仅在于对样品前处理中取第三上清液进行氮吹至干，然后用1mL含0.1％甲酸水与乙腈(v:v＝5:95)混合溶液复溶，过膜，上机测定。

样品中36种兽药在三个加标浓度下，部分兽药的平均回收率与本发明测定所得平均回收率对比图见图4，采用上述样品前处理氮吹、复溶步骤容易导致部分兽药回收率偏低，测定误差较大。

对比例2

本对比例的禽畜肉样品为实施例1中牛肉阴性样品添加36种兽药混合标准溶液所得加标量分别为0.5、1.0、5.0μg/kg的样品，采用与实施例1相同的测定流程，区别仅在于样品前处理过程中不加入内标，36种兽药均采用基质加标外标法定量。

样品中36种兽药在三个加标浓度下，部分兽药的平均回收率与本发明测定所得平均回收率对比图见图5，部分兽药基质干扰较大，采用上述外标法定量容易导致其回收率偏低，测定误差较大。

本发明提供的技术方案可同时测定36种兽药残留量，也可以测定其中的几种，并且优化了样品前处理过程，减少氮吹、复溶等操作，节约时间并提高检测准确度，适用于禽畜肉中多组分兽药残留量的测定。与现有技术相比，在实施例2中猪肉阳性样品中除了现有技术测定的3种瘦肉精，还包括特布他林，相比现有技术，测定物质更多。并且，在对比例1中明确说明了按照现有技术进行处理时，有些兽药的回收率很低，满足不了准确定量要求。

很显然，上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案所做的举例，而并非对实施方式的限定。任何本领域技术人员，在上述说明的基础上还可以做出各种改动，因此本发明的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，用于测定以下36种兽药中的1种或多种在禽畜肉中的残留量：马布特罗、克伦潘罗、克伦丙罗、溴氯布特罗、溴布特罗、奥西那林、赛布特罗、异克舒令、克仑塞罗、妥布特罗、马喷特罗、非诺特罗、福莫特罗、拉贝特罗、异克伦潘罗、丙卡特罗、特布他林、塞曼特罗、氯丙那林、喷布特罗、齐帕特罗、班布特罗、利托君、苯乙醇胺A、赛庚啶、可乐定、巴氯芬、沙美特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、R-美托洛尔、多巴胺、甲氧酪胺、***和阿替洛尔，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品前处理：

取待测样品进行酶解，得酶解液；向所述酶解液中依次加入均质子和甲酸乙腈溶液，涡旋，离心，得第一上清液；

将所述第一上清液加入分散固相萃取管中，涡旋，离心，得第二上清液；

向第二上清液中依次加入均质子和无水硫酸盐，混匀，离心，得第三上清液；

将第三上清液与水混合，过滤，得待测样液；

(2)液相色谱-质谱测定：

将所述待测样液进行液相色谱-质谱分离测定；

(3)根据测定结果定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量。

2.根据权利要求1所述的禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，步骤(2)中的液相色谱条件如下：

a)色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×100mm，1.8μm)或者性能相当；

b)柱温：30～40℃；

c)流动相：A为含5mmol/L乙酸铵的体积百分比为0.1％的甲酸水，B为乙腈；

d)流速：0.3～0.4mL/min；

e)进样量：1～5μL；

f)洗脱方式：梯度洗脱；

步骤(2)中的质谱条件如下：

a)电喷雾离子源(ESI)；

b)正离子扫描方式；

c)动态多反应监测(DMRM)模式；

d)气帘气：172～207kPa；

e)干燥气：276～379kPa；

f)喷针电压：4500～5500V；

g)离子源温度：400～550℃；

h)碰撞气：41～62kPa。

3.根据权利要求1所述的禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述均质子为陶瓷均质子，其规格为适用于50mL萃取管，加入量为1～2粒；待测样品与所述甲酸乙腈溶液的比例为每5g待测样品对应体积百分比为5％的10ml甲酸乙腈溶液。

4.根据权利要求1或3所述的禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述甲酸乙腈溶液中甲酸与乙腈的体积比为1:99-5:95。

5.根据权利要求1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述分散固相萃取管中添加有增强型脂质去除剂。

6.根据权利要求1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述第三上清液与水混合体积比为1:1～1:2。

7.根据权利要求2所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：按体积百分比，初始流动B为5％，保持1min；1.0～2.0min，B由5％升至20％；2.2～5.0min，B由20％升至30％；5.0～7.0min，B由30％升至95％，保持1min；8.0～8.1min，B由95％降至5％，保持到10min。

8.根据权利要求1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量时，其中，马布特罗、溴氯布特罗、溴布特罗、西布特罗、克仑塞罗、妥布特罗、马喷特罗、非诺特罗、福莫特罗、丙卡特罗、特布他林、西马特罗、氯丙那林、班布特罗、利托君、可乐定、赛庚定、苯乙醇胺A、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、R-美托洛尔、多巴胺、***和阿替洛尔采用内标法定量。

9.根据权利要求1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，定量计算禽畜肉中36种兽药的残留量时，其中，克伦潘罗、克伦丙罗、奥西那林、异克舒令、拉贝特罗、异克伦潘罗、齐帕特罗、巴氯芬、沙美特罗、喷布特罗和甲氧酪胺采用基质加标曲线法定量。

10.根据权利要求1所述禽畜肉中36种兽药残留量的测定方法，其特征在于，所述禽畜肉为牛肉、羊肉、猪肉或鸡肉。

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