CN108445071B - 一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，包括以下步骤：(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段；(2)特征肽段纯度的测定；(3)糖化血红蛋白的酶解；(4)样品酶解液的毛细管电泳‑同位素稀释质谱分析；(5)酶解液中特异性肽段含量的计算；(6)糖化血红蛋白含量的计算。本方法能够有效的分离肽段、蛋白质等生物大分子，使得用于定量的特异性肽段不易受到干扰组分的影响，从而提高定量结果的准确度。而且毛细管电泳的进样量仅为几纳升，从而大大节约样品。
Description
技术领域
本发明涉及物质含量测定技术领域，特别是涉及一种糖化血红蛋白标准物质定值方法。
背景技术
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。含量(浓度)描述了单位质量或体积中被测对象的数量，是化学与生物计量中的基本量值，为了实现含量(浓度)的准确测定，化学与生物计量中广泛采用同位素稀释质谱的方法作为计量方法。同位素稀释质谱方法是一种特殊的内标法，它以被测对象的稳定同位素标记物作为内标添加到样品中，由于同位素内标与待测化合物的物理和化学性质接近，因此在充分混匀以后同位素内标可以实时校正整个分析过程中的***误差与随机误差，实现高准确度的测量。当添加同位素内标以后，由于同位素标记物与待测目标化合物理化性质接近，因此在前处理过程中两者的反应效率、损失率等都是一致的；在高效液相色谱分离过程中，同位素内标与待测目标化合物始终在一起，任意时刻施加到待测目标化合物上的扰动也同等程度的施加到同位素内标上，因此校正了分离过程中的随机误差与***误差；在离子化的过程中，待测目标化合物与同位素标记物具有相同的离子化效率，两者被同等效率的离子化并进入到质谱仪中进行检测，最后在质谱的不同质荷比通道被检测。最后根据待测目标化合物和同位素标记物的比例及称量的质量进行计算。由于添加同位素内标后整个分析过程中各种影响因素均无法改变两者的比例，因此可以消除掉整个分析过程中的***误差与随机误差，得到高准确度的定量结果。这使得同位素稀释质谱法也成为化学与生物计量中常用的计量基准方法之一。
对于生物样品的分析，通常采用高效液相色谱-同位素稀释质谱的方式进行样品中化学成分量的准确测定。高效液相色谱作为常用的分离手段，能够较好的用于有机分子、肽段、蛋白质、寡聚核酸、核酸等分子的分离。通过高效液相色谱-同位素稀释质谱联用的方式，已经成功解决了无机、有机小分子，以及核酸和蛋白质等生物大分子的准确定量，通过同位素内标的使用，克服了样品前处理、分离、离子化、质谱检测过程中的***误差，从而达到很高的测量准确度，成为化学和生物计量的基准方法之一。虽然高效液相色谱-同位素稀释质谱已经取得了很大的成功，但是受到高效液相色谱在核酸、蛋白等生物大分子分离效能中的限制，高效液相色谱-同位素稀释质谱在核酸、蛋白等生物大分子准确定量中的应用还十分有限。毛细管电泳技术是近几十年发展起来新型分离分析技术，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。毛细管电泳采用电渗流来驱动化合物的分离，克服了高效液相色谱中采用压力驱动导致的各层流速不均匀导致的峰展宽，从而达到极高的理论塔板数，展示出远远优于高效液相色谱的柱效与分离能力。分离能力的提高有助于干扰组分的去除，结合同位素稀释质谱卓越的***误差克服能力，使得毛细管电泳-同位素稀释质谱成为更为准确的定量方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于毛细管电泳-同位素稀释质谱的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法。
一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，包括以下步骤：
(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段；
(2)特征肽段纯度的测定；
(3)糖化血红蛋白的酶解；
(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；
(5)酶解液中特异性肽段含量的计算；
(6)糖化血红蛋白含量的计算。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(1)具体为，通过化学合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；通过化学合成的方式获得用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(2)具体为，将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以国家氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度；对于特异性肽段VHLTPE，用于定量的氨基酸为缬氨酸V、亮氨酸L和脯氨酸P；对于特异性肽段Glc-VHLTPE，用于定量的氨基酸为亮氨酸L和脯氨酸P。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(3)具体为，取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在60℃下孵育24小时进行酶切。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(4)具体为，在酶解后的酶解液中加入同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；
使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质；
压力进样，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(G-VHLTPE)，m/z＝864(D7-G-VHLTPE)，m/z＝623(VHLTPG)；同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(5)具体为，根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，
式中：c—为样品中VHLTPE(Glc-VHLTPE)的含量，mg/g；
ms——为样品溶液中VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量，mg；
Rs——为样品溶液中VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
I1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
I2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
R1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
R2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
M—为样品质量，g；
P—为VHLTPE(Glc-VHLTPE)的纯度。
本发明所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，所述步骤(6)具体为，根据下面的的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量；
式中，
mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；
MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；
mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；
MWVE6——VHLTPE的分子量。
同传统的高效液相色谱-同位素稀释质谱相比，本发明基于毛细管电泳-同位素稀释质谱的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法具有以下的优点：
(1)传统的高效液相色谱-同位素稀释质谱方法受到高效液相色谱分离效能的限制，对复杂组分的分离度不如毛细管电泳。因此本发明创建的毛细管电泳-同位素稀释质谱方法能够有效的分离肽段、蛋白质等生物大分子，使得用于定量的特异性肽段不易受到干扰组分的影响，从而提高定量结果的准确度。
(2)传统的高效液相色谱进样量为几微升，而毛细管电泳的进样量仅为几纳升，从而可以大大节约样品。
下面结合具体实施例对本发明的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
一种基于毛细管电泳-同位素稀释质谱的糖化血红蛋白标准物质定值方法，包括如下步骤：
(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段
通过化学合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；通过化学合成的方式获得用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。
(2)特征肽段纯度的准确测定
将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以国家氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度。对于特异性肽段VHLTPE，用于定量的氨基酸为缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和脯氨酸(P)；对于特异性肽段Glc-VHLTPE，用于定量的氨基酸为L和P。
(3)糖化血红蛋白的酶解
取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在60℃下孵育24小时进行酶切。
(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析
在酶解后的酶解液中加入同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析。使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质。压力进样，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(G-VHLTPE)，m/z＝864(D7-G-VHLTPE)，m/z＝623(VHLTPG)。同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定。
(5)酶解液中特异性肽段含量的计算
根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，
式中：c—为样品中VHLTPE(Glc-VHLTPE)的含量(mg/g)；
ms——为样品溶液中VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量(mg)；
Rs——为样品溶液中VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
I1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
I2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
R1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
R2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
M—为样品质量(g)；
P—为VHLTPE(Glc-VHLTPE)的纯度。
(6)糖化血红蛋白含量的计算
根据下面的的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量。
式中，
mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；
MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；
mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；
MWVE6——VHLTPE的分子量。
实施例2
一个基于毛细管电泳-同位素稀释质谱的糖化血红蛋白标准物质定值方法的具体实施例，包括如下步骤：
(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段
通过委托生物技术服务公司通过固相合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；同时合成用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。
(2)特征肽段纯度的准确测定
用作标准的特征肽纯度确定均采用两种技术手段：同位素稀释质谱法和质量平衡法。
同位素稀释质谱方法的测定过程如下：首先采用高效液相色谱对VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度进行分析，高效液相色谱纯度分析条件如下：
色谱柱：250mm×4.6mm,Kromasil-C18-5μm
流动相A：0.1％TFA-水
流动相B：0.1％TFA-乙腈
流速：1.0mL/min
检测波长：220nm
进样量：10μL
经高效液相分析，VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度分别为99.8％和99.5％。
接着，将VHLTPE和Glc-VHLTPE配制成浓度为0.1mg/g的储备溶液，分别取20μL该溶液加入不同的安瓶中，在VHLTPE的溶液中根据水解后氨基酸的理论浓度，加入等量的同位素标记缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)溶液，充分混匀后加入500μL 6mol/L盐酸溶液，充氮气2min后封口，放入110℃烘箱中进行水解48hr。水解后的溶液用氮气吹干，加入0.01mol/L的盐酸复溶，复溶后的样品用0.45μm过滤后上机测定。Glc-VHLTPE的处理方式与VHLTPE的处理方式类似，只是不加入Val的同位素标记物。采用国家氨基酸标准物质(Val、Leu和Pro)做标准，以对应的同位素标记氨基酸为内标，配制高标和低标溶液，采用括号法对水解液中的相应氨基酸浓度进行同位素稀释质谱测定，得到VHLTPE和Glc-VHLTPE的质量分数分别为0.890g/g和0.883g/g。
质平衡法的测定条件如下：
首先采用高效液相色谱法对VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度进行测定，方法同同位素稀释质谱法，5次重复分析的结果分别为99.8％和99.5％。接着，采用卡尔费休法对VHLTPE和Glc-VHLTPE中的水分进行测定，3次重复测定的结果分别为10.2％和11.3％；下来，采用灼烧残渣法对样品中的无机离子进行测定，结果分别为0.12％和0.13％；采用高效气相色谱顶空进样对肽段中的有机溶剂残留进行测定，在仪器检出限内，未检出甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等有机溶剂残留成分。根据下面的公式计算两种肽段标准质量平衡法的定值结果：
c＝P×(1-wwater-wresidue-wVOC)
其中：
c——两种肽段的质量分数，g/g；
P——高效液相色谱纯度，％；
wwater——水分含量，％；
wresidue——灼烧残渣含量，％；
wVOC——挥发性有机成分含量，％。
根据上式，两种肽段质量平衡法的检测结果分别为：0.895g/g和0.881g/g。取同位素稀释质谱方法和质量平衡方法的平均值作为两种肽段的纯度测定结果，分别为0.893g/g和0.882g/g。
(3)同位素标记肽段的表征
首先用高效液相色谱对合成的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE进行表征，高效液相色谱纯度分别为99.1％和99.0％，再使用液相色谱-质谱联用技术对VH*LTPE和Glc-VH*LTPE中含有的非标机肽段VHLTPE和Glc-VHLTPE进行测定。将VH*LTPE和Glc-VH*LTPE肽段用超纯水分别配制成100ng/g的溶液进行高效液相色谱-质谱联用分析，分析条件如下：
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 3.5μm，2.1×150mm
流动相：A：0.1％甲酸+水
B：0.1％甲酸+乙腈
进样量：20μL
流速：0.2mL/min
柱温：40℃
梯度：见下表1。
表1流动相梯度表
质谱测定在Agilent 6410完成，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子选择离子监测模式(SIM)；干燥器流速9L/min，毛细管温度为350℃；毛细管电压为4000V。选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(Glc-VHLTPE)，m/z＝864(Glc-VH*LTPE)。
经检测，目标肽段均在与其理论质荷比相符的通道出峰，在其余通道未检测到峰，说明作为同位素内标的肽段中不含有对应的非标记肽段。
(3)糖化血红蛋白的酶解
对纯化后的红细胞裂解物中的血红蛋白进行测定，浓度约为40g/L，取该溶液10μL，加入500μL超纯水进行稀释，充分混匀。取1mL稀释后的糖化血红蛋白溶液，向其中加入20μL 8mol/L的尿素，50mmol/L的Tris-HCl溶液，再加入15μL 45mmol/L二硫苏糖醇溶液，在60℃的水浴中加热40min。再加入15μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，暗处放置45min。取出后再加入45μL 45mmol/L二硫苏糖醇溶液。取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在37℃下孵育48小时进行酶切,24小时以后补充同等比例的酶量。
(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析
经过粗测后在酶解后的酶解液中加入与VHLTPE、Glc-VHLTPE浓度大致相同的同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析。使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，使用50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质，同时作为鞘液，鞘液流速0.2mL/min。采用压力进样，进样时间10s，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性离子检测方式检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(Glc-VHLTPE)，m/z＝864(Glc-VH*LTPE)。同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定。测定完成后，对括号法高低标及样品中标记与非标记肽段的峰面积进行积分。
(5)酶解液中特异性肽段含量的计算
根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，
式中：c—为样品中VHLTPE(Glc-VHLTPE)的含量(mg/g)；
Ms——为样品溶液中VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量(mg)；
Rs——为样品溶液中VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
I1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
I2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
R1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
R2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
M—为样品质量(g)；
P—为VHLTPE(Glc-VHLTPE)的纯度。
接着，根据下面的的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量。
式中，
mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；
MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；
mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；
MWVE6——VHLTPE的分子量。
经计算，样品中糖化血红蛋白的含量为5.1％，6次重复测定相对标准偏差为1.2％。
为突出本发明的有益效果，还进行了以下对比例实验。
对比例1
对比例采用经典的高效液相色谱-同位素稀释质谱对样品中的糖化血红蛋白含量进行测定。
(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段
通过委托生物技术服务公司通过固相合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；同时合成用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。
(2)特征肽段纯度的准确测定
用作标准的特征肽纯度确定均采用两种技术手段：同位素稀释质谱法和质量平衡法。
同位素稀释质谱方法的测定过程如下：首先采用高效液相色谱对VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度进行分析，高效液相色谱纯度分析条件如下：
色谱柱：250mm×4.6mm,Kromasil-C18-5μm
流动相A：0.1％TFA-水
流动相B：0.1％TFA-乙腈
流速：1.0mL/min
检测波长：220nm
进样量：10μL
经高效液相分析，VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度分别为99.8％和99.5％。
接着，将VHLTPE和Glc-VHLTPE配制成浓度为0.1mg/g的储备溶液，分别取20μL该溶液加入不同的安瓶中，在VHLTPE的溶液中根据水解后氨基酸的理论浓度，加入等量的同位素标记缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)溶液，充分混匀后加入500μL 6mol/L盐酸溶液，充氮气2min后封口，放入110℃烘箱中进行水解48hr。水解后的溶液用氮气吹干，加入0.01mol/L的盐酸复溶，复溶后的样品用0.45μm过滤后上机测定。Glc-VHLTPE的处理方式与VHLTPE的处理方式类似，只是不加入Val的同位素标记物。采用国家氨基酸标准物质(Val、Leu和Pro)做标准，以对应的同位素标记氨基酸为内标，配制高标和低标溶液，采用括号法对水解液中的相应氨基酸浓度进行同位素稀释质谱测定，得到VHLTPE和Glc-VHLTPE的质量分数分别为0.890g/g和0.883g/g。
质平衡法的测定条件如下：
首先采用高效液相色谱法对VHLTPE和Glc-VHLTPE的纯度进行测定，方法同同位素稀释质谱法，5次重复分析的结果分别为99.8％和99.5％。接着，采用卡尔费休法对VHLTPE和Glc-VHLTPE中的水分进行测定，3次重复测定的结果分别为10.2％和11.3％；下来，采用灼烧残渣法对样品中的无机离子进行测定，结果分别为0.12％和0.13％；采用高效气相色谱顶空进样对肽段中的有机溶剂残留进行测定，在仪器检出限内，未检出甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等有机溶剂残留成分。根据下面的公式计算两种肽段标准质量平衡法的定值结果：
c＝P×(1-wwater-wresidue-wVOC)
其中：
c——两种肽段的质量分数，g/g；
P——高效液相色谱纯度，％；
wwater——水分含量，％；
wresidue——灼烧残渣含量，％；
wVOC——挥发性有机成分含量，％。
根据上式，两种肽段质量平衡法的检测结果分别为：0.895g/g和0.881g/g。取同位素稀释质谱方法和质量平衡方法的平均值作为两种肽段的纯度测定结果，分别为0.893g/g和0.882g/g。
(4)同位素标记肽段的表征
首先用高效液相色谱对合成的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE进行表征，高效液相色谱纯度分别为99.1％和99.0％，再使用液相色谱-质谱联用技术对VH*LTPE和Glc-VH*LTPE中含有的非标机肽段VHLTPE和Glc-VHLTPE进行测定。将VH*LTPE和Glc-VH*LTPE肽段用超纯水分别配制成100ng/g的溶液进行高效液相色谱-质谱联用分析，分析条件如下：
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 3.5μm，2.1×150mm
流动相：A：0.1％甲酸+水
B：0.1％甲酸+乙腈
进样量：20μL
流速：0.2mL/min
柱温：40℃
梯度：见下表2。
表2流动相梯度表
质谱测定在Agilent 6410完成，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子选择离子监测模式(SIM)；干燥器流速9L/min，毛细管温度为350℃；毛细管电压为4000V。选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(Glc-VHLTPE)，m/z＝864(Glc-VH*LTPE)。
经检测，目标肽段均在与其理论质荷比相符的通道出峰，在其余通道未检测到峰，说明作为同位素内标的肽段中不含有对应的非标记肽段。
(5)糖化血红蛋白的酶解
对纯化后的红细胞裂解物中的血红蛋白进行测定，浓度约为40g/L，取该溶液10μL，加入500μL超纯水进行稀释，充分混匀。取1mL稀释后的糖化血红蛋白溶液，向其中加入20μL 8mol/L的尿素，50mmol/L的Tris-HCl溶液，再加入15μL 45mmol/L二硫苏糖醇溶液，在60℃的水浴中加热40min。再加入15μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，暗处放置45min。取出后再加入45μL 45mmol/L二硫苏糖醇溶液。取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在37℃下孵育48小时进行酶切,24小时以后补充同等比例的酶量。
(6)样品酶解液的高效液相色谱-同位素稀释质谱分析
经过粗测后在酶解后的酶解液中加入与VHLTPE、Glc-VHLTPE浓度大致相同的同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行高效液相色谱-同位素稀释质谱分析。测定时的色谱条件与质谱条件均与(4)中的条件相同：
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq 3.5μm，2.1×150mm
流动相：A：0.1％甲酸+水
B：0.1％甲酸+乙腈
进样量：20μL
流速：0.2mL/min
柱温：40℃
梯度：见下表3。
表3流动相梯度表
质谱测定在Agilent 6410完成，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子选择离子监测模式(SIM)；干燥器流速9L/min，毛细管温度为350℃；毛细管电压为4000V。选择性检测以下离子峰：m/z＝695(VHLTPE)，m/z＝702(D7-VHL*TPE)，m/z＝857(Glc-VHLTPE)，m/z＝864(Glc-VH*LTPE)。
测定完成后，对括号法高低标及样品中标记与非标记肽段的峰面积进行积分。
(7)酶解液中特异性肽段含量的计算
根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，
式中：c—为样品中VHLTPE(Glc-VHLTPE)的含量(mg/g)；
Ms——为样品溶液中VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量(mg)；
Rs——为样品溶液中VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
I1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
I2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的质量比；
R1——为高标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
R2——为低标溶液VHLTPE(Glc-VHLTPE)与VH*LTPE(Glc-VH*LTPE)的峰面积比；
M—为样品质量(g)；
P—为VHLTPE(Glc-VHLTPE)的纯度。
接着，根据下面的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量。
式中，
mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；
MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；
mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；
MWVE6——VHLTPE的分子量。
经计算，样品中糖化血红蛋白的含量为5.1％，6次重复测定相对标准偏差为1.1％。
比较毛细管电泳-同位素稀释质谱得到的结果与高效液相色谱-同位素稀释质谱得到的结果，两者对同一样品测定结果的均值相同，精密度接近，但是高效液相色谱分析需要20μL的进样量，而毛细管电泳分析仅需数十纳升的进样量，大大节约了样品，同时保持了方法的准确度与精密度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段；
(2)特征肽段纯度的测定；
(3)糖化血红蛋白的酶解；
(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析：在酶解后的酶解液中加入同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；
使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质；同时作为鞘液，鞘液流速0.2mL/min；
压力进样，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性检测以下离子峰：m/z＝695，VHLTPE；m/z＝702，D7-VHL*TPE；m/z＝857，G-VHLTPE；m/z＝864，D7-G-VHLTPE；同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定；测定完成后，对括号法高低标及样品中标记与非标记肽段的峰面积进行积分；
(5)酶解液中特异性肽段含量的计算：根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，
式中：c—为样品中VHLTPE或Glc-VHLTPE的含量，mg/g；
ms——为样品溶液中VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量，mg；
Rs——为样品溶液中VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；
I1——为高标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量比；
I2——为低标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量比；
R1——为高标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；
R2——为低标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；
M—为样品质量，g；
P—为VHLTPE或Glc-VHLTPE的纯度；
(6)糖化血红蛋白含量的计算：根据下面的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量，
式中，
mGlc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；
MWGlc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；
mVE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；
MWVE6——VHLTPE的分子量。
2.根据权利要求1所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，通过化学合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；通过化学合成的方式获得用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。
3.根据权利要求2所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以国家氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度；对于特异性肽段VHLTPE，用于定量的氨基酸为缬氨酸V、亮氨酸L和脯氨酸P；对于特异性肽段Glc-VHLTPE，用于定量的氨基酸为亮氨酸L和脯氨酸P。
4.根据权利要求3所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在60℃下孵育24小时进行酶切。
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