CN112301067B - 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 - Google Patents
一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112301067B CN112301067B CN202011233844.2A CN202011233844A CN112301067B CN 112301067 B CN112301067 B CN 112301067B CN 202011233844 A CN202011233844 A CN 202011233844A CN 112301067 B CN112301067 B CN 112301067B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aldolase
- ala
- amino
- hydroxypropionic acid
- separation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种制备2‑氨基‑3‑取代苯基‑3‑羟基丙酸的绿色环保工艺,以固定化醛缩酶为生物催化剂,取代苯甲醛、甘氨酸为底物,二价金属离子为酶促剂,水为溶剂,PH6~9,温度35~65℃,搅拌速度50~200rpm,进行酶催化。采用含有特定络合树脂的分离床对过量原料和产物进行分离,并完全去除反应中的二价金属离子酶促剂,甘氨酸溶液可以进行回收套用,2‑氨基‑3‑取代苯基‑3‑羟基丙酸进行后续浓缩析晶干燥得到产品,浓缩得到的水也可以进行回收套用。本发明通过醛缩酶的生物酶催化技术,固定化醛缩酶,特定络合树脂的分离床以及它们之间的有效组合,形成了一套溶剂物料自我循环,无三废排放的绿色环保生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及化合物制备技术领域,具体涉及一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺。
背景技术
2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸是一种重要的药物中间体和化工中间体,特别是2-氨基-3-(4-甲砜基苯基)-3-羟基丙酸和2-氨基-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸,广泛用于人类抗生素,家禽家畜类抗生素制备等,其代表药物如氯霉素,甲砜霉素,氟苯尼考等等。
2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的合成目前主流是化学合成法。化学合成法虽然操作简单,但是反应过程中用到了大量的水,重金属和剧毒的硫化氢,并且生产过程中的能耗高,所需场地多,不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和,用水量少,没有重金属污染,不使用剧毒化学品,低能耗,单位面积产量高等诸多优点。目前2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的工业生物合成方法没有报道,本发明采用生物酶催化技术结合分离固定床,设计出一种绿色环保,高效节能的新工艺,填补了本类产品的工业生物合成空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺,以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案:
一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺,包括如下步骤:
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上,得到固定化醛缩酶;其中,醛缩酶为基因改造醛缩酶,利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变,其中91位由组氨酸变更为丙氨酸,178位由丙氨酸变更为酪氨酸;新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO:1所示,工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO:2所示;
(2)、甘氨酸溶于水中,再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂,调节PH后加入步骤(1)制备的固定化醛缩酶,之后在一定温度条件下,以一定搅拌速度搅拌一定时间,得到反应混合液;其中,以水为溶剂,二价金属离子为酶促剂,固定化醛缩酶为催化剂,取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应,合成路线如下:
(3)、将步骤(2)得到的反应混合液过滤,分离出的固定化醛缩酶,用水清洗至流出液无浑浊,洗涤后的固定化醛缩酶套用到下一次,洗涤后的水过滤后反复套用于洗涤固定化醛缩酶;分离出的液体进行离心、过滤处理,得到液体和含湿固体;
(4)、步骤(3)离心、过滤处理得到的含湿固体即未反应完的原料取代苯甲醛,可以作为原料再投料;步骤(3)离心、过滤处理得到的液体使用离子交换进行分离处理,分离床填充络合树脂,将液体全部打入分离床,然后开始打入水,以一定流速进行过柱分离,分离结束后停止进水,得到甘氨酸溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液;二价金属离子酶促剂被分离床的络合树脂吸附除去;
(5)、将步骤(4)得到的2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液真空浓缩,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤,浓缩液降温析晶并真空干燥,得到固体产品2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸,将步骤(4)得到的甘氨酸溶液真空浓缩到合适浓度当作原料使用,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤。
进一步地,步骤(1)磷酸缓冲液浓度为0.1M~1M,PH为7~8,配制成含醛缩酶10mg~300mg/L的酶溶液。
进一步地,步骤(1)大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110,醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g~5000U/g。
进一步地,步骤(1)固定化温度为4~10℃,固定化时间为12~24h。
进一步地,步骤(2)取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1:1~5,溶剂质量是取代苯甲醛质量的10~30倍,固定化醛缩酶体积为溶剂体积的1.25%~2.5%。
进一步地,步骤(2)二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐,添加比例为取代苯甲醛的0.01mol%~2mol%。
进一步地,步骤(2)中PH为6~9,温度为35~65℃,搅拌速度为50~200rpm,搅拌时间为0.2~2h。
进一步地,步骤(4)络合树脂包括HZ930、XAX7、ZGC107MB。
进一步地,步骤(4)络合树脂和反应混合液的体积比为1:1~1.5,络合树脂和水的体积比为1:2~4,分离流速为每小时2~10个柱体积,出水的分流:从开始到第一个柱体积的流出液体为甘氨酸溶液,从第二个柱体积到结束为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液。
进一步地,步骤(5)于-5~10℃析晶,50~80℃真空浓缩。
本发明的有益效果:
本发明一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺,所述工艺中以固定化醛缩酶作为生物催化剂,固定化醛缩酶由基因改造醛缩酶于磷酸缓冲液中固定在特定的大孔吸附树脂上得到,基因改造醛缩酶是利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变,其中91位由组氨酸变更为丙氨酸,178位由丙氨酸变更为酪氨酸;新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO:1所示,工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO:2所示。基因改造醛缩酶固定在特定的大孔吸附树脂上,易于和反应体系分离并且多次循环使用。以取代苯甲醛、甘氨酸作为原料底物,二价金属离子作为酶促剂,以水为溶剂,控制PH在6~9,温度在35~65℃,搅拌速度在50~200rpm的条件下进行酶催化,获得较高转化率的2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸。采用含有特定络合树脂的分离床对过量原料和产物进行分离,并完全去除反应中的二价金属离子酶促剂,甘氨酸溶液可以进行回收套用,2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸进行后续浓缩析晶干燥得到产品,浓缩得到的水也可以进行回收套用。本发明通过醛缩酶的生物酶催化技术,固定化醛缩酶,特定络合树脂的分离床以及它们之间的有效组合,形成了一套溶剂物料自我循环,无三废排放的绿色环保生产工艺。
本发明采用了生物酶催化的绿色工艺来合成2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸,避免了传统化学工艺所使用的有毒化学品和溶剂,达到了零排放的环保指标,并且单位面积场地的生产效率较传统化学合成工艺提高30倍以上,降低了生产成本和生产时间;本工艺遵循溶剂、酶催化树脂、原料回收再循环利用的原则,将物料的利用率最大化,减少废料的同时降低了成本,是新一代的绿色环保工艺。
附图说明
图1是2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸溶液HPLC图(2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸出峰时间是2.689min,对甲砜基苯甲醛的出峰时间是8.606min,峰面积比例是96%:4%)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明,但并不用来限定本发明的实施范围。
一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺,包括如下步骤:
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上,得到固定化醛缩酶;其中,醛缩酶为基因改造醛缩酶,利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变,其中91位由组氨酸变更为丙氨酸,178位由丙氨酸变更为酪氨酸;新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO:1所示(MTQTAPRYDFASDNVAGAMPEVMEALIAANAGTASGYGTDHVSRAAADRIRAALDADAQVRFTASGTAANAFALTLLAQPHEAVLAHEHAHICTYTTGAPGFFGQGVGLIGLPGASGKMELAALEAALAQPDVSYRQPAAALSLTTATEYGTVYSEDHLRALIAPVKAKGYGVHLDGARLANAVAGGFDLKSIAKMGVDILVMGGTKAGSTPTEAVVFLNPDHAKRLDARLKHAGQLISKGRFLAAPWLGLLGENGQTAPWAARAAHANAMAQKLAALMPVPIKHPVEANGIFVEMDELALERLRGEGWFVYRFLDGTVRFMCSWATTPEMVEDLGAALKRVA),工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO:2所示(MTQTAPRYDFASDNVAGAMPEVMEALIAANAGTASGYGTDHVSRAAADRIRAALDADAQVRFTASGTAANAFALTLLAQPHEAVLAHEHAAICTYTTGAPGFFGQGVGLIGLPGASGKMELAALEAALAQPDVSYRQPAAALSLTTATEYGTVYSEDHLRALIAPVKAKGYGVHLDGYRLANAVAGGFDLKSIAKMGVDILVMGGTKAGSTPTEAVVFLNPDHAKRLDARLKHAGQLISKGRFLAAPWLGLLGENGQTAPWAARAAHANAMAQKLAALMPVPIKHPVEANGIFVEMDELALERLRGEGWFVYRFLDGTVRFMCSWATTPEMVEDLGAALKRVA);磷酸缓冲液浓度为0.1M~1M,PH为7~8,配制成含醛缩酶10mg~300mg/L的酶溶液;大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110,醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g~5000U/g;固定化温度为4~10℃,固定化时间为12~24h;
(2)、甘氨酸溶于水中,再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂,调节PH后加入步骤(1)制备的固定化醛缩酶,之后在一定温度条件下,以一定搅拌速度搅拌一定时间,得到反应混合液;其中,取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1:1~5,溶剂质量是取代苯甲醛质量的10~30倍,固定化醛缩酶体积为溶剂体积的1.25%~2.5%;二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐,添加比例为取代苯甲醛的0.01mol%~2mol%;PH为6~9,温度为35~65℃,搅拌速度为50~200rpm,搅拌时间为0.2~2h;以水为溶剂,二价金属离子为酶促剂,固定化醛缩酶为催化剂,取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应,合成路线如下:
(3)、将步骤(2)得到的反应混合液过滤,分离出的固定化醛缩酶,用水清洗至流出液无浑浊,洗涤后的固定化醛缩酶套用到下一次,洗涤后的水过滤后反复套用于洗涤固定化醛缩酶;分离出的液体进行离心、过滤处理,得到液体和含湿固体;
(4)、步骤(3)离心、过滤处理得到的含湿固体即未反应完的原料取代苯甲醛,可以作为原料再投料;步骤(3)离心、过滤处理得到的液体使用离子交换进行分离处理,分离床填充络合树脂,将液体全部打入分离床,然后开始打入水,以一定流速进行过柱分离,分离结束后停止进水,得到甘氨酸溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液;二价金属离子酶促剂被分离床的络合树脂吸附除去;其中,络合树脂包括HZ930、XAX7、ZGC107MB,络合树脂和反应混合液的体积比为1:1~1.5,络合树脂和水的体积比为1:2~4,分离流速为每小时2~10个柱体积,出水的分流:从开始到第一个柱体积的流出液体为甘氨酸溶液,从第二个柱体积到结束为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液;
(5)、将步骤(4)得到的2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液真空浓缩,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤,浓缩液降温析晶并真空干燥,得到固体产品2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸,其中,于-5~10℃析晶,50~80℃真空浓缩;将步骤(4)得到的甘氨酸溶液真空浓缩到合适浓度当作原料使用,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤。
以下实施例涉及的醛缩酶为基因改造醛缩酶,利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变,其中91位由组氨酸变更为丙氨酸,178位由丙氨酸变更为酪氨酸;新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO:1所示,工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO:2所示。
实施例1
1、向1500L含醛缩酶的酶溶液(磷酸缓冲液浓度为0.5M,PH为7.2,酶含量为38mg/L,比酶活14000U/mg)中加入300L活化的大孔吸附树脂D301(树脂密度约为0.7g/ml),在5~10℃条件下搅拌13h,然后将大孔吸附树脂过滤并用500L纯化水洗涤,得到固定化醛缩酶树脂。过滤后得到的磷酸缓冲液作为酶溶液的溶剂反复套用来做固定化,洗涤后的纯化水过滤后反复套用于洗涤大孔吸附树脂。
2、将150kg甘氨酸溶解到3800kg纯水中,温度升至40±1℃(预升温,节约生产时间),完全溶解后再添加222kg对甲砜基苯甲醛,78g ZnCl2,搅拌均匀,PH调节至7.5±0.2,然后加入70L步骤1制备的固定化醛缩酶树脂,全部加入后在40℃以搅拌速度100rpm左右搅拌1h,反应生成2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸。
3、将步骤2得到的反应混合液过滤,分离出的固定化醛缩酶,用纯水清洗至流出液无浑浊,洗涤后的固定化醛缩酶套用到下一次,洗涤后的纯水过滤后反复套用于洗涤固定化醛缩酶;分离出的液体进行离心、过滤处理,得到约4000L的液体和约50kg的含湿固体(约30%湿度)。
4、步骤3离心、过滤处理得到的含湿固体即未反应完的原料对甲砜基苯甲醛,可以作为原料再投料;将步骤3离心、过滤处理得到的液体使用离子交换进行分离处理,使用的络合树脂为ZGC107MB,具体处理步骤如下:将约4000L液体全部打入分离床(分离床高径比10:1,容量4000L,填充ZGC107MB树脂)中,然后开始打入纯水(总计约8000L),以每小时3个柱(络合树脂)体积的流速进行过柱分离,出水的分流:从开始到第一个柱体积的流出液体为甘氨酸溶液,从第二个柱体积到结束为2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸溶液,2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸溶液HPLC图如图1所示。二价金属离子酶促剂被分离床的络合树脂吸附除去。
5、将步骤4得到的2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸溶液在80℃真空浓缩至质量浓度20%,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤4分离步骤,浓缩液降温到5℃析晶并于80℃真空干燥,得到186kg固体产品2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸,析晶收率约71%,HPLC纯度96%;将步骤4得到的甘氨酸溶液80℃真空浓缩到合适浓度转存到另外桶内储存,当作原料使用,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤4分离步骤。
实施例2
1、向1500L含醛缩酶的酶溶液(磷酸缓冲液浓度为0.5M,PH为7.2,酶含量为38mg/L,比酶活14000U/mg)中加入300L活化的大孔吸附树脂D301(树脂密度约为0.7g/ml),在5~10℃条件下搅拌13h,然后将大孔吸附树脂过滤并用500L纯化水洗涤,得到固定化醛缩酶树脂。过滤后得到的磷酸缓冲液作为酶溶液的溶剂反复套用来做固定化,洗涤后的纯化水过滤后反复套用于洗涤大孔吸附树脂。
2、将280kg甘氨酸溶解到3800kg纯水中,温度升至40±1℃(预升温,节约生产时间),完全溶解后再添加170kg对氯苯甲醛,78g ZnCl2,搅拌均匀,PH调节至7.5±0.2,然后加入70L步骤1制备的固定化醛缩酶树脂,全部加入后在40℃以搅拌速度100rpm左右搅拌1h,反应生成2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸。
3、将步骤2得到的反应混合液过滤,分离出的固定化醛缩酶,用纯水清洗至流出液无浑浊,洗涤后的固定化醛缩酶套用到下一次,洗涤后的纯水过滤后反复套用于洗涤固定化醛缩酶;分离出的液体进行离心、过滤处理,得到约4000L的液体和约49kg的含湿固体(约30%湿度)。
4、步骤3离心、过滤处理得到的含湿固体即未反应完的原料对氯苯甲醛,可以作为原料再投料;将步骤3离心、过滤处理得到的液体使用离子交换进行分离处理,使用的络合树脂为ZGC107MB,具体处理步骤如下:将约4000L液体全部打入分离床(分离床高径比10:1,容量4000L,填充ZGC107MB树脂)中,然后开始打入纯水(总计约8000L),以每小时2个柱(络合树脂)体积的流速进行过柱分离,出水的分流:从开始到第一个柱体积的流出液体为甘氨酸溶液,从第二个柱体积到结束为2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸溶液。二价金属离子酶促剂被分离床的络合树脂吸附除去。
5、将步骤4得到2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸溶液在80℃真空浓缩至质量浓度20%,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤4分离步骤,浓缩液降温到5℃析晶并于80℃真空干燥,得到150kg固体产品2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸,析晶收率约72%,HPLC纯度97%;将步骤4得到的甘氨酸溶液80℃真空浓缩到合适浓度转存到另外桶内储存,当作原料使用,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤4分离步骤。
序列表
<110> 杭州勇诚睿生物科技有限公司
<120> 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 343
<212> PRT
<213> 新月柄杆菌醛缩酶(野生菌序列)
<400> 1
Met Thr Gln Thr Ala Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Asp Asn Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Met Pro Glu Val Met Glu Ala Leu Ile Ala Ala Asn Ala Gly
20 25 30
Thr Ala Ser Gly Tyr Gly Thr Asp His Val Ser Arg Ala Ala Ala Asp
35 40 45
Arg Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Asp Ala Gln Val Arg Phe Thr Ala
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ala Asn Ala Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Gln Pro
65 70 75 80
His Glu Ala Val Leu Ala His Glu His Ala His Ile Cys Thr Tyr Thr
85 90 95
Thr Gly Ala Pro Gly Phe Phe Gly Gln Gly Val Gly Leu Ile Gly Leu
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Gly Lys Met Glu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Gln Pro Asp Val Ser Tyr Arg Gln Pro Ala Ala Ala Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Thr Glu Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Glu Asp His Leu Arg
145 150 155 160
Ala Leu Ile Ala Pro Val Lys Ala Lys Gly Tyr Gly Val His Leu Asp
165 170 175
Gly Ala Arg Leu Ala Asn Ala Val Ala Gly Gly Phe Asp Leu Lys Ser
180 185 190
Ile Ala Lys Met Gly Val Asp Ile Leu Val Met Gly Gly Thr Lys Ala
195 200 205
Gly Ser Thr Pro Thr Glu Ala Val Val Phe Leu Asn Pro Asp His Ala
210 215 220
Lys Arg Leu Asp Ala Arg Leu Lys His Ala Gly Gln Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Gly Arg Phe Leu Ala Ala Pro Trp Leu Gly Leu Leu Gly Glu Asn Gly
245 250 255
Gln Thr Ala Pro Trp Ala Ala Arg Ala Ala His Ala Asn Ala Met Ala
260 265 270
Gln Lys Leu Ala Ala Leu Met Pro Val Pro Ile Lys His Pro Val Glu
275 280 285
Ala Asn Gly Ile Phe Val Glu Met Asp Glu Leu Ala Leu Glu Arg Leu
290 295 300
Arg Gly Glu Gly Trp Phe Val Tyr Arg Phe Leu Asp Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Phe Met Cys Ser Trp Ala Thr Thr Pro Glu Met Val Glu Asp Leu Gly
325 330 335
Ala Ala Leu Lys Arg Val Ala
340
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> 工程酶Cc-H91A178(人工序列)
<400> 2
Met Thr Gln Thr Ala Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Asp Asn Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Met Pro Glu Val Met Glu Ala Leu Ile Ala Ala Asn Ala Gly
20 25 30
Thr Ala Ser Gly Tyr Gly Thr Asp His Val Ser Arg Ala Ala Ala Asp
35 40 45
Arg Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Asp Ala Gln Val Arg Phe Thr Ala
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ala Asn Ala Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Gln Pro
65 70 75 80
His Glu Ala Val Leu Ala His Glu His Ala Ala Ile Cys Thr Tyr Thr
85 90 95
Thr Gly Ala Pro Gly Phe Phe Gly Gln Gly Val Gly Leu Ile Gly Leu
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Gly Lys Met Glu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Gln Pro Asp Val Ser Tyr Arg Gln Pro Ala Ala Ala Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Thr Glu Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Glu Asp His Leu Arg
145 150 155 160
Ala Leu Ile Ala Pro Val Lys Ala Lys Gly Tyr Gly Val His Leu Asp
165 170 175
Gly Tyr Arg Leu Ala Asn Ala Val Ala Gly Gly Phe Asp Leu Lys Ser
180 185 190
Ile Ala Lys Met Gly Val Asp Ile Leu Val Met Gly Gly Thr Lys Ala
195 200 205
Gly Ser Thr Pro Thr Glu Ala Val Val Phe Leu Asn Pro Asp His Ala
210 215 220
Lys Arg Leu Asp Ala Arg Leu Lys His Ala Gly Gln Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Gly Arg Phe Leu Ala Ala Pro Trp Leu Gly Leu Leu Gly Glu Asn Gly
245 250 255
Gln Thr Ala Pro Trp Ala Ala Arg Ala Ala His Ala Asn Ala Met Ala
260 265 270
Gln Lys Leu Ala Ala Leu Met Pro Val Pro Ile Lys His Pro Val Glu
275 280 285
Ala Asn Gly Ile Phe Val Glu Met Asp Glu Leu Ala Leu Glu Arg Leu
290 295 300
Arg Gly Glu Gly Trp Phe Val Tyr Arg Phe Leu Asp Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Phe Met Cys Ser Trp Ala Thr Thr Pro Glu Met Val Glu Asp Leu Gly
325 330 335
Ala Ala Leu Lys Arg Val Ala
340
Claims (1)
1.一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺,其特征在于,包括如下步骤:
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上,得到固定化醛缩酶;其中,醛缩酶为基因改造醛缩酶,利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变,其中91位由组氨酸变更为丙氨酸,178位由丙氨酸变更为酪氨酸;新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQID NO:1所示,工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO:2所示;其中,磷酸缓冲液浓度为0.1M~1M,PH为7~8,配制成含醛缩酶10mg~300mg/L的酶溶液;大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110,醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g~5000U/g;固定化温度为4~10℃,固定化时间为12~24h;
(2)、甘氨酸溶于水中,再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂,调节PH后加入步骤(1)制备的固定化醛缩酶,之后在一定温度条件下,以一定搅拌速度搅拌一定时间,得到反应混合液;其中,以水为溶剂,二价金属离子为酶促剂,固定化醛缩酶为催化剂,取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应,合成路线如下:
R=H,Cl,Br,F,NO2,MeSO2,OH
;其中,取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1:1~5,溶剂质量是取代苯甲醛质量的10~30倍,固定化醛缩酶体积为溶剂体积的1.25%~2.5%;二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐,添加比例为取代苯甲醛的0.01mol%~2mol%;PH为6~9,温度为35~65℃,搅拌速度为50~200rpm,搅拌时间为0.2~2h;
(3)、将步骤(2)得到的反应混合液过滤,分离出的固定化醛缩酶,用水清洗至流出液无浑浊,洗涤后的固定化醛缩酶套用到下一次,洗涤后的水过滤后反复套用于洗涤固定化醛缩酶;分离出的液体进行离心、过滤处理,得到液体和含湿固体;
(4)、步骤(3)离心、过滤处理得到的含湿固体即未反应完的原料取代苯甲醛,可以作为原料再投料;步骤(3)离心、过滤处理得到的液体使用离子交换进行分离处理,分离床填充络合树脂,将液体全部打入分离床,然后开始打入水,以一定流速进行过柱分离,分离结束后停止进水,得到甘氨酸溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液;二价金属离子酶促剂被分离床的络合树脂吸附除去;其中,络合树脂包括HZ930、XAX7、ZGC107MB;络合树脂和反应混合液的体积比为1:1~1.5,络合树脂和水的体积比为1:2~4,分离流速为每小时2~10个柱体积,出水的分流:从开始到第一个柱体积的流出液体为甘氨酸溶液,从第二个柱体积到结束为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液;
(5)、将步骤(4)得到的2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸溶液真空浓缩,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤,浓缩液降温析晶并真空干燥,得到固体产品2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸,将步骤(4)得到的甘氨酸溶液真空浓缩到合适浓度当作原料使用,浓缩出来的纯水进行循环套用到步骤(4)分离步骤;其中,于-5~10℃析晶,50~80℃真空浓缩。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011233844.2A CN112301067B (zh) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011233844.2A CN112301067B (zh) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112301067A CN112301067A (zh) | 2021-02-02 |
CN112301067B true CN112301067B (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=74326628
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011233844.2A Active CN112301067B (zh) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112301067B (zh) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8546118B2 (en) * | 2006-03-07 | 2013-10-01 | Verenium Corporation | Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
JP7402157B2 (ja) * | 2017-05-27 | 2023-12-20 | エンズィマスター(ニンボー)バイオ-エンジニアリング カンパニー リミテッド | 操作されたポリペプチドおよびβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸合成におけるそれらの用途 |
CN107893065A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-04-10 | 宁夏乙征生物工程有限公司 | 一种固定化酶的制备方法 |
CN109402098B (zh) * | 2018-11-06 | 2021-09-17 | 王喆明 | 苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用 |
-
2020
- 2020-11-06 CN CN202011233844.2A patent/CN112301067B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112301067A (zh) | 2021-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109134594B (zh) | 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 | |
CA2747823C (en) | Improved method for the production of glucose from lignocellulosic feedstocks | |
EP1737550B1 (en) | Recovery of inorganic salt during processing of lignocellulosic feedstocks | |
US8247200B2 (en) | Method of obtaining inorganic salt and acetate salt from cellulosic biomass | |
US8003352B2 (en) | Method of obtaining a product sugar stream from cellulosic biomass | |
EP0832276B1 (en) | Method of strong acid hydrolysis | |
CN108690854B (zh) | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 | |
CN104774881B (zh) | 一种生物催化生产L-α-氨基丁酸的方法 | |
US5270189A (en) | Biparticle fluidized bed reactor | |
CN100339351C (zh) | 一种从有机酸发酵液和相应有机酸产品母液中分离残糖以提纯有机酸的方法 | |
Zhao et al. | Efficient production of diltiazem chiral intermediate using immobilized lipase from Serratia marcescens | |
CN109897874A (zh) | 一种制备手性异喹啉羧酸的方法 | |
CN112301067B (zh) | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的绿色环保工艺 | |
Kaufman et al. | Use of a biparticle fluidized-bed bioreactor for the continuous and simultaneous fermentation and purification of lactic acid | |
CN110129307B (zh) | 固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用 | |
CN101851646A (zh) | 一种固定化酶法生产l-鸟氨酸盐酸盐的方法 | |
CN114606221B (zh) | 固定化酶、其制备方法及应用 | |
CN112280773B (zh) | 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺 | |
CN113355371A (zh) | 一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法 | |
CN117778371B (zh) | 苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用 | |
CN108946752A (zh) | 一种高效回收利用乳果糖制备体系中的催化剂的方法 | |
CN104313071A (zh) | 高纯L-α-氨基酸的生物合成方法 | |
CN115286678B (zh) | 一种生物转化牛磺熊去氧胆酸的纯化方法 | |
CN113881730B (zh) | L-半乳糖的合成方法 | |
CA2576317A1 (en) | Method of obtaining inorganic salt and acetate salt from cellulosic biomass |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 311201 21st floor, building 2, Zicheng International Innovation Center, 39 Jincheng Road, Chengxiang street, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant after: Hangzhou Rushi Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 311201 21st floor, building 2, Zicheng International Innovation Center, 39 Jincheng Road, Chengxiang street, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant before: Hangzhou yongchengrui Biotechnology Co.,Ltd. |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |