CN112301049B - 高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法 - Google Patents

高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及代谢工程领域，特别涉及高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。该重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。本发明利用了代谢工程和合成生物学手段对S.oneidensis MR‑1进行改造，从而高效的合成血红素。将这种方法应用于电活性细菌的工程化改造将有助于这类细菌在精细化学品生产中的应用。

Description

高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产 血红素的方法
技术领域
本发明涉及代谢工程领域，特别涉及高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。
背景技术
目前血红素的生产主要是利用有机萃取或酶促水解从生物样品(例如植物组织和动物血液)中分离游离血红素，不仅过程复杂、产量低、耗时而且会造成污染问题。代谢工程技术的发展为利用微生物细胞工程生产血红素提供了契机。
电活性细菌进化出了独特的胞外电子传递方式用以在厌氧环境中利用多种电子受体完成细胞呼吸代谢过程。该类微生物也因此在能量回收、化学品生产、环境修复等方面具有重要作用。迄今为止，人们从环境中分离出多种异化金属还原细菌，如Shewanellaspp.,Geobacter spp.,Pseudomonas spp.,Listeria spp.，并对其胞外电子传递通路进行了表征。作为一株模式异化金属还原细菌，Shewanella oneidensis MR-1受到人们的广泛关注。它利用一个复杂的胞外电子传递网络将胞内代谢产生的电子传递到胞外电子受体。具体步骤为：该菌首先将胞内L-乳酸氧化分解产生的电子汇聚到NADH池，随后电子通过醌池到达内膜和周质中的多种氧化还原终端酶或者外膜上的孔蛋白-细胞色素复合体(OmcA-MtrCAB)，并最终通过直接和间接的方式传递到胞外电子受体。电活性细菌独特的胞外电子传递特性为利用微生物电化学***(MES)电合成生产血红素提供了可能。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。本发明提供的高产血红素的质粒***和宿主体系，用于实现血红素的高效和放大生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高产血红素的重组质粒，所述重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。
作为优选，hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf的基因来源为E.coli MG1655。
作为优选，重组质粒的质粒载体为pBF-PTetO。
作为优选，质粒载体的序列如SEQ ID NO：1所示。
作为优选，重组质粒的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了该重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
以质粒载体为模板，扩增得到质粒骨架；
将基因hemA、hemL、hemB1、hemB2的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE1；
将基因hemC、hemD、hemE、hemN的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE2；
将基因hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE3；
将基因ccmF与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE4；
在得到质粒-HE1、质粒-HE2、质粒-HE3、质粒-HE4的基础上，将HE1、HE2、HE3、HE4DNA片段进行组装，得到重组质粒。
本发明还提供了一种高产血红素的基因工程菌株，该基因工程菌株包括上述重组质粒。
作为优选，基因工程菌株的宿主菌为S.oneidensis MR-1。
作为优选，基因工程菌株的启动子为四环素诱导型启动子***。
本发明还提供了该基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：利用宿主菌制备感受态细胞；将重组质粒与感受态细胞混合，电转，得到基因工程菌株。
本发明还提供了一种高产血红素的方法，包括如下步骤：
培养上述基因工程菌株，当菌液的OD600为0.15～0.25时加入诱导剂进行发酵培养，收集上清液。
本发明提供了高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。该重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。
本发明具有的技术效果为：
本发明利用了代谢工程和合成生物学手段对S.oneidensis MR-1进行改造，从而高效的合成血红素。将这种方法应用于电活性细菌的工程化改造将有助于这类细菌在精细化学品生产中的应用。
附图说明
图1为合成血红素的质粒平台pBF-PTetO图谱；
图2为工程菌生长状况和血红素产量的测定。
具体实施方式
本发明公开了高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了高产血红素的质粒***和宿主体系，用于实现血红素的高效和可放大生产。
本发明的一个实施例中通过将其血红素代谢途径中相关基因进行多拷贝增量表达，从而实现胞外血红素的高水平生产。本技术对希瓦氏菌内源的相关基因进行了重塑，包括hemA,hemL,hemB1,hemB2,hemC,hemD,hemE,hemN,hemG1,hemG2,hemG3,hemH1,hemH2,ccmf)，将这些基因模块化放置在四环素诱导型启动子***TetR-PTET控制之下。工程菌在Lysogeny broth(LB)培养基中30℃，200rpm震荡培养。在OD600约为0.2的时候加入20μg/L脱水四环素(Anhydrotetracycline)作为诱导剂，诱导血红素的合成。血红素合成基因序列从Pubmed(http://www.pubmed.com/)公共数据库中获取。
本发明提供的高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法中所用生物材料、试剂、仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、菌株、质粒及培养方法
本实施例中所有用到的菌株和质粒都列于表1中。其中，Escherichia coli NEB10β用作克隆菌株以及基因线路的表型验证。E.coli WM3604用于结合转移。所有的E.coli和S.oneidensis都培养在LB培养基中，大肠杆菌WM3604需要额外添加终浓度50μM的2 6-diaminopimelic acid(DAP)。E.coli和S.oneidensis分别在37℃和30℃条件下培养。2YT培养基的组成为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母粉(Yeast extract)5g/L，NaCl 10g/L。固体培养基中加入15g/L琼脂粉(Agar)。
以上菌株根据需要加入抗生素：氯霉素:30μg/mL(E.coli)，10μg/mL(S.oneidensis)；四环素:10μg/mL(E.coli)，5μg/mL(S.oneidensis)。脱水四环素作为诱导剂，按照文中所标注的浓度加入到培养基中。
将菌株置于培养箱中静置培养，或者于摇床中200rpm进行振荡培养。细菌生长通过BioSpec-1601紫外分光光度计(Shimadzu公司，日本)测定波长600nm处的光吸收值(OD600)来表征。
表1本发明所用到的菌株和质粒
Figure BDA0002756556890000041
Figure BDA0002756556890000051
2、序列分析
Escherichia coli MG1655基因组的全序列数据获取自GenBank(登录号：NC_000913.3)。
3、DNA操作
全基因组通过E.Z.N.A全基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。质粒通过E.Z.N.A质粒小量提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。所有用于质粒构建的DNA片段都通过E.Z.N.A胶回收试剂盒(OMEGA，北京，中国)切胶纯化。PCR扩增所用的酶，Gibson反应液配制所用的酶，以及限制性内切酶均购置于NEB公司(NEB，北京，中国)。Q5 High-FidelityDNA聚合酶用于扩增质粒构建所用到的片段，PCR验证使用OneTaq 2X Master Mix。以上实验操作均按照产品说明书使用。
4、DNA测序
构建的质粒以及PCR验证扩增的产物，均进行测序验证，以确定其正确性。测序由通用生物公司(安徽，中国)完成。
5、大肠杆菌电转化感受态的制备
1)从E.coli生长的2YT平板中挑取单菌落，转接到含有100mL 2YT液体培养基的三角瓶中，摇床150rpm震荡培养到OD600达到0.6，随后取出摇瓶冰浴25min，期间每隔5min轻轻的振荡一次。
2)在超净工作台将菌液分装到50mL离心管中，配平后于4℃4000rpm离心15min收集菌体。
3)弃掉上清液，用冰浴预冷的10％甘油悬浮细胞，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞，彻底悬浮、离散沉淀的细胞后，离心收菌。
4)重复第3)步一次。
5)离心，弃掉上清，用1mL的10％甘油重新悬浮细胞。将感受态细胞以每管100μL分装到预冷的Eppendorf tube(EP)管中，冷冻于-80℃下备用。
6、DNA连接
构建质粒的方法主要通过Gibson连接的方式。
1)制备6mL的5X ISO Buffer，组分如下：
3mL 1M Tris-HCL(pH 7.5)
+150μL 2M MgCl2
+240μL 2M 100mM dNTP mix(25mM each:dGTP,dCTP,dATP,dTTP)
+300μL 1M DTT
+1.5g PEG-8000
+300μL的100mM NAD
+ddH2O至6mL，分装成160μL储藏于-20℃下备用。
2)制备600μL的Gibson连接混装体系，组分如下：
160μL 5X ISO Buffer
+0.32μL 10U/μL T5 exonuclease
+10μL 2U/μL Q5 DNA polymerase
+80μL 40U/μL Taq DNA ligase
+ddH2O至1.2mL，分装成15μL于PCR管中，储藏于-20℃下备用。
3)使用的时候，取出一支15μL的Gibson连接MIX，置于冰上溶解、待用。
4)制备质粒构建的片段，并利用NanoDrop(Thermo)测定DNA浓度(ng/μL)。
5)将100ng的质粒载体骨架，和等摩尔的其他片段混合，用移液枪多次吸打，与Gibson连接MIX充分混匀，达到终体积20μL，不足的部分用双蒸水(ddH2O)补足。
6)温浴于50℃之下至少60分钟。
7)取出反应的MIX，吸取1-5μL反应液到大肠杆菌感受态中，电转。
7、电转化步骤
1)将质粒或者Gibson反应液，与感受态充分混匀后，转移到2mm的电转杯中，静置冰上5分钟。
2)将电转仪(Bio-rad)设置到2.5KV的条件下电击，之后立即加入1mL2YT培养基，上下颠倒混匀。
3)将悬浮于2YT培养基中的细胞转移到1mL的EP管中，复苏1小时后，涂布于相应抗性的平板上，置于温箱中倒置培养。
8、质粒构建
质粒构建所用到的引物列于表2中。将血红素代谢通路中不同基因分为四个模块，每个模块使用PTET启动子分别构建质粒PTetO-HE1、PTetO-HE2、PTetO-HE3、PTetO-HE4，再将各模块组装在一个质粒PTetO-HEAss内。
表2该研究中所用到的引物
Figure BDA0002756556890000071
Figure BDA0002756556890000081
试验步骤具体为：
出发质粒pBF-PTetO的序列为(SEQ ID NO:1)
CACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGTGGTACCTCTCAGACGCAGAGTTGCCAACCAGATATCGACGTCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCGTTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGAATTCAAAACTCGACCACTCGAGGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGATCTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGCCTCACGGCGGCGAGTGCGGGGGTTCCAAGGGGGCAGCGCCACCTTGGGCAAGGCCGAAGGCCGCGCAGTCGATCAACAAGCCCCGGAGGGGCCACTTTTTGCCGGAGGGGGAGCCGCGCCGAAGGCGTGGGGGAACCCCGCAGGGGTGCCCTTCTTTGGGCACCAAAGAACTAGATATAGGGCGAAATGCGAAAGACTTAAAAATCAACAACTTAAAAAAGGGGGGTACGCAACAGCTCATTGCGGCACCCCCCGCAATAGCTCATTGCGTAGGTTAAAGAAAATCTGTAATTGACTGCCACTTTTACGCAACGCATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAGTTGCAGCTGATTGCGCATGGTGCCGCAACCGTGCGGCACCCTACCGCATGGAGATAAGCATGGCCACGCAGTCCAGAGAAATCGGCATTCAAGCCAAGAACAAGCCCGGTCACTGGGTGCAAACGGAACGCAAAGCGCATGAGGCGTGGGCCGGGCTTATTGCGAGGAAACCCACGGCGGCAATGCTGCTGCATCACCTCGTGGCGCAGATGGGCCACCAGAACGCCGTGGTGGTCAGCCAGAAGACACTTTCCAAGCTCATCGGACGTTCTTTGCGGACGGTCCAATACGCAGTCAAGGACTTGGTGGCCGAGCGCTGGATCTCCGTCGTGAAGCTCAACGGCCCCGGCACCGTGTCGGCCTACGTGGTCAATGACCGCGTGGCGTGGGGCCAGCCCCGCGACCAGTTGCGCCTGTCGGTGTTCAGTGCCGCCGTGGTGGTTGATCACGACGACCAGGACGAATCGCTGTTGGGGCATGGCGACCTGCGCCGCATCCCGACCCTGTATCCGGGCGAGCAGCAACTACCGACCGGCCCCGGCGAGGAGCCGCCCAGCCAGCCCGGCATTCCGGGCATGGAACCAGACCTGCCAGCCTTGACCGAAACGGAGGAATGGGAACGGCGCGGGCAGCAGCGCCTGCCGATGCCCGATGAGCCGTGTTTTCTGGACGATGGCGAGCCGTTGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCTGCCGCGCCGGTAGCACTTGGGTTGCGCAGCAACCCGTAAGTGCGCTGTTCCAGACTATCGGCTGTAGCCGCCTCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGG
以pBF-PTetO质粒(SEQ ID NO:1)为模板，BLT-PTetO F/BLT-PTetO R为引物扩增骨架。以E.coli MG1655基因组为模板扩增hemA，hemL，hemB，所用引物分别为PTET-HeA F/heL-heA R，HeA-heL F/HeB1-heL R，HeL-heB1F/heB2-heB1 R。将上述DNA片段组装得到质粒PTetO-HE1。
以E.coli MG1655基因组为模板扩增hemC，hemD，hemE，hemN。所用引物分别为PTET-HeCD F/HeE-HeCD R，HeD-HeE F/HeN-HeE R，HeE-HeN F/PTET-HeN R。将上述DNA片段与之前扩增的pBF-PTetO质粒骨架进行组装，得到质粒PTetO-HE2。
以E.coli MG1655基因组为模板扩增hemG1,hemG2,hemG3，hemH1，hemH2。所用引物分别为PTET-HeG1 F/HeG2-HeG1 R，HeG1-HeG2 F/HeG3-HeG2 R，HeG2-HeG3 F/HeH1-HeG3R，HeG3-HeH1 F/HeH2-HeH1 R，HeH1-HeH2 F/PTET-HeH2 R。将上述DNA片段与之前扩增的pBF-PTetO质粒骨架进行组装，得到质粒PTetO-HE3。
以S.oneidensis MR-1基因组为模板扩增ccmF，所用引物为PTET-cmf F/PTET-cmfR，将其与之前扩增的pBF-PTetO质粒骨架进行组装，得到质粒PTetO-HE4。
在得到上述质粒的基础上，利用引物L_D-PTETHE1 F/L_A-PTETHE1 R将PTetO-HE1线性化，同时利用引物L_A-HE2 F/L_B-HE2 R扩增PTetO-HE2中的相应模块，利用引物L_B-HE3 F/L_C-HE3 R扩增PTetO-HE3中的相应模块，利用L_C-HE4 F/L_D-HE4 R扩增PTetO-HE4中的相应模块，将以上4个DNA片段进行组装，得到PTetO-HEAss(SEQ ID NO:2)。
PTetO-HEAss的序列如SEQ ID NO:2所示：
CACCTCGCTAACGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTCTGGGAGGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTCAGAATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGTGGTACCTCTCAGACGCAGAGTTGCCAACCAGATATCGACGTCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCGTTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGAATTCAAAACGCCAAGAATCTAGAAAAGAGTCAGATGAGCCTTGTAGCAATCGGTATTAACCATAAAACAGCCACGGTAGACCTGCGTGAGAAAGTCGCCTTCTCTCCGGACAAAATTCATGATGCCATGAAGAGTCTGGCCAGTCGTACACGCTCGGGTGAAGCCGTTATCGTCTCGACCTGCAATCGCACTGAATTGTATTGTAACAATGGCGATGAGACCGATATCATTGAATGGCTTGAAGAATATCATGGCCTAGAACATCAAGATGTCGCGCCTTGCCTCTACAATTATCACGGGCAAGAGGCGGTAAGGCATTTGATGCGCGTCGCTTCAGGTCTTGACTCGTTGATCCTTGGTGAGCCGCAGATTCTTGGTCAAGTTAAACAAGCCTTTGTCAAAGCCAAAGAAGCCGGCACAGTTGCCTTAACCATTGACCGCTTGTTCCAAAATACCTTCTCAGTTGCTAAAAAAGTGCGTACCGAAACCGAAATCGGTGCCGCTGCTGTATCGGTCGCCTTTGCGGCTGTCAGCATGGCAAAACATATCTTCTCTTCACTGTCGACAACCAAGGTGCTGTTAATTGGTGCTGGTGAAACGATTGAGCTAGTGGCAAAGCATCTAAAAGATAACGGCGTCGCCTCAATGGTGGTGGCAAACCGTACTTTAGAGCGTGCCCAAAGCATGTGTGAGGAATTTAATGCCACGGCAATTACACTGGCACAGATACCAGATTTTCTCCCTAAAGCCGATATCGTGATATCCTCTACCGCCAGCCCGCTGCCAATCCTTGGTAAAGGCATGGTAGAAAAAGCGCTAAAGCAGCGTCGCCATCAACCTATGTTATTGGTTGATATAGCAGTTCCTCGGGATATTGAGCCAGAAGTCGCCGATTTGGACGATGCGTTTCTGTATACAGTGGACGACCTGCATAGCATTATTGAACAGAATAAGGCTTCCCGTAAGGAGGCCGCCGAGCAAGCTGAATTAATTACTGAAGAACAATCTCATCTATTTATGGAGTGGGTGCGTTCTTTAGAGTCGGTCGATAGTATTCGCGAGTATCGCAGCCAGAGCATGGCGATAAAGGATGAGTTGGTGGAACGCGCCCTGAATAAATTAGCGCAGGGGGGCGACACTGAGCAGGTATTGGTTGAATTAGCCAATCGTCTGACCAATAGACTCATTCACGCACCTACCCAAGCCCTCACGGTGGCCAGCCGTCAGGGGGATTTGAATACATTAGGTCAGTTAAGAACAGCGCTCGGATTAGATAAAAACTAATGGCTTCAAACTTTAAGGACTTAACATGACCCGTTCCGAAGCGCTATTTGAACAGGCTAAAAAAACCATCCCCGGCGGTGTTAACTCTCCGGTTCGTGCTTTTAATGGTGTAGGTGGTTCCCCCCTGTTTATTGAAAAAGCCGATGGCGCTTATATCTACGATGCCGATGGCAAAGCCTATATCGACTATGTCGGTTCTTGGGGCCCGATGATCCTCGGCCACAATCATCCGAAGATCCGTGAAGCAGTGCTGGCTGCAGTACACAATGGCCTGTCTTTTGGCGCGCCAACTGAGCTTGAAGTGCAAATGGCCGAAAAAGTGATTGCGATGGTGCCCTCGATTGAGCAAGTCCGTATGGTCAGCTCTGGTACTGAAGCGACCATGAGTGCGATTCGCTTAGCGCGCGGTTTTACTAATCGTGACAAGATCTTAAAGTTTGAAGGTTGCTACCATGGCCACGCTGACTGCCTATTAGTTAAGGCGGGGTCTGGTGCATTAACCTTAGGCCAACCCAGCTCACCCGGCATCCCTGAAGATTTCGCAAAGCACACCTTAACTGCCGTGTATAACGATCTGGATTCTGTTCGTAGCCTATTCGAGCAATATCCAACTGAGATTTCTTGCATCATCATCGAGCCCGTTGCTGGCAACATGAACTGCATCCCACCTATTCCAGGCTTCCTCGAAGGTCTGCGTAGCCTGTGTGATGAGTTTGGTGCGCTGCTGATTATCGACGAAGTGATGACAGGGTTCCGAGTTTCAAAAAGCGGTGCTCAAGGTCACTATGGCGTTACGCCAGACTTAACCACTCTCGGTAAAGTCATCGGTGGCGGTATGCCAGTAGGTGCATTTGGTGGTCGTAAAGATGTGATGCAGTTTATCGCACCAACAGGTCCTGTATACCAAGCAGGTACGCTTTCAGGTAACCCAATTGCGATGTCAGCGGGTCTAGCGCAAATGGAAGCATTGTGTGAAGAAGGACTGTACGAAGCCCTAAGCGCTAAAACCAAGCGCATCGCCGAAGGCTTTAAAGCGGCGGCGGATAAGCACGGCATCCCAATGGCAATCAACTATGTTGGCGGTATGTTCGGCTTCTTTTTTACCGAGCAAGAGCACATCACACGCTTCGACCAAGTGACTAAGTGCAATATTGAGCACTTCCGTACTTTCTACCATGGCATGTTAGATGAAGGCGTTTACTTAGCACCAAGTGCCTATGAAGCAGGCTTCCTGTCGATGGCCCATGGTGAAGAAGAGCTGCGCCTCACACTTGAAGCTGCCGACCGTGTCTTAGCTCGCATGAAAGCGGCAAACTAATGCAAAGTATTAATAAGGAAATTCAATGAGCAGCACACGAGAAAATACCATCGCCCCCCTTCGCCGTTTAAGACGCCTGCGCCGCACCGAGGCCATGCGTGATCTGGTACGTGAAACCCATGTCTCACTCTCCGACTTGATCCACCCACTCTTTATTGAAGAACACATTAACCAAGCTGTGCCAATTTCAACCCTGCCGGGGATTTGCCGTCTGCCCGAAAGCGCACTTGCCGATGAGATCCAAAGGCTCTATGCCTTAGGGATCCGCTATGTGATGCCCTTTGGGATTTCCCATACCAAAGATCCACAGGGCAGCGACACTTGGAATGACAATGGATTGCTCGCACGGATGATCCGTACCATAAAAGCCACCGCGCCAGAGATGATGGTGATCCCCGATATTTGTTTTTGTGAATATACCGACCATGGACACTGCGGCGTGTTGCACCAAGACGAAGTCTGTAACGACCAAACCGTGGCTAACTTAGTCAAACAATCCGTCACCGCCGCTAAAGCGGGAGCTGATATGTTGGCGCCATCAGCAATGATGGATGGTCAAATTAAAGCGATACGACAAGGGCTGGATGAAGCAGGCTTTGAACACGTAGCCATTTTGGCCCACGCAGCCAAGTTCGCCTCCTCTTTCTACGGGCCTTTTAGGGCCGCTGTAGATTGTGAACTCAGTGGTAACCGCAAAGGCTATCAGCTCGATTACGCCAATGGCCGCCAAGCATTGCTCGAAGCACTGCTCGATGAGGAAGAAGGCGCAGATATTTTGATGGTAAAACCCGGCACGCCATATTTGGATGTATTAAGTCGCCTAAGACAAGAAACCCACCTCCCCTTAGCGGCCTATCAAGTGGGTGGCGAATATGCAGGTATTAAATTTGCTGCGCTGGCGGGCGCCCTCGATGAGCGCGCCGTTGTCACTGAAACCTTTATCGGTTTAAAACGGGCTGGTGCCGATTTAATTGTCAGTTATTACACTAAACAATATGCCGAGTGGTTAGCAGAGTTACGCGAATAAAACAGAACCTAATTAGGAGTCTAATGTGAATATCATTACCAGTGCCTTCCCACAGCGCAGAATGCGCCGCATGCGTAAACATGATTTTAGTCGTCGCCTGATGGCTGAGAATCACCTAACAGTGAATGACTTAATCTATCCAATGTTTGTGCTCGAAGGCAGCAATCGCAGCGAAAAAGTGGCTTCAATGCCAGGTGTAGAGCGCTACTCTATCGACCTACTGCTAAAAGAAGCAGAAGAGCTAGTTGAATTAGGTATCCCCTTAATAGCCCTCTTTCCTGTTACGCCTTCCGAGAAAAAGTCGCTTATGGCAGAAGAGGCATACAATGCTGATGCGCTAGTGCAACGCGCAGTGCGTGAACTCAAAAAAGCTTTCCCGCAACTTGGCATTATGACCGACGTAGCTCTAGATCCTTTC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9、血红素产量诱导
将工程菌株从-80℃保菌管中按1％(v/v)接种至LB液体培养基(5mL)中，震荡培养过夜后作为种子液待用。然后将种子液按1％接种至LB液体培养基扩大培养(500mL)。待OD600约为0.2时，添加20μg/L aTc诱导剂，连续培养发酵3天。收集上清液用于血红素的测定。
10、血红素的测定
利用高效液相色谱(HPLC)法对血红素进行测定，安捷伦1290Ⅱ高效液相色谱仪，Extend-C18液相色谱柱(2.1x 150mm,1.8um),HPLC流动相为甲醇:0.1％甲酸＝80:20，流速0.5mL/min,光电二极管阵列检测器(DAD)399nM处检测。
11、实验结果
本技术构建的工程菌具有较高的血红素产量，且无需破胞提取，培养3天后胞外游离血红素可达250mg/L。
该方法可在短时间内生产大量血红素，节省了细胞破碎等成本，简化了提取步骤，减少了损耗。因此，该策略提供了一种高产血红素的可持续方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学技术大学
<120> 高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法
<130> MP2007875
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5051
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60
tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120
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ctctatcgtt gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agaattcaaa 960
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cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 1920
tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 1980
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttgctggt aagattgatt accctaaata tggcttattc gaccgcacaa tgatctgttt 10800
tatcatgtgg atgactaagg ggccaacgga tcttaagggc acgtttgagt ttaccgattg 10860
ggctaaagtc gaagcttttg gcactcattt tagtaagcta taatactttt actgaacgag 10920
aataccccat gacacgcatc ctggtgcttt attttacccg aggaggccat acggccaaga 10980
ttgccaatgc aatagcggag caattaaccc tgcgtggcgc aaaggttgac ttagtcgata 11040
tcaatagtgc ggctgcaaca cgaatcaact ggtccgatta tcagctggtg gctttgggtg 11100
cctgtgtact ctatggcact tatgataaga gtgtatttca atttattgag caacatgtgc 11160
aggctttgag ttttttgcca aacagttttt tctgcgtcaa cgtggtcgca cgtaatccgg 11220
agaaacgtat tcctgaaaac aataaatacc tgcaaaagtt tatcactcta tctccttgga 11280
ctcccgcaga tttgaagatt attgctggta aagtcgatta tccatcttgg ccttggtacg 11340
acagattaat gatccagtta attatgaaaa tcactaaagg cccaacggat ccaaaagcag 11400
ttattgatta taccgattgg gaagatgtga aagtctatgc cgaccatctg ctgaccttgg 11460
tcgaggttgc tgaacctgcc taattttatt gagataatcg aggcttaagt gaaaaaaatt 11520
ctgatcatct tttccagtgt tcatggccac actcgtaaaa tcaccaatca gttagctcag 11580
caactcaaag agttgggtaa ttcggtggtg attgcggata ttaaggctgt ccctgcgatg 11640
gagtctttcg ataagatcat tattggcgcg agtattcgtc acggaaaaca taatcctgcg 11700
ttgtacgaat ttatccaaaa gcatcaacag atcctcacgc aaaaggtcag tggctttttc 11760
tccgtcagtt tagtggctcg taaacccgag aaaaatactc cagaaaccaa cccatacatg 11820
caagcatttt taagcaaaac gacttggcgc cctaagttgc tacaagtgtt tggcggtaat 11880
ctgaattacc aaggttataa tgctttcgat agaaatatta ttcgttttat catgtggtta 11940
actaaggggc caacggatcc tgtcaccaat gttgaataca cagactggca aaaagtgcaa 12000
gagtttggtt tacaaatcca tcaagcctaa ctaggttttc aggattatca aaagaaatgg 12060
gtcacgctgc gcgtggcaaa gttggagtgc tgttattaaa ccttggcact cctgatgcgc 12120
caacagcatc ggcagtaagg cgttatcttg ccgagttttt atctgatcca cgggtggtgg 12180
aaatcccaaa actcctctgg atgctgattt tgtatggcat agtacttagg gtacgccctg 12240
caaagtctgc agcactttat caaaaggtgt ggactgaggc ggggtcgcca ctgatggata 12300
tcagtttgcg acaaacggct aagctatccg ataaattaac cgcggatggt catcaagttt 12360
cggttcactt agctatgcgt tatggtaatc cttctgttgc cagcacttta cgagagatgc 12420
acaaacaagg gattgataag ctggtggttt taccgctcta tccgcaatat gctgcgccga 12480
caactggctc ggcttttgac gctatcgcta aagagttatc ccaatggcgc tacctgccat 12540
cgctgcattt tattaatact tatcacgata accctgattt tattgctgca ttagtcaatt 12600
cgattcgtga cgattttgat aaacatggca agccgcaaaa gttagtgctg tcttaccatg 12660
gaatgcctga gcgcaatctt catctgggtg atccatatta ttgtttttgc atgaagacta 12720
ctcgtcttgt ggctgagcaa ttaggtttga gcaaagatga atttgcgatc acattccaat 12780
ctcgctttgg taaggccaag tggttgcaac cctatacgga tgcaacgatg gcggctctac 12840
cgagtcaagg tgtgcgtgat gtagcgattg tgtgcccagc atttagcgcc gattgtttag 12900
agacgctaga agagattgtc ggcgaaaatg gccatatctt tactcatgcg gggggagaga 12960
agttccgata tattcctgcg ctcaatgata atgatgacca catcgccatg atggcgaatt 13020
tggtgaagcc gtatctgtaa tatttggctg ataaaaggta gcacattgac ttctccctct 13080
cctgcgtttg gcgtgttatt agtaaatctt ggtacgcctg atgaacccac tccgaaagcg 13140
gttaagcgat ttctcaagca gtttttaagt gatcctcggg tcgtcgattt atccccttgg 13200
ttgtggcaac ccattttgca ggggattatc ctgaacaccc gtcctaagaa agtcgctaaa 13260
ctttatcaaa gtgtgtggac ggagcaaggt tcgccgttaa tggtgattag tcagtgccaa 13320
gcccaaaagt tggcaacgga tttaagcgcc acctttaatc agaccattcc ggtggaactg 13380
ggtatgagct atggcaatcc ttcgattgag agtggctttg ccaaactcaa agcccaaggc 13440
gccgaacgta tcgtggtgct gccgctgtat ccgcagtatt cctgctcaac cgtcgccagt 13500
gtgtttgatg cggtagcgca ttatttgact cgcgtgcgtg atatacctga gctgcgtttt 13560
aacaagcagt atttcgccca tgaagcctat attgcggcgc tggcgcattc ggtaaagcgc 13620
cattggaaaa cccatggtca ggccgagaag ctgattttat ctttccacgg gatcccgctg 13680
cgctacgcga ccgaaggcga cccataccca gagcagtgcc gcaccaccgc caagttatta 13740
gcgcaggcct taggcttgac cgacggacaa tggcaagtat gtttccaatc ccgcttcggt 13800
aaagaagagt ggttgacgcc ctatgccgat gagttgctgg cggatttacc ccgccaaggc 13860
gtgaaaagtg tcgatgtgat ttgccctgcc tttgctaccg attgccttga aaccctagaa 13920
gaaatctcga ttggcgcgaa agagaccttc ctccatgcag gtggcgaagc ctatcatttt 13980
attccttgtt tgaatgatga tgagctacat atagagctac tcaggttatt agtacaagaa 14040
caaacgcagt cttggataag tgcagaataa ctcgaccact cgaggccagg catcaaataa 14100
aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg 14160
ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt tataaccggt 14220
aaaccagcaa tagactgtca ggaaaatact gcgtttacta tcagcaattt ttgttgacac 14280
tctatcgttg atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gaattcaaaa 14340
tattattaga gactgaggaa aacccatgat cccagaactt ggacactttt cgctgataat 14400
aggagtggct tttgccttct tattaaccag cgttcccctt ataggtgttg cccgtaaaga 14460
ccaatatcta gtgaggtatg cttggccgtt agcctacgga atgttctttt ttatcgcttt 14520
atccgtagta tcacttggtt acagcttcgc cgttgatgat ttctccgtgg cctatgtggc 14580
acatcactct aattctcagt tacctatctt ctttaagatt gcggccgtat ggggcggtca 14640
tgaagggtcg ctgctattct gggtgttcgc gctatccact tgggctgcct ctgttgcttt 14700
attcagtaaa ggcttagaag aagtcttcac cgctcgcgtg ttagcggtat tggcattgat 14760
tgtgattggc ttcagcttgt ttatgttact cacttctagc ccatttgaac gtatattccc 14820
aatgcctgct gaaggccgcg acttaaatcc aatgctgcag gatgtgggct taatcttcca 14880
ccctccgatg ttatatttgg gttatgtggg tttctcagtc agttttgcat ttgcgattgc 14940
agctttgatg agtggtcacc ttgattctgc ttgggctcgt tggtcgcgtc cttggacctt 15000
agccgcttgg gttttcctca ctggtggtat tgcattaggt tcttggtggg cgtattacga 15060
attaggctgg ggtggatggt ggttctggga tccagtagaa aacgcttcat ttatgccttg 15120
gctagtgggt acggctttag tgcattcact gatcgtgacg gaaaagcgcg gtgcattccg 15180
taactggacg gtattgctgt ctatcttcgc attctcgcta agtttactcg gtacctttat 15240
cgtacgctct ggtgtgttga cttcagtgca ttcatttgca gccgatccaa gccgcggtat 15300
gtttattcta ttattgcttg gtctcgctat cggtggttcg ctcactttgt ttgccttccg 15360
tgcaagtgaa atgagcagcc ctgcacgctt cgagctgaaa tcaaaagaaa ccatgctgtt 15420
agtttgtaac gtgttactga cggttgcagc gggtactgtt ctgttaggca ctttataccc 15480
actgctgatc gatgcgttag gcatgggtaa gatttctgtt ggacctccat actttaacgc 15540
tgtgtttgta cccatagtac ttgtactgtt tgcctttatg ggcgtcggtc caatcattcg 15600
ttggaaaaaa tcgaaagctg gtgaattgaa gcgacagtta ctcgtacctg cattagtatc 15660
tctggtgatt ggtattgtca cgccgtttat cgtcgatggg gcctttaacg cttgggttgc 15720
ttgcggtatc gccgctgcag cttggattat tttggcaacc gcaaaagcag cttacagcat 15780
cgttaagcct aaagatggtg aagtaagcat cgcacgtatg ggccgtagcc aactcggtat 15840
gatcatcgcg cacttaggta ttgctgtgtc tgttattggt gccactatgg tgtctaacta 15900
ctcagtggag aaaagtgtgc gtatggggcc tggcgtaagc caagagctag cgggttacac 15960
ctttaaatat ctcgaaacta aaaacgttgt tggtcctaat tacactgcgc agcaaggtca 16020
aattgagatt tacaaaggcg ataagttact gacactgctc aaacccgatc gtcgccaata 16080
caatgtgcgt actatggata tgaccgaagc cggtatcgat tggggtctgt tccgcgatct 16140
gtatgtgacg atgggcgatc cgattagtag tactgaattt gctgtgcgtt tgaactacaa 16200
gccgtttgtg cgttggttat ggttcggagc aatattcatg atggtcggcg gtttctttgc 16260
cgcatcggat aaacgctatc gctcaaaagt cgcggctacc gttaaaccgc aagctgaaaa 16320
agcgaaatta gctaccgctc aataactcga ccactcgagg ccaggcatca aataaaacga 16380
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 16440
tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttataa ccggtaaacc 16500
agcaatagac actatcggaa taaaggagtt cgcttacttc ctatttaacg accctgccct 16560
gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg aaccccagag tcccgctcag aagaactcgt 16620
caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga 16680
ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta 16740
tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc 16800
cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc 16860
cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct 16920
cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga 16980
tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc 17040
gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat 17100
cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga 17160
gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct 17220
gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg 17280
ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc 17340
cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca 17400
tgcgaaacga tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc 17460
ttggcggcaa gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg 17520
ccccagctgg caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc 17580
atgtaagccc actgcaagct acctgctttc tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga 17640
tagcccagta gctgacattc atcccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcgcccgcg 17700
ttcctgctgg cgctgggcct gtttctggcg ctggacttcc cgctgttccg tcagcagctt 17760
ttcgcccacg gccttgatga tcgcggcggc cttggcctgc atatcccgat tcaacggccc 17820
cagggcgtcc agaacgggct tcaggcgctc ccgaagatct cgggccgtct cttgggcttg 17880
atcggccttc ttgcgcatct cacgcgctcc tgcggcggcc tgtagggcag gctcataccc 17940
ctgccgaacc gcttttgtca gccggtcggc cacggcttcc ggcgtctcaa cgcgctttga 18000
gattcccagc ttttcggcca atccctgcgg tgcataggcg cgtggctcga ccgcttgcgg 18060
gctgatggtg acgtggccca ctggtggccg ctccagggcc tcgtagaacg cctgaatgcg 18120
cgtgtgacgt gccttgctgc cctcgatgcc ccgttgcagc cctagatcgg ccacagcggc 18180
cgcaaacgtg gtctggtcgc gggtcatctg cgctttgttg ccgatgaact ccttggccga 18240
cagcctgccg tcctgcgtca gcggcaccac gaacgcggtc atgtgcgggc tggtttcgtc 18300
acggtggatg ctggccgtca cgatgcgatc cgccccgtac ttgtccgcca gccacttgtg 18360
cgccttctcg aagaacgccg cctgctgttc ttggctggcc gacttccacc attccgggct 18420
ggccgtcatg acgtactcga ccgccaacac agcgtccttg cgccgcttct ctggcagcaa 18480
ctcgcgcagt cggcccatcg cttcatcggt gctgctggcc gcccagtgct cgttctctgg 18540
cgtcctgctg gcgtcagcgt tgggcgtctc gcgctcgcgg taggcgtgct tgagactggc 18600
cgccacgttg cccattttcg ccagcttctt gcatcgcatg atcgcgtatg ccgccatgcc 18660
tgcccctccc ttttggtgtc caaccggctc gacgggggca gcgcaaggcg gtgcctccgg 18720
cgggccactc aatgcttgag tatactcact agactttgct tcgcaaagtc gtgaccgcct 18780
acggcggctg cggcgcccta cgggcttgct ctccgggctt cgccctgcgc ggtcgctgcg 18840
ctcccttgcc agcccgtgga tatgtggacg atggccgcga gcggccaccg gctggctcgc 18900
ttcgctcggc ccgtggacaa ccctgctgga caagctgatg gacaggctgc gcctgcccac 18960
gagcttgacc acagggattg cccaccggct acccagcctt cgaccacata cccaccggct 19020
ccaactgcgc ggcctgcggc cttgccccat caattttttt aattttctct ggggaaaagc 19080
ctccggcctg cggcctgcgc gcttcgcttg ccggttggac accaagtgga aggcgggtca 19140
aggctcgcgc agcgaccgcg cagcggcttg gccttgacgc gcctggaacg acccaagcct 19200
atgcgagtgg gggcagtcga aggcgaagcc cgcccgcctg ccccccgagc ctcacggcgg 19260
cgagtgcggg ggttccaagg gggcagcgcc accttgggca aggccgaagg ccgcgcagtc 19320
gatcaacaag ccccggaggg gccacttttt gccggagggg gagccgcgcc gaaggcgtgg 19380
gggaaccccg caggggtgcc cttctttggg caccaaagaa ctagatatag ggcgaaatgc 19440
gaaagactta aaaatcaaca acttaaaaaa ggggggtacg caacagctca ttgcggcacc 19500
ccccgcaata gctcattgcg taggttaaag aaaatctgta attgactgcc acttttacgc 19560
aacgcataat tgttgtcgcg ctgccgaaaa gttgcagctg attgcgcatg gtgccgcaac 19620
cgtgcggcac cctaccgcat ggagataagc atggccacgc agtccagaga aatcggcatt 19680
caagccaaga acaagcccgg tcactgggtg caaacggaac gcaaagcgca tgaggcgtgg 19740
gccgggctta ttgcgaggaa acccacggcg gcaatgctgc tgcatcacct cgtggcgcag 19800
atgggccacc agaacgccgt ggtggtcagc cagaagacac tttccaagct catcggacgt 19860
tctttgcgga cggtccaata cgcagtcaag gacttggtgg ccgagcgctg gatctccgtc 19920
gtgaagctca acggccccgg caccgtgtcg gcctacgtgg tcaatgaccg cgtggcgtgg 19980
ggccagcccc gcgaccagtt gcgcctgtcg gtgttcagtg ccgccgtggt ggttgatcac 20040
gacgaccagg acgaatcgct gttggggcat ggcgacctgc gccgcatccc gaccctgtat 20100
ccgggcgagc agcaactacc gaccggcccc ggcgaggagc cgcccagcca gcccggcatt 20160
ccgggcatgg aaccagacct gccagccttg accgaaacgg aggaatggga acggcgcggg 20220
cagcagcgcc tgccgatgcc cgatgagccg tgttttctgg acgatggcga gccgttggag 20280
ccgccgacac gggtcacgct gccgcgccgg tagcacttgg gttgcgcagc aacccgtaag 20340
tgcgctgttc cagactatcg gctgtagccg cctcgccgcc ctataccttg tctgcctccc 20400
cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag ccggcgg 20457

Claims (6)

1.一种高产血红素的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf；
所述hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2的来源为E. coli MG1655；
所述ccmf的来源为S. oneidensis MR-1。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的质粒载体为pBF-PTetO；
所述质粒载体的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求1至3中任一项所述重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
以质粒载体为模板，扩增得到质粒骨架；
以E. coli MG1655基因组为模板扩增hemA，hemL，hemB，将得到的DNA片段与质粒骨架组装得到质粒-HE1；
以E. coli MG1655基因组为模板扩增hemC，hemD，hemE，hemN，将得到的DNA片段与质粒骨架组装得到质粒-HE2；
以E. coli MG1655基因组为模板扩增hemG1, hemG2, hemG3，hemH1，hemH2，将得到的DNA片段与质粒骨架组装得到质粒-HE 3；
以S. oneidensis MR-1基因组为模板扩增ccmF，将得到的DNA片段与质粒骨架组装得到质粒-HE 4；
在得到质粒-HE1、质粒-HE2、质粒-HE3、质粒-HE4的基础上，将HE1、HE2、HE3、HE4DNA片段进行组装，得到重组质粒。
5.一种高产血红素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包括权利要求1至3中任一项所述的重组质粒；所述基因工程菌株的宿主菌为S. oneidensis MR-1；所述基因工程菌株的启动子为四环素诱导型启动子***。
6.一种高产血红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养权利要求5所述基因工程菌株，当菌液的OD600为0.15~0.25时加入诱导剂进行发酵培养，收集上清液。
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