UA76690C2 - Дріжджі, що зброджують ксилозу у етанол (варіанти), плазмідний вектор та спосіб зброджування ксилози у етанол - Google Patents

Abstract

Винахід стосується рекомбінантних дріжджів, які зброджують ксилозу у етанол і які зберігають згадану здатність у разі культивування впродовж численних генерацій у неселективних живильних середовищах. Дріжджі включають множину копій інтегрованих генів, які кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, злитих з промоторами, які не пригнічують глюкозу і не потребують ксилози для індукування. Наведено також опис переважних способів інтегрування численних копій екзогенної ДНК до клітин-хазяїв шляхом трансформування клітин реплікаційними / інтеграційними векторами з наступною реплікацією клітин певну кількість разів за умов селекційного тиску для стимулювання затримки згаданого вектору у наступних генераціях.

Description

Опис винаходу

Цей винахід взагалі має відношення до мікроорганізмів, одержаних засобами генної інженерії, і, зокрема, до специфічних способів стійкого включення екзогенної ДНК до клітин, у тому числі, стійкого включення численних копій екзогенної ДНК до повторюваних послідовностей ДНК хазяїна. За своїм переважним аспектом, цей винахід має відношення до дріжджів, здатних до зброджування ксилози (у переважному варіанті, до зброджування ксилози з глюкозою) у етанол. Зокрема, за своїм переважним аспектом цей винахід має відношення до дріжджів, до складу яких входять клоновані гени, які кодують ксилозредуктазу (ХК), 70 ксилітолдегідрогеназу (ХО) та ксилулокіназу (ХК), причому згадані дріжджі, по суті, зберігають свою ефективність відносно зброджування ксилози у етанол навіть після культивування у неселективному живильному середовищі впродовж значної кількості генерацій.

Як додаткова передумова, результати нещодавніх досліджень підтвердили те, що етанол є ідеальним рідким паливом для автомобілів. Він може бути використаним безпосередньо, як чисте паливо (10095 етанол), або як 19 суміш з бензином у різних концентраціях. Застосування етанолу, як додатка до або замінника бензину може зменшити залежність багатьох країн від імпортованої закордонної нафти, а також забезпечити відновлювальне паливо для транспорту. На додаток до цього, виявилось, що етанол забезпечує більш чисте паливо, яке виділяє набагато менше забруднювачів до довколишнього середовища, аніж звичайний бензин. Наприклад, було продемонстровано, що використання у бензині матеріалів, насичених киснем, може зменшити викид у повітря моноксиду вуглецю, шкідливого забруднювача. Серед декількох оксигенаторів, які застосовуються сьогодні для підвищення вмісту кисня у бензині, найвищий вміст кисня має етанол. Агентство по захисту довколишнього середовища (США) показало, що бензин, змішаний з 1095 етанолу, зменшує викиди моноксиду вуглецю, приблизно, на 25-3095.

До сього часу, сировиною, яка використовувалась для одержання технічного спирту шляхом зброджування, с 29 були цукри з цукрового очерету або цукрового буряка та крохмаль з кукурудзи або інших продовольчих культур. (9

На цей час, однак, згадані сільськогосподарські культури розглядаються, як надто дорогі для використання як сировина з метою великомасштабного продукування паливного етанолу. Рослинна біомаса є привабливою сировиною для продукування паливного етанолу шляхом зброджування, оскільки вона є відновлювальною та доступною за низькими цінами та у великих кількостях. Згадана концепція використання спирту, виробленого о шляхом мікробіологічного зброджування цукрів біомаси сільськогосподарських культур, народилась, як мінімум, Ге»! два десятиріччя тому. Головними зброджувальними цукрами з целюлозних матеріалів є глюкоза та ксилоза, причому співвідношення між глюкозою та ксилозою складає, приблизно, від 2 або З до 1. Найбажанішими ке, способами зброджування целюлозних матеріалів були б, звичайно, такі, які повністю перетворюють глюкозу та Ге) ксилозу у етанол. На жаль, навіть зараз немає жодного відомого природного мікроорганізму, здатного до

Зо ефективного зброджування глюкози та ксилози. -

Дріжджі, зокрема, дріжджі роду Засспаготусез, традиційно застосовують для зброджування глюкозовміщувальної сировини у етанол і вони все ще розглядаються, як найкращі мікроорганізми для цієї мети.

Встановлено, однак, що ці глюкозозброджувальні дріжджі, у тому числі, дріжджі роду Засспаготусев, є « нездатними до зброджування ксилози, а також нездатними до використання згаданого пентозного цукру для З 70 росту. с Нещодавно Н. ГО (М. Но) та інші одержали рекомбінантні дріжджі, зокрема, рекомбінантні дріжджі роду

Із» Засспаготусевз, здатні до ефективного зброджування ксилози у етанол (Го та Цао (Тзао), 1995). Зокрема, переважні рекомбінантні дріжджі були здатними до комбінованого зброджування двох головних цукрових складових целюлозної біомаси, глюкози та ксилози, у етанол (Го та Цао, 1993). Згадані рекомбінантні дріжджі було створено шляхом трансформування дріжджів мультикопійною плазмідою, до складу якої входили три і клоновані гени, ХК, ХО та ХК, які кодують три ключові ферменти для метаболізму ксилози (Фігура 1). На Фігурі

Ге») 2 та Фігурі З показано двоє попередньо утворених рекомбінантних дріжджів роду Засспаготусевз, позначених, як 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), здатних до комбінованого зброджування 895 глюкози та 495 ксилози, присутніх у б одному середовищі, майже повністю у етанол впродовж двох днів. З іншого боку, на Фігурі 4 показано, що

Те) 20 батьківський дріжджовий гібрид 1400 (ДАмор (Б'Атоге) та інші, 1989 та ДАмор та інші, 1990) може зброджувати у етанол тільки глюкозу, але не ксилозу. 1400 (рі МНЗ2) (скорочено, Ї МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3) (скорочено, с І МНЗ3) було створено шляхом трансформування гібриду Засспаготусез 1400 (Д'Амор та інші, 1989 та ДАмор та інші, 1990) за допомогою двох мультикопійних плазмід, рі МНЗ2 та рі МНЗЗ3, які представлено на Фігурі 1. На цей час є повідомлення про існування чотирьох таких мультикопійних плазмід, рі МНЗ1, рі МНЗ2, рі МНЗЗ та рі МНЗ4 29 (Го та Цао, 1995). Кожна з цих плазмід може трансформувати гібрид 1400 до рекомбінантних дріжджів для

ГФ) комбінованого зброджування глюкози та ксилози з однаковою ефективністю.

Дріжджі 1400 (рі МнНЗ2), 1400 (рі МНЗ3) та споріднені рекомбінантні ксилозозброджувальні дріжджі роду о Засспаготусевз, з їхніми генами до метаболізування ксилози, клонованими на 2мкм стабільній мультикопійній плазміді, є цілком придатними для періодичного зброджувального процесу. Однак, під час безперервного 60 зброджувального процесу, після тривалого культивування у живильному середовищі, збагаченому глюкозою (більше 20 генерацій), 1400 (рі МНЗ2), 1400 (рі МНЗ3З) та подібні плазмідопосередковані рекомбінантні дріжджі втрачають здатність до зброджування ксилози, як показано на Фігурі 5 та Фігурі 6.

Взагалі, екзогенна ДНК або ген(и) можуть бути клонованими у дріжджах двома різними шляхами. Одним з них є клонування екзогенної ДНК або гену(-ів) у векторі на основі плазміди, до складу якого входить генетичний бо маркер, що селектується, та функціональний сайт ініціювання реплікації ДНК дріжджів або автономна реплікаційна послідовність (АК5) (Струл (ЗігийіІ) та інші, 1979; Стінчкомб ((пспйсотр) та інші, 1980; Чен (Спап) та Тай (Тує), 1980), що наділяє плазміду здатністю до автономної реплікації у її новому хазяїні з наступним трансформуванням бажаних дріжджів-хазяїв згаданою плазмідою, до складу якої входить клонований фрагмент ДНК або ген(-и). Утворені дріжджові трансформанти є здатними до стійкої підтримки клонованого гену у присутності селекційного тиску. Однак, такий клонований ген(-и) є нестійким після тривалого культивування у неселективному живильному середовищі (за відсутності селекційного тиску).

Іншим способом клонування екзогенної ДНК або гену(-ів) у дріжджах-хазяях є інтегрування ДНК або гену(-ів) до дріжджової хромосоми. У дріжджів інтеграційне трансформування майже завжди відбувається шляхом 7/0 гомологічної рекомбінації (Орр-Вівер (Огт-У/еамег), 1981). Найпростішим шляхом клонування необхідного гену у дріжджовій хромосомі шляхом інтегрування є, по-перше, клонування необхідного гену у плазміді, до складу якої не входить сайт ініціювання реплікації або АК5 (автономні реплікаційні послідовності), але до складу якої входить фрагмент ДНК хазяїна для спрямування інтеграції до певного сайту (Орр-Вівер, 1981). Трансформація нових дріжджів-хазяїв таким інтактним інтеграційним вектором приведе до утворення інтеграційних 7/5 трансформантів, до складу яких буде входити необхідний ген, клонований у сайті поряд з вибраною цільовою послідовністю ДНК дріжджів. Однак, частота такої інтеграційної трансформації є надзвичайно низька (від 1 до трансформантів на мкг ДНК). У подальшому, було показано, що інтеграційні вектори, лінеаризовані у межах фрагменту ДНК, гомологічного хромосомній ДНК хазяїна, можуть трансформувати дріжджі з набагато вищою частотою (вищою у 100-1000 разів) (Орр-Вівер, 1981; Орр-Вівер та Шостак (52овіак), 1983). Було висунуто го припущення, що двониткові розриви, внесені рестриктазним розщепленням, є рекомбіногенними та високоінтерактивними з гомологічною хромосомною ДНК. Це є особливо придатним у разі комплексної плазміди, до складу якої входить більше одного дріжджового гену, завдяки чому інтеграцію можна спрямувати до певного сайту шляхом утворення рестриктазного розрізу на відповідній ділянці плазм іди.

У іншому типі інтеграції, який називають також переміщенням або розділенням генів, застосовують подвійну сч ов гомологічну рекомбінацію для заміщення дріжджової хромосомної ДНК (Ротстейн (КоїПпзіеїп), 1981). До складу подвійних гомологічних рекомбінаційних векторів входить екзогенна ДНК або ген(-и), призначений(ї) для і) клонування, та селекційний маркер, фланкований послідовностями ДНК дріжджів, гомологічних 5' та 3' ділянкам сегменту хромосомної ДНК, призначеним для заміщення. Перед трансформацією, згаданий вектор розщеплюють рестриктазами, які вивільняють перемісний фрагмент, до складу якого входять 5' та 3 кінці, гомологічні о зо послідовностям хромосомної ДНК на необхідних сайтах інтеграції. Останній згаданий спосіб став переважним способом інтеграційної трансформації дріжджів у разі необхідності одержання стійкого монокопійного Ме трансформанту. Ге

Ряд способів, заснованих на інтеграції до повторюваної послідовності ДНК, було використано для одержання стійких мультикопійних інтегрантів. Наприклад, дельта-послідовність дріжджового ретротранспозону Ту (Сакаї ісе) (ЗакКаї) та інші, 1990; Сакаї та інші, 1991), висококонсервативний повторюваний сигма-елемент (Кудла (Киаіа) ї- та Ніколас (Місоїаз), 1992) та нетранскрибовані послідовності рибосомної ДНК (Лопес (І оревз) та інші, 1989;

Лопес та інші, 1991; Россоліні (Коззоїїпі) та інші, 1992) було використано, як сайти-мішені для множинної інтеграції екзогенного гену(-ів) до дріжджів (Ротстейн, 1991; Романос (Котапоз) та інші, 1992).

Під час виконання недавніх досліджень по множинній інтеграції екзогенних генів до дріжджової хромосоми, « 70 результати яких повідомлялись у літературі, було залучено, головним чином, використання або відповідним в с чином лінеаризованих нереплікаційних векторів, або фрагментів ДНК, до складу яких входив необхідний ген(-и), . призначений для клонування, та генетичний маркер для селекції, фланкованих послідовностями ДНК, и?» гомологічними ділянці хромосомної ДНК дріжджів. Для здійснення згаданої рекомбінантнзі трансформації подеколи використовували лінеаризовані реплікаційні вектори і майже ніколи інтактні реплікаційні вектори,

Наприклад, інтактні вектори на основі автономних реплікаційних послідовностей. Таким чином, з часу -І проведення ранніх досліджень відносно започаткування розвитку інтеграційної трансформації дріжджів (Шостак та Ву (Ми) (1979)) та незважаючи на повідомлення про те, що ДНК, клонована на векторах на основі АК5, може

Ме, інтегруватись до хромосом хазяїна (Крегг (Стедо) та інші, 1985; Курц (Кигіг) та інші, 1986), від застосування

Ге» інтактних векторів на основі АК (Струл та інші, 1979; Стінчкомб та інші, 1980; Чен та Тай, 1980) для інтеграційних цілей давно відмовились. Це стало особливо помітним з моменту відкриття того, що двониткові ік розриви, здійснені шляхом рестриктазного розщеплення, є рекомбіногенними (Орр-Вівер, 1981; Орр-Вівер та о Шостак, 1983).

У світлі згаданих передумов, залишається необхідність у більш стійких дріжджах, які зброджують ксилозу у етанол, у переважному варіанті, одночасно ксилозу та глюкозу у етанол, та у легких та ефективних способах одержання мультикопійних інтегрантів. Цей винахід адресовано задоволенню згаданих потреб.

Відповідно, цей винахід надає дріжджі, до складу яких входять численні копії стійко клонованих ХК, ХО та

Ф) ХК генів, які навіть після культивування у неселективному живильному середовищі впродовж численних ка генерацій (наприклад, більше 20) зберігають свою повну здатність до зброджування ксилози у етанол. У більш переважному варіанті, ХК, ХО та ХК гени повністю зливаються з промоторами, не пригніченими присутністю бо глюкози і які також не потребують присутності ксилози для своєї експресії. У ще більш переважному варіанті, дріжджі за цим винаходом можуть комбіновано зброджувати дві головні складові целюлозної біомаси, глюкозу та ксилозу, у етанол.

Інший варіант здійснення цього винаходу має відношення до використання повторюваних послідовностей, наприклад, нетранскрибованих послідовностей рДНК, прилеглих до 55 ДНК (Валензуела (МаЇепгиеїа) та інші, 65 1977), як гомологічних послідовностей для спрямування мультикопійної інтеграції фрагменту ДНК, до складу якого входять ХК, ХО та ХК, до геному дріжджів шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, реплікаційний плазмідний вектор, до складу якого входить фрагмент ДНК, фланкований гомологічними послідовностями, може бути використаний для спрямованої інтеграції фрагменту ДНК. Переважний спосіб за цим винаходом включає етапи (а) трансформування клітин реплікаційною/інтеграційною плазмідою, яка включає екзогенну ДНК, до складу якої входить селекційний маркер; та (б) повторної реплікації згаданих клітин з етапу (а) для одержання ряду генерацій клітин-попередників з відбиранням клітин, які включають селекційний маркер (наприклад, реплікацією на селективних планшетах), з метою стимулювання затримки реплікаційної та інтеграційної плазміди у наступних генераціях клітин-попередників та утворення клітин-попередників, які мають численні інтегровані копії екзогенної ДНК. На додатковому етапі, згадані клітини з етапу (Б) можуть реплікуватись для одержання 7/0 РЯДУ генерацій клітин-попередників за відсутності відбору клітин, які включають селекційний маркер, з метою стимулювання втрати плазміди у наступних генераціях клітин-попередників (внаслідок чого залишається збагачена популяція стійких інтегрантів).

Цей винахід також надає переважний спосіб відбору та підтримки необхідних трансформантів. Добре відомо, що усі мікроорганізми для росту потребують присутності у мінімальному живильному середовищі джерела 7/5 Вуглецю, наприклад, глюкози або ксилози. Більшість мікроорганізмів, однак, не потребує присутності джерела вуглецю для росту у збагаченому живильному середовищі. Незважаючи на це, цим винаходом передбачається використання джерела вуглецю, як селекційного тиску для відбору трансформантів навіть у збагаченому живильному середовищі, наприклад, МЕР (195 дріжджового екстракту плюс 2905 пептону). Розробку стійких трансформантів, наприклад, 1400 (І МН-5Т) (Фігура 7), здатних до ефективного зброджування ксилози після

Культивування у неселективному живильному середовищі впродовж, по суті, необмеженої кількості генерацій, було значно полегшено відкриттям того, що багато дріжджів, зокрема, дріжджі роду Засспаготусев, природно потребують присутності джерела вуглецю, наприклад, ксилози або глюкози, для росту навіть у збагаченому живильному середовищі, як показано на Фігурі 8.

У широкому аспекті, цей винахід також надає спосіб інтегрування численних копій екзогенної ДНК до сч ов повторюваної хромосомної ДНК згаданих клітин. Згаданий спосіб включає (а) трансформацію згаданих клітин реплікаційною та інтеграційною плазмідою, яка має екзогенну ДНК, яка включає селекційний маркер. Згаданий і) спосіб також включає (Б) реплікацію згаданих клітин з етапу (а) для одержання ряду генерацій клітин-попередників з відбиранням клітин, які включають селекційний маркер з метою стимулювання затримки реплікаційної та інтеграційної плазміди у наступних генераціях клітин-попередників та утворення о

Зо Клітин-попередників, які мають численні інтегровані копії екзогенної ДНК. У специфічному варіанті застосування, згаданий спосіб включає (ї) трансформацію дріжджових клітин реплікаційною плазмідою, яка має Ме екзогенну ДНК, яка включає селекційний маркер, причому згадана екзогенна ДНК фланкується з кожного кінця Ге послідовністю ДНК, гомологічною повторюваній послідовності ДНК хазяїна; (ії) повторну реплікацію згаданих трансформованих дріжджових клітин з етапу (ї) для одержання ряду генерацій клітин-попередників з ісе) відбиранням клітин, які включають селекційний маркер, з метою стимулювання затримки реплікаційної плазміди ї- у наступних генераціях клітин-попередників та одержання клітин-попередників, які мають численні інтегровані копії екзогенної ДНК; та (ії) реплікацію клітин-попередників з етапу (її) для одержання ряду генерацій клітин-попередників за відсутності відбору клітин, які включають селекційний маркер для стимулювання втрати плазмід наступними генераціями клітин-попередників та виділення дріжджових клітин, кожна з яких включає « численні копії екзогенної ДНК, інтегровані до її хромосомної ДНК. з с За ще іншим варіантом втілення, цей винахід надає дріжджі, які зброджують ксилозу у етанол, причому . згадані дріжджі мають численні копії екзогенної ДНК, інтегровані до їх хромосомної ДНК. Екзогенна ДНК включає а гени, які кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, злиті з промоторами, які не пригнічують глюкозу, де згадані дріжджі одночасно зброджують глюкозу та ксилозу у етанол та, по суті, зберігають свою здатність до зброджування ксилози у етанол впродовж, як мінімум, 20 генерацій, навіть у -І випадку культивування за неселективних умов.

Інший аспект цього винаходу має відношення до способів зброджування ксилози у етанол, які включають

Ме. зброджування ксилозовміщувальних середовищ за допомогою дріжджів за цим винаходом.

Ге» Інший варіант втілення цього винаходу надає плазмідний вектор для інтегрування послідовності екзогенної

ДНК, яка включає селекційний маркер, до хромосомної ДНК дріжджової клітини-мішені. До складу плазмідного ік вектору за цим винаходом входить функціональний сайт ініціювання реплікації ДНК дріжджів та екзогенна ДНК, о яка включає селекційний маркер, фланкований на кожному кінці ДНК-фланкувальною послідовністю, яка є гомологічною повторюваній послідовності рибосомної ДНК дріжджової клітини-мішені. Згадана плазміда додатково включає другий селекційний маркер у позиції, яка відрізняється від позиції між ДНК-фланкувальними

Б ПпОоСсліДОВНОСТЯМИ.

За іншим додатковим варіантом втілення, цей винахід надає плазмідний вектор для інтегрування

Ф) послідовності екзогенної ДНК до дріжджів з метою утворення стійких інтегрантів, які зброджують ксилозу у ка етанол. Згаданий вектор включає функціональний сайт ініціювання реплікації ДНК дріжджів та екзогенну ДНК, яка включає гени, які кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, фланковані з кожного во кінця ДНК-фланкувальною послідовністю, гомологічною повторюваній послідовності ДНК дріжджової клітини-мішені.

За іншим додатковим аспектом, цей винахід надає спосіб одержання клітин, які мають численні інтегровані копії фрагменту екзогенної ДНК. Спосіб за цим винаходом включає реплікацію клітин, які мають повторювану геномну ДНК та до складу яких входить реплікаційна та інтеграційна плазміда, яка включає екзогенну ДНК, для 65 одержання численних генерацій клітин-попередників з відбором клітин, до складу яких входить селекційний маркер з метою стимулювання затримки реплікаційної та інтеграційної плазміди у наступних генераціях клітин-попередників та одержання клітин-попередників, які мають численні інтегровані копії екзогенної ДНК.

Цей винахід надає дріжджі, до складу яких входять стійкі клоновані гени, які надають можливість їх використання за неселективних умов (наприклад, у безперервних процесах зброджування) для комбінованого зброджування ксилоли та глюкози у етанол без втрати ними здатності до зброджування ксилози. На додаток до цього, цей винахід надає способи та матеріали для одержання стійких мультикопійних інтегрантів дріжджових та інших клітин, які є легкими до здійснення і які можуть бути контрольованими для модулювання кількості копій інтегрованої екзогенної ДНК. Додаткові варіанти втілення, характерні особливості та переваги цього винаходу будуть очевидними з наведеного дачі опису та пунктів формули винаходу, яка додається. 70 На Фігурі 1 показано рестрикційну карту згаданих плазмід рі МНЗ1, -32, -33 та 34, та клонованих у них генів.

На Фігурі 2 показано, що дріжджовий трансформант 1400 (рі МНЗ2) (скорочено, І МНЗ2) може ефективно комбіновано зброджувати глюкозу та ксилозу. Умови, застосовані для культивування дріжджів та для зброджування цукрів є подібними до умов, опис яких наведено у Прикладі 7.

На Фігурі З показано, що дріжджовий трансформант 1400 (рі МНЗ3) (скорочено, І МНЗЗ3) може ефективно 7/5 Комбіновано зброджувати глюкозу та ксилозу. Умови, застосовані для культивування дріжджів та для зброджування цукрів є подібними до умов, опис яких наведено у Прикладі 7.

На Фігурі 4 показано, що батьківський дріжджовий гібридний штам 1400 може зброджувати глюкозу і не може зброджувати ксилозу. Умови, застосовані для культивування дріжджів та для зброджування цукрів є подібними до умов, опис яких наведено у Прикладі 7.

Фігура 5 демонструє, що дріжджовий трансформант 1400 (рі МНЗ2) (скорочено, І! МНЗ2) з його генами до метаболізування ксилози, клонованими у реплікаційній плазміді ріМНЗ2, є нестійким у неселективному живильному середовищі. Після культивування впродовж 20 генерацій у неселективному (наприклад, глюкозі) живильному середовищі, 1400 (рі МНЗ2) втрачає свою здатність до зброджування ксилози.

Фігура 6 демонструє, що дріжджовий трансформант 1400 (рі МНЗ3) (скорочено, І МНЗЗ3) з його генами до сч метаболізування ксилози, клонованими у реплікаційній плазміді ріМНЗЗ, є нестійким у неселективному живильному середовищі. Після культивування впродовж 20 генерацій у неселективному живильному і) середовищі, (наприклад, глюкозному живильному середовищі), 1400 (рі МНЗЗ) втрачає свою здатність до зброджування ксилози.

На Фігурі 7 показано, що дріжджовий трансформант 1400 (ІМН-5Т) (скорочено, | МН-ЗТ) може стійко о зо Підтримувати свою здатність до зброджування ксилози навіть після культивування у неселективному живильному середовищі впродовж більше ніж 40 генерацій. Ме

Фігура 8 демонструє, що 5. сегемівіае та інші дріжджі роду Засспаготусез потребують джерела вуглецю для Ге росту навіть у тому разі, коли у живильному середовищі є присутніми збагачені живильні середовища, наприклад, дріжджовий екстракт та пептон. Ці експерименти показали, наприклад, що 5. сегемізіде неспроможні ісе) були рости у живильному середовищі МЕР, до складу якого входить 195 дріжджового екстракту та 295 пептону, М однак, виявились здатними до росту після того, як до живильного середовища УЕР було додано глюкозу та ксилулозу.

На Фігурі 9А показано рестрикційну карту рі МН-5Т та клоновані у ньому гени.

На Фігурі 98 показано генетичну карту (порядок та орієнтацію) генів (55 рДНК, КК, АК та КО), клонованих у « ргМН-5Т. Олігонуклеотиди (наприклад, олігонуклеотид 25, олігонуклеотид 26 і т.п.), які знаходяться вище та з с нижче генетичної карти, є праймерами, які було використано для визначення поряди та орієнтації клонованих генів за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСК). ;» Фігура 10 є схематичною діаграмою, на якій зображено конструкцію плазміди рВішйезсгірі ІІ К5(-), до складу якої входять клоновані гени ХК, ХО, ХК: було сконструйовано чотири такі плазміди. Фрагмент КК-АК-КО, клонований у рк5(-)-КК-АК-КО-3 було обрано до клонування у рОСКт-рдНК (55)-АК5 для конструювання -І руиСКт-рдДНК (55) (ККО)-АКЗ5, який було позначено також, як рі МН-5Т.

На Фігурі 11 показано, що дріжджовий трансформант 1400 (І МН-5Т) (скорочено, І МН-5Т), який перевищує

Ме, 1400 (ріМмН 32) та 1400 (ріМнН 33), може ефективно комбіновано зброджувати глюкозу та ксилозу. Умови, б застосовані для культивування дріжджів та для зброджування цукрів є подібними умовам, опис яких наведено у

Прикладі 7. ік На Фігурі 12 показано гени, клоновані у плазміді з широким колом хазяїв га рестрикційну карту згаданої о плазміди з широким колом хазяїв для виділення фрагментів ДНК, до складу яких входить АКБ, з хромосомної

ДНК 5. сегемізіае та інших дріжджів.

З метою поліпшення розуміння принципів цього винаходу, у подальшому буде робитись посилання на певні ов переважні варіанти його втілення та для їх опису буде використано специфічну мову. Незважаючи на це, слід розуміти, що це не призначено до будь-якого обмеження обсягу цього винаходу, оскільки цим винаходом

Ф) передбачаються такі зміни, додаткові модифікації та застосування принципів цього винаходу, які були б ка очевидними фахівцю у галузі техніки, до якої належить цей винахід.

Як згадувалось перед тим, за одним з переважних аспектів, цей винахід надає рекомбінантні дріжджі, до бо складу яких входять стійко клоновані ХК, ХО та ХК гени, які представляють поліпшення у порівнянні до попередніх рекомбінантних дріжджів. Взагалі, повідомлялось про рекомбінантні дріжджі, які можуть ефективно комбіновано зброджувати глюкозу та ксилозу, що присутні у тому ж самому живильному середовищі (Го та Цао, 1995). Дріжджі за цим винаходом було одержано шляхом клонування відповідно до модифікованих ХК, ХО та ХК генів на мультикопійній плазміді, РОСКти!0, з наступним використанням утвореної плазміди, рі МНЗХ (Х-від 1 до 65 4) (Фігура 1), для трансформування придатних природних дріжджів. Наприклад, плазміди рі МНЗ2 та рі МНЗЗ було використано для трансформування гібридних дріжджів від 1400 до 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3),

відповідно. Ці рекомбінантні дріжджі роду Засспаготусез можуть ефективно комбіновано зброджувати як глюкозу, так і ксилозу, що присутні у тому ж самому живильному середовищі, у етанол, яК показано на Фігурах 2 та 3, у той час, як батьківські дріжджі 1400, які не було піддано обробці методами генетичної інженерії,

Можуть зброджувати лише глюкозу і не здатні до комбінованого зброджування глюкози та ксилози (Фігура 4).

Плазмідопосередковані рекомбінантні дріжджі можуть підтримувати клоновані гени у присутності селекційного тиску і не здатні до цього за його відсутності. Як показано на Фігурах 5 та 6, 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі чНЗ3), врешті-решт, втрачають свої плазміди та здатність до зброджування ксилози після тривалого культивування за відсутності селекційного тиску. 70 Вкрай бажано, щоб рекомбінантні технічні дріжджі, зокрема ті штами, які використовуються для одержання великих об'ємів технічних продуктів, наприклад, етанолу, були стійкими без запотребування присутності селекційного тиску. Розробка рекомбінантних дріжджів, до складу яких входять інтегровані ХК, ХО та ХК гени, як, наприклад, у цьому винаході, забезпечує таку стійкість. На додаток до цього, для того, щоб одержані рекомбінантні дріжджі мали здатність до комбінованого зброджування глюкози та ксилози з ефективністю, яка є подібною до або перевершує ефективність 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), до складу згаданих рекомбінантних дріжджів повинні входити не тільки інтегровані гени до метаболізування ксилози, але і численні копії таких інтегрованих генів. За переважними аспектами цього винаходу, мультикопійні (псп) інтегранти дріжджів (тобто дріжджі, які мають, як мінімум, приблизно, 10 інтегрованих копій екзогенної ДНК) було одержано шляхом визначення некодувальної ділянки, наприклад, некодувальної ділянки 55 рибосомної ДНК (рДНК), ділянкою для МНножинної інтеграції. рРДНК надає переважне місце для інтегрування, оскільки вона є висококонсервативною, а дріжджі, взагалі, включають більше 100 копій повторних послідовностей рДНК. Слід розуміти, однак, що для одержання дріжджів за цим винаходом, зовсім не обов'язково здійснювати інтегрування необхідних генів у кожному випадку повторної або повторюваної послідовності. У відповідності до широких аспектів цього винаходу, достатнім виявиться сч здійснення такої інтеграції на кожній з множинних ділянок повторюваної послідовності, тобто на двох або більше ділянках. (8)

З метою інтегрування йсп ХК, ХО та ХК до дріжджової хромосоми на ділянці 55 рДНК, було сконструйовано інтеграційну плазміду рі МН-5Т, як показано на Фігурі 9. рі МН-5Т є "човниковим" вектором на основі дріжджів -

Е. соїї та похідною плазміди рОоСКт 6 (Го та інші, 1984). Послідовність 55 рДНК було вставлено до сайту о зо рестрикції Хпої роСКт 6. Послідовність 55 РДНК було скопійовано з дріжджової хромосомної ДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції та модифіковано засобами сайт-специфічного мутагенезу для додання сайту Ме рестрикції ХпоЇ до її центральної (приблизно) послідовності, як показано на Фігурі 9. Фрагмент Хо! з Ге ркБ(-)-кК-АК-КО (Фігура 10) (Го ма Цао, 1995) було вставлено до сайту Хпої! 55 рДНК, клонованого у рі МН-5Т. рі МН-5Т відрізняється від інших традиційних йсп дріжджових інтеграційних векторів на основі 55 рДНК тим, ісе) з5 ЩО дО його складу входить також функціональна дріжджова автономна реплікаційна послідовність (АК) (Струл ї- та інші, 1979; Стінчкомб та інші, 1980; Чен та Тай, 1980), як показано на Фігурі 9. Таким чином, рі МН-5Т є одночасно реплікаційним та інтеграційним вектором. Специфічним чином, під час одержання рекомбінантних дріжджів, до складу яких входить велика кількість копій ХК, ХО та ХК, рі МН-5Т функціонує спочатку, як реплікаційний вектор, потім як інтеграційний вектор. Згаданий фрагмент АК5 було вставлено до сайту Есок!1 « 70 рОСКт 6. На додаток до цього, до складу рі МН-ЗТ входить також ген стійкості до канаміцину (Кт В) тасген Ша с стійкості до ампіциліну (Ар). Кт" функціонує у дріжджах, як ген стійкості до генетицину і передасть ч» стійкість до генетицину дріжджовим трансформантам. Сайт Хо! Кт" було видалено за допомогою " полімеразно-ланцюгової реакції без впливу на його активність. Як Кт", такі Ар" є складовими вихідної плазміни роСКт 6.

Як зазначалось раніше, вектори, опис яких наведено перед тим, відрізняються від векторів, які було ш- використано у способах відомого рівня техніки тим, що до їх складу входить автономна реплікаційна

Ге» послідовність (АК5). На додаток до цього, у попередніх способах одержання псп дріжджових інтегрантів, інтеграція клонованих генів відбувалась миттєво, у той момент, коли згадані дріжджові клітини трансформуються

Ме. екзогенними генами. У протилежність цьому, у відповідності до переважних способів за цим винаходом, со 20 інтеграція клонованих генів продовжує відбуватись поступово, ще довго піст я того, як було завершено трансформацію. Зокрема, трансформація спочатку відбувається завдяки присутності реплікаційної плазміди, ме, наприклад, рі МН-5Т, у трансформованих дріжджових клітинах і інтеграція відбувається лише поступово шляхом повторної реплікації трансформантів на планшетах з селективним живильним середовищем.

Таким чином, цей винахід має відношення до застосування наведених далі процедур для одержання 22 дріжджів або інших клітинних трансформантів, до складу яких входить псп інтегрований клонований ген(-и).

ГФ) Клітини-хазяї, до складу яких входять повторювані послідовності ДНК, наприклад, дріжджі або еукаріотичні клітини, трансформуються реплікаційною/інтеграційною плазмідою, наприклад, ріМН-5Т, і відбираються де трансформанти, до складу яких входять мультикопійні реплікаційні/нтеграційні плазміди. Одержані відібрані трансформанти повторно реплікуються на планшетах зі свіжим селективним живильним середовищем і 60 вирощуються до високого рівня густини клітки впродовж достатньої кількості разів для інтегрування необхідної кількості копій екзогенної ДНК з наступним культивуванням трансформантів у неселективному живильному середовищі впродовж достатньої кількості генерацій для видалення реплікаційних/інтеграційних плазмід зі згаданих трансформантів. Після цього одержані трансформанти можуть культивуватись у селективному живильному середовищі і трансформантами, які збережуть здатність до ефективного росту у селективному бо живильному середовищі, виявляться ті з них, які будуть включали численні копії необхідних екзогенних генів,

інтегрованих до хромосоми дріжджів або інших клітин-хазяїв. Наприклад, дріжджовий гібрид 1400 було трансформовано за допомогою рі МН-5Т у відповідності до процедур, наведених перед тим, і одержані стійкі рекомбінантні дріжджі, 1400 (І МН-5Т), можуть комбіновано зброджувати як глюкозу, так і ксилозу краще, аніж 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), як показано на Фігурі 11. Важливо те, що новоутворені стійкі рекомбінантні дріжджі, 1400 (І МН-5Т), все ще зберігають здатність до зброджування як глюкози, так і ксилози з рівною ефективністю піа/я культивування у неселективному живильному середовищі впродовж 4, 20 та 40 генерацій, як показано на Фігурі 7, у той час, як 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3) утратять більшу частину активності до зброджування ксилози після культивування у неселективному живильному середовищі впродовж 20 генерацій 70 «Фігури 5 та 6). На додаток до цього, 1400 (ІМН-5Т) у подальшому культивували у неселективному живильному середовищі впродовж декількох сотень генерацій і він все так же зберігав повну активність до комбінованого зброджування як глюкози, так і ксилози.

У переважних способах одержання стійких псп о інтегрантів, для відбору та опідтримки як плазмід-опосередкованої активності, так і активності, забезпеченої інтегрованими генами, за допомогою того ж /5 бамого селективного живильного середовища, використовують загальний(-ї) селекційний(-ї) маркер(-и). У цій роботі загальними селекційними маркерами є три клоновані гени до метаболізації ксилози, ХК, ХО та ХК, у той час, як загальним селективним живильним середовищем є збагачене або мінімальне живильне середовище (для дріжджів), до складу якого входить ксилоза. На додаток до цього, згадані клоновані гени виконують роль селекційних маркерів у збагаченому живильному середовищі для більшості дріжджів роду Засспаготусез, оскільки заявники показали, що більшість дріжджів роду Засспаготусез потребує присутності джерела вуглецю, наприклад, ксилози, для росту навіть у збагаченому живильному середовищі (Фігура 8). Незважаючи на те, що необхідність у присутності джерела вуглецю у збагаченому живильному середовищі для росту не є критичною для дріжджів, які було обрано хазяями, все ж, незважаючи на це, набагато зручніше мати можливість здійснення відбору необхідних інтегрантів на планшетах зі збагаченим живильним середовищем з ксилозою, аніж на с ов планшетах з мінімальним живильним середовищем з ксилозою. Переважні хазяї для трансформування у цьому винаході належать до видів Засспаготусев, оскільки вони, як правило, є надзвичайно ефективними відносно (8) зброджування глюкози. У разі, якщо виявиться, що види дріжджів, необхідні для використання у ролі хазяїв для інтегрування великої кількості копій генів, які метаболізують ксилозу, не потребують присутності джерела вуглецю для росту у збагаченому живильному середовищі, за допомогою традиційних способів можна буде о зо Виділити придатний мутант цього виду, який буде потребувати джерела вуглецю у збагаченому живильному середовищі. Ме

Бажано також, щоб до складу реплікаційної/інтеграційної плазміди, наприклад, рі МН-ЗТ, призначеної для Ге забезпечення Псп о інтеграції входив другий селекційний засіб для відбору реплікаційних плазмід-опосередкованих трансформантів. У разі рі МН-5Т, другий селекційний механізм у ролі селектованого ісе) маркеру використовує як Кт КЕ. так і Ар, Незважаючи на те, що належність другої селекційної системи для - реплікаційного/Іінтеграційного вектору не є критичною, це забезпечить більш переважні вектори, зокрема, якщо вектор на основі автономної реплікаційної послідовності не є достатньо стійким навіть у присутності селекційного тиску, а трансформанти мають схильність до втрати більшості своїх плазмід до того, як буде « інтегрована достатня кількість копій необхідних генів. У разі застосування векторів, до складу яких входить другий селекційний механізм, згадані трансформанти можуть культивуватись у присутності другого селекційного с реактиву для підвищення кількості копій плазмід або для поновного трансформування згаданих трансформантів й за допомогою того ж самого вектору, але з застосуванням другого селекційного механізму для поновного відбору "» згаданих трансформантів таким чином, щоб процес інтеграції зміг бути продовженим або поновно ініційованим.

Застосування Кт " та Арг" у ролі другої селекційної системи є необхідним для одержання дріжджів, які, на думку заявників, є переважними. Кт У може бути домінантним селекційним маркером для трансформування -і дріжджів, які є стійкими до генетицину, однак деякі дріжджі є природно стійкими до генетицину без прийняття

Ге» до свого складу плазміди, яка включає Кт К, Внаслідок цього, Кт" сам по собі не є переважним селекційним маркером для відбору дріжджових трансформантів. З іншого боку, Ар ХУ може ефективно експресуватись б більшістю дріжджів, однак він, як правило, не може бути використаним у ролі домінантного селекційного маркеру (се) 50 для трансформування дріжджів, оскільки більшість дріжджів є природно стійкою до ампіциліну. Однак, Кт АК та о Арк разом є надзвичайно доброю домінантною селекційною системою для більшості дріжджів, зокрема, для дріжджів роду Засспаготусевз. Для застосування такої селекційної системи, згадані трансформанти спочатку відбираються на планшетах з МЕРО (195 дріжджового екстракту, 295 пептону, 295 глюкози) та відповідними концентраціями генетицину (20-8Омкг/мл, у залежності від виду). Одержані трансформанти перевіряються на експресію Ар" за допомогою пеніциліназної проби (Шевальє (Спемаїєг) та Егл (Аїідіє), 1979) для

Ф) ідентифікування справжніх трансформантів. ко Наявність Ар " у рі МН-5Т (Фігура 9) та споріднених реплікаційних/інтеграційних плазмідах, виконує також іншу функцію. Оскільки Ар" є присутнім тільки у реплікаційній плазміді і його немає на згаданому фрагменті, бо інтегрованому до дріжджової хромосоми, згадана ампіцилінова проба використовується також, як традиційний процес для ідентифікування тих трансформантів, до складу яких входять псп інтегровані клоновані гени, а не вектори на основі плазмід.

Особливою рисою підходу за цим винаходом для одержання стійких рекомбінантних дріжджів, до складу яких входить псп інтегрований ген(-и), є те, що кількість копій гену(-ів), призначених для інтегрування, може бути б5 легко контрольованою. Наприклад, до хромосоми дріжджового гібриду 1400 можна вставити більшу кількість копій ХК-ХО-ХК генів, якщо до фрагменту 55 рДНК (або цільової послідовності) вставлено інший селекційний маркер, наприклад, Кт", На додаток до цього, способи одержання псп дріжджових інтегрантів за цим винаходом також є легшими до здійснення, у порівнянні до інших відомих підходів, під час здійснення яких, перш ніж буде одержано стійкий штам, може виникнути потреба у коректуванні та контролюванні експериментальних умов та повторному здійсненні процесу трансформування.

Таким чином, заявники поліпшили стійкість попередніх рекомбінантних ксилозозброджувальних дріжджів, наприклад, 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗЗ3) і створили переважно стійкі рекомбінантні дріжджі, наприклад, 1400 (ГМН-5Т), які не потребують присутності селекційного тиску для підтримки клонованих генів і є настільки ж ефективними або навіть більш ефективними віднось комбінованого зброджування глюкози та ксилози, аніж 1400 70. (рРІМНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3). На додаток до цього, згадані заявники також розробили придатній спосіб, який забезпечує легку йсп інтеграцію екзогенного гену(-ів) до клітинної хромосоми, де кількість копій гену(-ів), призначена для інтегрування, також легко піддається контролюванню.

Подібно до 1400 (ріМНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), переважні стійкі ксилозозброджувальні дріжджі за цим винаходом, створені методами генної інженерії, також можуть ефективно комбіновано зброджувати глюкозу та 75 Ксилозу. Це відбувається завдяки тому, що ХК, ХО та ХК гени, вставлені до хромосоми нових дріжджів-хазяїв, виявляються злитими з інтактними 5' некодувальними послідовностями генів, які можуть бути ефективно експресованими у дріжджах, кодують продукування високих рівнів ферментів і, крім того, їх не пригнічує присутність глюкози у живильному середовищі. Наприклад, інтактні 5 некодувальні послідовності ДНК, які вміщують усі генетичні елементи для ефективного експресування гліколітичних генів та для продукування високих рівнів гліколітичних ферментів, є придатними, як замісники інтактних 5 некодувальних послідовностей

ХЕ, ХО та ХК для згаданих цілей.

ХК, ХО та ХК, клоновані на ріМН-5Т, походять від Ріспіа віїрйв (ХК та ХО) та від Засспаготусевз сегемізіде (ХК). Однак, вони можуть походити від будь-яких мікроорганізмів, доки є здатними до продукування високих рівнів відповідних ферментів після злиття з відповідними 5' некодувальними послідовностями, до складу Га яких входять ефективні промотори, рибосомо-зв'язувальні ділянки і т.ін. Відомо, наприклад, що три згадані гени зустрічаються у різноманітних мікроорганізмах; було ідентифіковано та ізольовано численні ХК, ХО та ХК і9) гени. Таким чином, конкретне джерело цих генів не є критичним для широких аспектів цього винаходу; придатними, скоріше, виявляться будь-які ДНК, які кодують білки (ферменти), які мають ксилозредуктазну активність (здатність до перетворення О-ксилози на ксилітол з застосуванням МАОРН ав! (нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату (відновленої форми)) та/або МАН (відновленого нікотинамід-аденін-динуклеотиду) у ролі кофактору), ксилітолдегідрогеназну активність (здатність до о перетворення ксилітолу на ЮО-ксилулозу з застосуванням МАО " (нікотинамід-аденін-нуклеотиду (окисненої «(о форми)) тал"або МАОР" (нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату (окисненої форми)) у ролі кофактору) або «со ксилулокіназну активність (здатність до перетворення ЮО-ксилулози на Ю-ксилулозо-5-фосфат). Ці гени можуть бути одержаними, як природні гени або можуть бути модифікованими, наприклад, доданням, заміщенням або і - делецією основ природного гену, доти, доки закодовані білки все ще мають ХК, ХО або ХК активність. Подібним же чином, згадані гени або їх частини можуть бути створені методами синтезу за відомими способами і, знову таки, доти, доки одержана ДНК кодує білок, який демонструє необхідну ХК, ХО або ХК активність. «

Як приклади, до придатних джерел ХК та ХО генів належать дріжджі, я «і утилізують ксилозу, наприклад, Сапаїда зпепайає, Ріспіа звірів, Распузоїеп (аппорпій5, до придатних джерел ХК генів належать згадані - с перед тим дріжджі, які утилізують ксилозу, а також дріжджі, які ксилозу не утилізують, наприклад, з роду ч» зЗасспаготусев, наприклад, 5. сегемізіае, з роду 5спігозасспаготусев, наприклад, Зспігозасспаготусевз ротрбе, " та бактерії, наприклад, ЕзсПегіспіа соїї, виду Васіїй5, виду Зігеріотусез і т.п. Необхідні гени можуть буї и одержані з цих джерел за допомогою традиційних способів. З цією метою, наприклад, можуть бути застосовані гібридизація, комплементація або полімеразно-ланцюгова реакція. - Для застосування у цьому винаході придатними можуть виявитись різноманітні промотори. У широкому б розумінні, будуть застосовані промотори, сумісні з дріжджами та здатні до контролювання транскрипції ХК, ХО або ХК генів. Такі промотори є доступними з численних відомих джерел, у тому числі, дріжджів, бактерій та б» інших клітинних джерел. У переважному варіанті, промотори, які застосовуються у цьому винаході, повинні бути о 50 ефективними промоторами, які не пригнічують глюкози и не потребують ксилози дія індукування. У цьому відношенні, "ефективні" промотори, які повинні застосовуватись у цьому винаході, відносяться до 5 (зе) фланкувальної послідовності, яка забезпечує високий рівень експресії злитого гену. Промотори з такими характеристиками також є широкодоступними, і у межах можливостей пересічного фахівця буде знаходитись не тільки їх застосування у цьому винаході, приймаючи до уваги наведений опис, але також і злиття згаданих 22 промоторів з ХК, ХО та ХК генами, клонування продуктів злиття промотору/гену у відповідних векторах та

Ге! використання згаданих векторів для трансформування дріжджів. Усі ці маніпуляції можуть бути здійснені за допомогою традиційних методів генної інженерії, добре відомих у цій галузі та літературі. ко Сайт ініціювання реплікації ДНК дріжджів, наприклад, автономна реплікаційна послідовність, до складу якої входить фрагмент ДНК, може бути одержаним з хромосомної ДНК дріжджів або з хромосомної ДНК інших 60 мікроорганізмів, доки фрагмент ДНК може функціонувати, як активний сайт ініціювання реплікації для підтримки автономної реплікації плазміди у хазяїні, якого було обрано для Псп інтеграції. Фрагменти ДНК, які функціонують, як автономні реплікаційні послідовності, можуть бути легко виділеними шляхом включення довільно розщеплених фрагментів ДНК до плазміди на основі Е. соїї з наступним трансформуванням необхідного мікроорганізму-хазяїна, наприклад, дріжджів роду Засспаготусевз, за допомогою одержаного банку плазмід, і к 65 повідомлялось у літературі (Стінчкомб та інші, 1980; Го та інші, 1984).

Для одержання стійких штамів за цим винаходом було використано нові способи. Незважаючи на це, існують деякі дані, які свідчать про те, що клоновані гени знаходяться не на реплікаційній плазміді, а були інтегровані до геному хазяїна. Наприклад, хромосомна ДНК, виділена з 1400 (І МН-5Т), може бути використана, як матриця для виділення клонованих генів, у тому чисті і, гібридів, до складу яких входить як 55 рДНК, так і клоновані послідовності генів, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РСК). Крім того, у той час, як з 1400 (І МН-5Т) шляхом трансформування Е. соїї (Уорд (У/ага), 1990) може бути виділено декілька плазмід (рігМн-5Т), з 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), за тих же самих умов, може бути виділено сотні плазмід рі МНЗ32 або рі МНЗ3, відповідно. На додаток до цього, вихідні трансформанти дріжджового гібриду 1400, до складу яких входить велика кількість копій реплікаційної плазміди ріМнН-ЗТ, є нестійкими (відносно їх здатності до 70 зброджування ксилози), однак, позитивними за пеніциліназною (фермент, який кодується Ар") пробою (Шевальє та Егл, 1979). У протилежність цьому, кінцеві стійкі трансформанти, 1400 (ІМН-5Т), які зберігають свою здатність до зброджування ксилози за відсутності селекційного тиску, виявляються негативними за пеніциліназною пробою. Це очікується, якщо екзогенна ДНК інтегрується на ділянці 55 рДНК, оскільки Ар "Р не є частиною фрагменту ДНК, призначеного для інтегрування до хромосоми хазяїна. Можливо також, що до складу 75 деяких стійких дріжджових трансформантів можуть входити екзогенні гени, інтегровані на ділянках автономних реплікаційних послідовностей згаданої дріжджової хромосоми.

Для полегшення додаткового розуміння цього винаходу, його особливостей та переваг, далі наведено

Приклади. Слід розуміти, однак, що ці Приклади є ілюстративними і не обмежують обсягу цього винаходу.

Приклад 1

Синтезування фрагменту 55 рДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції

Для синтезування фрагменту 55 рДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (з метою використання у ролі послідовності дріжджової ДНК для спрямування мультикопійної інтеграції до дріжджової хромосоми), наступні олігонуклеотиди було синтезовано і використано, як праймери для полімеразно-ланцюгових реакцій, відповідно до опублікованої послідовності 55 рДНК. (Валензуело та інші, 1977). На додаток до послідовності 55 Ге! рРДНК, додаткові нуклеотиди, які визначають сайт рестрикції за! І, були також додані до 5' кінця праймерів для о полегшення клонування синтезованої за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції 55 рДдНК у плазміді на основі Е. сої.

Олігонуклеотид І: ТТАСТСОАССТСССТССАААТОТААААТО С. о

Фо

Олігонуклеотид ІЇ: ААТОТСОСАССТАСААСАСАСССАААТОССАС. о

Хромосомну ДНК, виділену з дріжджового гібриду 1400 було використано, як матрицю для полімеразно-ланцюгової реакції. РСК-синтезований фрагмент 55 рДдНК було спочатку клоновано у плазміді і-й з5 рВІіцезсгірі ПІ К(-) на основі Е. соїї (компанія Зігаїадепе Сіопіпд Зувіетв, Ла-Джолла, Каліфорнія) на сайті ч- заї!І. Одержану плазміду було позначено, як ркК8-рДНК(55).

Приклад 2

Вставка сайту Хпо! до клонованої послідовності 55 РДНК «

Послідовність нуклеотидів між -29 та -56 послідовністю 55 рДНК (Валензуєла та інші, 1977) було

Модифіковано олігонуклеотид-опосерсдкованим сайт-специфічним мутагенезом (Кункель (Кипкеї!), 1985; Кункель -йд с та інші, 1987). Як наслідок, сайт рестрикції ХпоЇ було вставлено до специфічного сайту, який було описано ц перед тим. Для здійснення цього завдання дотримувались протоколу, наданого компанією Віо-Кавй І арогайогієв, "» Іпс. Для олігонуклеотид-опосередкованого сайт-специфічного мутагенезу, за виключенням того, по замість плазмід рТ718) або рТ719) було використано плазміду рК5. Одержану плазміду, до складу якої входила 55

РДНК, було позначено, як рК5-55 рДНК (Хпої). Для здійснення сайт-специфічного мутагенезу було використаю -І наступний олігонуклеотид: б Приклад З (Се) 20 Виділення фрагментів ДНК з ДНК 5. сегемізеае або інших ДНК, які функціонують у дріжджах, як автономна реплікаційна послідовність с ДНК 5. сегемізіае (або ДНК інших дріжджів або інших мікроорганізмів) розщеплювали рестриктазою ЗаизА та клонували на сайті Ват НІ роСКтєб (Фігура 12) (Го та інші, 1984). Одержаний банк плазмід використовували для трансформування 5. сегемізідае. Відбирались трансформанти, здатні до росту на планшетах з МЕРО (195 99 дріжджового екстракту, 296 пептону та 295 глюкози) та БОмкг/мл генетицину і які були позитивними за

ГФ) пеніциліназною пробою (Шевальє та Егл, 1979). Плазміди з відібраних справжніх трансформантів виділяли за юю допомогою процедури, подібної до описаної Уордом (1990).

До складу усіх фрагментів ДНК дріжджів, вставлених до руСКтб (Фігура 12) та виділених з дріжджових трансформантів, повинен входити сегмент ДНК, який може функціонувати, як АКЗ (автономна реплікаційна 60 послідовність) у 5. сегемівіде, можливо, також у інших дріжджах. Згадані вставки ДНК розщеплювали різними рестриктазами і одержані фрагменти ДНК поновно вставляли до руСКтб. Останні згадані плазміди використовували для ретрансформування 5. сегемізіае. Будь-який рестрикційний фрагмент відповідного розміру, завдяки якому рОСКтб буде ефективно функціонувати, як дріжджова плазміда, повинен включати ефективну "АК5" і може використовуватись для конструювання реплікаційно/інтеграційних векторів, наприклад, рі МН-5Т, бо для мультикопійної інтеграції екзогенного гену(-ів) до хромосом З. сегемізіде. Згадані рестрикційні фрагменти, можливо, функціонують також, як автономні реплікаційні послідовності у інших дріжджах і є придатними для конструювання реплікаційних/інтеграційних плазмід для інших дріжджів.

Приклад 4

Видалення сайту рестрикції Хію! з гену стійкості до генетицину (канаміцину), Кт "

Ген стійкості до генетицину (канаміцину), Кт", з Тп 903 (А. Ока (А. Ока) та інші, 1981) та фрагмент 55 рРДНК, опис якого наведено у Прикладі 1, є складовими плазміди, утвореної для інтегрування численних копій екзогенних генів до дріжджової хромосоми. Однак, кодувальна послідовність Кт" включає сайт Хпої. Це суперечить тому факту, що сайт ХпоЇ за допомогою методів генної інженерії було вставлено до центру 70 клонованої послідовності 55 рДНК для використання з метою введення екзогенних генів, наприклад, ХК, ХО та

ХК до плазміди для інтегрування. Таким чином, сайт ХноЇ! з Кт" необхідно видалити. Це може бути здійснено за допомогою цілого ряду різних підходів. Заявники вирішили скористатись сайт-специфічним мутагенезом шляхом перекриття подовжувального сегменту засобами полімеразно-ланцюгової реакції (С. Н. Го та інші, 1989) для видалення сайту Хпо!Ї з Кт АК без змінення його амінокислотної кодувальної послідовності та без від'ємного впливу на каталітичну активність ферменту, яка кодується згаданим геном. Згаданий ген Кт "М, клонований у руСКтєвб (Фігура 12), було перетворено до Кт -Хпо), як описувалось перед тим.

Далі наведено чотири олігонуклеотиди, які було використано для здійсненння цього завдання.

Олігонуклеотид І: ССССАОТОААТТСТСОСАОСАСТІТОСТО

Олігонуклеотид І: ТОСААТТТААТСИСООССССТАССААСАСО з» Олігонуклеотид ЩІ: ТТАССССААОСТТОССстТОИС о

Олігонуклеотид ІУ: ТТСААССОССАААСОТСТТОСТАасСаСССОа с русСКтвб (Фігура 12) є похідним рОсСе. Частину олігонуклеотиду І та олігонуклеотид І повністю синтезують су

Зо Відповідно до послідовності полілінкерної ділянки рОСе9 (Сембрук (Затьгоок) та інші, 1989).

Наслідком генетичного маніпулювання з руоСКтеб, опис якого наведено перед тим, є не тільки делеція сайту Ме рестрикції Хйо! з кодувальної ділянки Кт М, але також і вставка сайту рестрикції ХпоЇ між кодувальною «о послідовністю Кт" та сайтом Есок! рОиСКтвб. Одержану плазміду було позначено, як рОСКт (-Хної) (Хо). со

Згадане додання сайту Хпої! у прямому напрямку до кодувальної послідовності Кт У повинно полегшити вставку фрагменту 55 рДНК, опис якого наведено у Прикладі 1, до новоутвореної плазміди рОСКт (-Хпо) (Хо). в.

Приклад 5

Конструювання плазміди рі МН-5Т

Плазміду рОоСКт (-Хпо) (їХпо), опис якої наведено у Прикладі 4, було використано для конструювання « рі МН-ЗТ, показаної на Фігурі 9. Спочатку фрагмент За! І, до складу якого входить 55 рДНК (Хпої), було видалено з рК5-55 рДНК (Хпої) і вставлено до сайту ХпоїЇ роСКт (-Хпо) («Хпо). Одержану плазміду було З с позначено, як рОСКт-рДдНК (55). До останньої згаданої плазміди, до сайту Есок! рОСКт-55 рДНнК, було "» вставлено фрагмент ЕсокКіІ, до складу якого входить ефективна автономна реплікаційна послідовність, виділена " з З. сегемівіае (за процедурою, опис якої наведено у Прикладі 3), і одержану плазміду було позначено, як руОСКт-55 рДНк-АК5. До останньої згаданої плазміди, до сайту ХПоїЇ, який знаходиться у центрі клонованої послідовності 55 рДНК, були вставлені фрагмент Хпої з рК5(-)-КК-АК-КО-3, до складу якого входять клоновані і ХЕ, ХО та ХК, злитий з промотором дріжджової алкогольдегідрогенази (ХК), та промотор піруваткінази (для обох

Ф ХО та ХК). Одержану плазміду, рОСКт-рднКк (55) (КОК)-АКЗ5, яку було позначено такох, як рі МН-5Т, зображено на Фігурі 9. (2) Приклад 6 со 50 Трансформація дріжджового гібриду 1400 за допомогою рі МН-5Т ТА ВІДБІР стійких трансформантів 1400 (ЕМН-5Тт) «2 ріг МН-5Т було використано для трансформування гібридного штаму 1400 шляхом електропорації за умов, які було використано для трансформування штаму 1400 плазмідами рі МНЗ2 та рі МНЗЗ (Міжнародна публікація УУО 95/13362, 18 травня 1995 року, опублікована Міжнародна заявка МоРСТ/О5О94/12861, яку було подано 8 листопада 1994 року). Стисло, 5О0мл дріжджових клітин у початковій фазі логарифмічного росту (140-190 одиниць

ГФ! Клетта (КІО)) центрифугували для видалення живильного середовища, двічі промивали холодною водою, один раз холодним 1М сорбітом та ресуспендували у 200мкл 1М сорбіту. Шістдесят мкл клітин переносили до 4мл о попередню простерелізованої пластикової пробірки (з кришкою), до якої додатково вносили 1мкг плазмідної ДНК. 5Омкл утвореної суміші клітин та плазмід за допомогою піпетки переносили до попередньо охолодженої кювети 60 пристрою для імпульсного мічення генів з 0,2см електродним проміжком і вміст кювети піддавали імпульсній обробці за допомогою пристрою для імпульсного мічення генів з регулятором імпульсного мічення (компанія

Віокад) (2,0кВ, 25мкФ, 200Ом).

Негайно до кювети додавали 0,50мл живильного середовища УЕРО. Вміст кювети переносили до нової 4мл стерилізованої пластикової пробірки і інкубували при 302 впродовж 1 години. 10Омкл клітин висівали на чашки з бо агаром, які вміщували живильне середовище ХЕРО та 40мкг/мл 418 (генетицину). Відбирали колонії з швидким ростом і реплікували їх до іншої чашки, у якій знаходилось те ж саме живильне середовище. Відібрані колонії піддавали ампіциліновій пробі (Шевальє та Егл, 1979), доки не вдавалось ідентифікувати позитивні колонії. За основу процедури електропорації, опис якої наведено перед тим, взяли процедуру електропорації, яку було повідомлено Бекером (ВескКег) та Гваренте (спцагепіеє) (1971).

Після позитивної ідентифікації трансформанту за допомогою пеніциліназної проби, його підтримували на живильному середовищі МЕРХ (195 дріжджового екстракту, 295 пептону, 290 ксилози). На початкових етапах, трансформанти були дуже нестійкими. Вони втрачали здатність до зброджування ксилози у разі культивування у живильному середовищі МЕРО впродовж більше ніж 20 генерацій. Однак, у разі безперервного культивування /о трансформантів до стаціонарної фази на чашках з живильним середовищем УЕРХ та повторного перенесення їх до чашок зі свіжим живильним середовищем УЕРХ, згадані трансформанти поступово ставали стійкими відносно їх здатності до зброджування ксилози. Згадані трансформанти, після набуття стійкості, могли культивуватись у неселективному живильному середовищі впродовж декількох сотень або більше генерацій і все ще залишались здатними до комбінованого зброджування як глюкози, так і ксилози, як показано у Прикладі 8.

Приклад 7

Комбіноване зброджування глюкози та ксилози 1400 (І МН-5Т)

Суміш глюкози та ксилози (приблизно, 1095 глюкози та 595 ксилози) зброджували штамом 1400 (І МН-517) за умов, опис яких наведено далі. Посівні культури 1400 та 1400 (І МН-5Т) культивували за аеробних умов у рідкому живильному середовищі МЕРО до досягнення середини фази логарифмічного росту (приблизно, 400-450 2о одиниць Клетта (КО)) і зберігали при 492С. Один раз на місяць готували нові посівні культури шляхом перенесення 2мл згаданої культури до 5О0мл свіжого живильного середовища УХЕРО та культивування за умов, які було описано перед тим. 2мл посівних культур 1400 (І МН-5Т) інокулювали до 100мл живильного середовища

ЖМЕРО у ЗбОмл колбі Ерленмейєра, спорядженій боковим відгалуженням, яке забезпечувало можливість безпосереднього моніторингу росту дріжджових культур за допомогою колориметра Клетта. Згадану культуру сч 25 інкубували у шейкері при З02С та 200об/хв за аеробних умов.

Коли густота клітин досягала середини фази логарифмічного росту (400-450 КУ), до колби додатково і) вносили 20мл (5090) глюкози та 1Омл (5095) ксилози. Після ретельного перемішування з колби видаляли мл культуральної суміші з метою використання Її, як нульового зразку. Після цього згадану колбу герметизували за допомогою саранової обгортки для забезпечення анаеробного зброджування. Періодично (через кожні 6 годин) о 30 відбирали мл зразки бродильного бульйону, які використовували для визначення вмісту глюкози, ксилози, ксилітолу та гліцеролу у бульйоні під час зброджування засобами високоефективної рідинної хроматографії о (НРІ С), як описано у Прикладі 9. Результати, які наведено на Фігурі 11, демонструють, що дріжджі 1400 Ге) (ГМН-5Т), які було одержано методами генної інженерії, впродовж 30 годин можуть комбіновано збродити більшу частину з 1095 глюкози та 595 ксилози. Зброджування здійснювали за нормальних умов, які не вимагали і-й 35 застосування спеціального живильного середовища або рН; не було також потреби у вирощуванні дріжджів до /зча високого рівня густоти клітин. Таким чином, дріжджі 1400 (ІМН-5Т), які було одержано методами генної інженерії, можуть ефективно комбіновано зброджувати високі концентрації як глюкози, так і ксилози у етанол з незначною кількістю ксилітолу, який утворюється, як побічний продукт. Порівняно до рекомбінантних «

Засспаготусез 1400 (рі МНЗ2) та 1400 (рі МНЗ3), які показано на Фігурах 2 та З, 1400 (І МН-5Т) комбіновано 40 зброджують як глюкозу, так і ксилозу дещо краще, аніж двоє попередньо одержаних дріжджів. - с Приклад 8 ц Порівняння стійкого штаму 1400 (ІМН-5Т) до 1400 (ІМНЗ2) та 1400 (ІМНЗ3) відносно комбінованого "» зброджування глюкози та ксилози після культивування у неселективному живильному середовищі впродовж 4, та 40 генерацій Як описано у Прикладі 7, по 2мл кожної з посівних культур 1400 (І МН-5Т), 1400 (І МНЗ2) та 1400 (ІМНЗЗ3) інокулювали до 5боОмл МЕРО у окремих 250мл колбах Ерленмейєра, споряджених боковими -І відгалуженнями. Після культивування клітин до рівня 400-450 КИ, по 2мл свіжої культури з кожної колби переносили до нової колби. Цей процес було повторено 10 разів з 1400 (І МН-5Т) та 5 разів з 1400 (І МНЗ2) та

Ф 1400 (ІМНЗ3). Після цього культури 1400 (ІМН-5Т), культивовані впродовж 4, 20 та 40 генерацій у

Ге») неселективному живильному середовищі (кожне перенесення розглядається, як культивування чотирьох генерацій у неселективному живильному середовищі), було використано для комбінованого зброджування ї-о глюкози та ксилози за умов, подібних описаним у прикладі 7. Зброджені зразки відбирали та аналізували у о повній відповідності до опису, який наведено у прикладі 7. Подібним же чином, культури 1400 (І МНЗ2) та 1400 (І МНЗ3), культивовані впродовж 4 та 20 генерацій у неселективному живильному середовищі, було використано для комбінованого зброджування глюкози та ксилози. Після започаткування зброджування, знову таки через регулярні часові інтервали, відбирали і засобами НРІ С аналізували зразки, які порівнюються на Фігурах 4-6.

Наведені результати чітко демонструють, що 1400 (І МН-5Т) є набагато стійкішим за 1400 (І МНЗ2) та 1400 о (МНЗЗ) відносно підтримки здатності до зброджування ксилози після культивування у неселективному ко живильному середовищі впродовж більше ніж 40 генерацій.

Приклад 9 60 НРІ С аналіз зброджувальних зразків

Зразки бродильного бульйону (від О,бмл до 1,Омл), які відбирали зі згаданих культур, зберігали у 1,5мл пробірках Еппендорфа. Клітини та інші залишки видаляли центрифугуванням на мікроцентрифузі (максимальна швидкість) впродовж 10 хвилин. Одержаний супернатант розбавляли у 10 разів. Одержані розбавлені зразки аналізували на вміст етанолу, глюкози, ксилози, ксилітолу та гліцеролу засобами високоефективної рідинної 65 хроматографії (НРІ С) за допомогою системи Нігасні за наступних умов.

Колонка: Віокад НРХ-87Н

Рухома фаза: 0,005М НьЗО,

Швидкість потоку: 0,8мл/хв

Детектування: детектор КІ

Температура: 602С

Об'єм впорскування: 20мкл

Приклад 10

Генетичні характеристики хромосомної ДНК стійких трансформантів 1400 (І МН-5Т)

За результатами рестрикційного аналізу та аналізу полімеразно-ланцюгової реакції було визначено 7/0 генетичну карту (порядок та орієнтацію) клонованих генів, КК, АК, КО та 55 рДНК, присутніх у ріМН-зТ, показану на Фігурі 9В. Було здійснено експерименти, які ставили за мету визначення того, чи були інтегровані згадані гени (КК, АК та КО) до локусів 55 рДНК. У разі, якщо згадані гени, як очікувалось, були інтегровані до дріжджової хромосоми у локусах 55 рДНК, це надавало можливість визначення фактичного розміру фрагментів ДНК, до складу яких входила наступна комбінація часткових або інтактних генів, наприклад, 55 75 ВДНК-КК; 55 рРДНК-КО; КК-АК та АК-КО, за допомогою хромосомної ДНК 1400 (І МН-5Т), як матриці, та олігонуклеотидів, зазначених на генетичній карті (Фігура 9В), як праймерів, для здійснення синтезу ДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції. У разі, якщо згадані гени не були інтегровані до дріжджової хромосоми, одержати згадану комбінацію генів або фрагментів генів за допомогою експериментів, опис яких наведено перед тим, було неможливо. У разі, якщо згадані гени були інтегровані будь-де у дріжджовій хромосомі, за виключенням локусів 55 рДНК, деякі з вищезазначених комбінацій генів або фрагментів генів могли бути одержаними за допомогою експериментів, опис яких наведено перед тим, але не такі, до складу яких входив би фрагмент 55 рДНК; наприклад, 55 рДНК-КК та 55 РДНК-КО. Для здійснення експериментів, опис яких наведено перед тим, хромосомну ДНК виділяли з 1400 (І МН-5Т) за протоколом, який було надано компанією

Оіадеп, Четсворт, Каліфорнія. Позитивні результати було одержано шляхом синтезування за допомогою с полімеразно-ланцюгової реакції з застосуванням наступних пар праймерів (див. Фігуру 9): Олігонуклеотид 25 та

Олігонуклеотид 369; Олігонуклеотид 26 та Олігонуклеотид 369; Олігонуклеотид 370 та Олігонуклеотид 96; і)

Олігонуклеотид 97 та Олігонуклеотид 99; Олігонуклеотид 982 та Олігонуклеотид 27. Таким чином, за результатами цих аналізів, фрагмент ДНК, до складу якого входить КК-АК-КО, здається дійсно інтегрованим до дріжджової хромосоми 1400 у її локусах 55 РДНК. Га»)

Довідкова література

Наведені далі публікації свідчать про рівень майстерності фахівців у цій галузі техніки і кожну з них іа включено до цього опису посиланням таким чином, якби це було зроблено посиланням на кожну з них Ге) індивідуально і з повним викладенням. 1. Спап, С. 5. М., апа В8.-К. Туе (1980), "Ацшіопотоивіу геріїсайпуд зедцепсез іп басспаготусев о

Зв сегемівіае", Ргос. Май). Асад. зс, 77(11), 6329-6333. ї- 2. Стедд, 9. М., К. у. Вагтіпдег, А. У. Невзвівег, апа К. МК. Майдадеп (1985), "Ріснпіа равіогіз аз а Нові

Зузвіет Тог Тгапвтогтаїйопг", МоЇІесціаг апа СеїІшаг Віоіоду, 5, 3376-3385.

З. б'Атоге, Т., с. СеоНо,і. КивззеїЇ, апа с. с. Зіемжагй (1989), "БЗеІесіоп апа Оріїтігайоп ої Уеаві

ЗМийабіе ог ЕїПагої! Ргодисійоп а 402" Еп7.Місгобіа!. Тесппої. 11, 411-416. « 4. БШАтоге, Т., 9. Р. СНапага, І.КиззеїЇ, апа с. с, (ема (1990)"А БЗбшау ої еШапо! Тоіегапсе іп - с Уеаві" Стііса! Кемігемув іп ВіоФесппоіоду 9, 287-304. ц 5. Но, М. МУ. М., апа Твао, б. Т., "Кесотбріпапі Меазів сарабіе ої ЕПесіїме Регптепіайоп ої роїй діисозе "» апа Хуозе", Іпіегпайопа! Рибіїсайоп Мо. 95/13362, Мау 18, 1995, рибіїзпіпуд Іпіегпайопа! Арріїсайоп Мо.

РСТ/О594/12861, їПед Мометрег 8, 1994. б. Киаіа, В. апа А. Місоїав (1992), "А тийівйе іпіедгайме саззеце бог (Пе уеаві Засспаготусевз -І сегемівіае", Сепе. 119, 49-56. 7. Кий, М. В., М. МУ. Сопеї)уоу, апа 0. М. Кігеспй (1986), "Іпіедгайме Тгапвіогтайоп ої Сапаїда б аіІБісапв, Овіпуд а Сіопед Сапаїда АОЕ2 Сепе", МоіІесшціаг апа СеїІшаг Віоіоду, 142-149.

Ге») 8. І орев, Т. 5., У. Кіооїм/ЇкК, А. Е. Меепзіга, Р. С. мап дег Ааг, Н. мап Неегікпцігеп, Н. А. Капцше, апа К. .. Ріапіа (1989), "Нідп-сору-питбрег іпіедгабйоп іпіо (пе гірозота! ОМА ої Засспаготусев сегемівіае: а пем/ месіог ог о підн-Іеме! ехргезвіоп", ЕІвеміег Зсіепсе РибіїзНегв, 79, 199-206. о 9. Горевз, Т. 5., Сеп-уУап А.). НакККаагі, В. Ї. Коегів, Н. А. Каце, апа К. 9. Ріапіа (1991), "Меспапізт ої пПідп-сору-питбрег іпігедгайоп ої рМіІКМ-уре месіоге іпіо (Пе гіровота! ОМА ої Засспаготусез сегемівіае",

ЕІвеміег Зсіепсе РибіїзНегвг, 105, 83-90. 10. Оп-МУеамег, Т. Ї., 9. МУ. БговіаК, апа МК. 9. Коїйвівіп (1981), "Уеаві (гапвзіогтаййоп: А тоде! зувіет

Тог (пе зішау ої гесотрбіпайоп", Ргос. Май). Асад. Зсі., 75(10), 6354-6358. о 11. Оп-Меамег, Т. Ї., апа 9. МУ. Бговіак (1983), "МиШріе, Тапдет Ріазтій Іпіедгайоп іп бЗасспаготусев ко сегемізіае", МоїІесціаг апа Сеїйшіаг Віоіоду, З(4), 747-749. 12. Котаповз, М. А., С. А. Зсогег, апа 9. 9. СІаге (1992), "БГогедп Сепе Ехргезвіоп іп Меаві а Кеміем/", 60 чщопп УМіеу 5 Бопз Ца., 8, 423-488. 13. Козвоїїпі, М., М. |. Кіссіо, Е. Са, апа С. Її. Саїеоці (1992), "Засспаготусевз Іасіїв "МА аз а їагдеї( тог тиїріє іпігедгайоп Бу потоіодоиз гесотрбіпайоп", ЕІвеміег Зсіепсе Рибіївпегв, 75-81. 14. Коїйзіевїп, К. у. (1981), "Опе-5іер Сепе Оізгирійоп іп Уеаві", Ме(подз іп Епгутоіоду, 101, 202-211. 15. КоїПвівіп, МК. 9. (1991), "Тагдейпо, Оівгиріоп, Керіасетепі, апа АйПеіе Кевзсце: Іпіедгайме ОМА 65 Тгапвіогтаїйоп іп Уеавзі", Меїпоавз іп Епгутоіоду, 194, 281-301. 16. ЗаКаї, А., М. ЗПітіги, апа Р. Нізпіпита (1990), "Іпіедгайоп ої ефегоїрдоиз депе5з іпіо (Пе спготовоте ої Засспаготусев сегемізіде изіпд а деМа зедцепсе ої уеавзі гейгоігапзрозеп Ту", Аррі. Місгобіо|.

Віогесппої., 33, 302-306. 17. ЗакКаї, А.,, Б. Огамжа, Т. Нідазпігакі, М. ЗПпітіги, апа Р. Нізпіпита (1991), "Еппапсей Зесгейоп ої

Нитап Мегме (ЗгомЛй Расіог їот Засспаготусевз сегемізіае Овіпд ап Аймапсей а-Іпіеогайоп Зувіет",

Віо/Тесппоіоду, 9, 1382-1385. 18. 5(псйсотЬ, О. Т., М. Тпотавз, У. КейПу, Е. ЗеїКег, апа К. МУ. Юамів (1980), "ЕшКагуоїйс ОМА зедтепів сарабвіє ої ашопотоиз геріїсайоп іп уеавзі", Ргос. Май). Асад. зЗсі., 77(8), 4559-4563. 19. ей, К., 0. Т. БЗ(іпспсотр, 5. ЗсПпегег, апа Кк. МУ. Оамів (1979), "Нідн-птедцепсу ігапвіогтайоп ої /о увазі: Аціопотоизг геріїсайоп ої пургід ОМА тоїіесціев", Ргос. Май). Асай. зсі., 76(3), 1035-1039. 20. Зговіак, 9У. МУ., апа Кк. Ми (1979), "Іпвепіоп ої а Сепеїйїс МагКеї іпіо Ше Кірозота! ОМА ої Уеавг,

Ріазтіа, 2, 536-554. 21. МаІепгцеіа, Р., 0. І. ВеїЇ, А. Мепедаз, Е. Т. ЗемеїЇ, ЕР. К. Мавіагг, Ї. У. ЮОеСеппаго, б. М/еіпрега, апа МУ. 9. КиЧег (1977), "Кіровота! КМА депез ої Засспаготусевз сегемізвідае ІІ. РНувзісаї тар апа писіео(іде /5 ведцепсе ої Ше 5 З гпірозвота! КМА депе апа адіасепі іпіегдепіс Кедіопз", Те дошгпа! ої Віоіодіса! Спетівігу, 252(22), 8126-8135. 22. Семаїйег, М. К. апа М. АїЇдіе (1979), "Оцаїйаєйме адефесіоп ої репісіШппазе ргодисей Бу уеаві зігаіпе саггуїпу спітегіс уеаві - Соїї ріазтіа", Рерз І еКЦегв, 108. 179-180. 23. Но, М. МУ. М., Н. б. бао, 9. 9. Ниапод, Р. Е. біемів, 5. РЕ. Спапд (1984), "Оемеюртепі ої а сіопіпд Зузіет юг Сапаїда зресіев" Віоїесппо!. Віоепдіпеегіпу Зутр. Мо. 14, 295-301. 24. Мага, А. с. (1990) "Біпдіє-вЇерригійсайоп ої о8пиШе месіоге їот уеаві ог підп о Ппедцепсу раск-ігапетогіпайоп іпіо Е. соїї", Мисівїс Асіаз Кезеагсп, 18, 5319. 25. ВесКег, ОО. М. апа Ї. Спцамепіє, (1991), "Нідп-еПісіепсу ігапвіогтайоп ої уеавзі Бу еїІесігорогайоп,"

Меїйподз іп Епгутоіоду 194, 182-187. сч 26. Но, 5. М., Нипі, Н. 0О., Ногоп, К. М., Рийеп, 9. К., апа Реазе, |. К., (1989), "ЗйНе-дігесіва тиадепезів ру омегіар ехіепвіоп изіпуд (пе роїЇутегаве спаїп геасііоп", бепе, 77, 51. і) 27. Кипкеї, Т. А., (1985), Ргос. Маїй). Асад. Зсі. ОБА, 82, 488. 28. Кипкеї, Т. А., Кобрегів, 9. Ю. апа гакоиг, К. А., (1987), Ме. Епгутої., 154, 367. 29. ЗатргооК, У., Е. Р. Рійвст, апа Т. Мапіайв, (1989), "Моіесшаг Сіопіпо", рибіївпей ру Со Зргіпя «3 зо Нагброг ГГ ар. Ргезз, 4.10-4.11.

Claims (20)

1. Формула винаходу о (Се) 35 1. Дріжджі, що зброджують ксилозу у етанол, які містять гени, інтегровані до двох або більше з множини чн повторюваних сайтів рибосомної ДНК цих дріжджів, причому згадані гени кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, а згадані дріжджі містять також реплікаційну/Іінтеграційну плазміду, до складу якої входять автономна реплікаційна послідовність і гени, що кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу. «
2. 2. Дріжджі за п. 1, які також зброджують глюкозу у етанол. з с З.
3. Дріжджі за п. 2, які належать до роду Засспаготусев.
4. 4. Дріжджі за п. З, причому згадані сайти є нетранскрибованими сайтами ДНК. :з»
5. 5. Дріжджі за п. 1, причому згадані гени злиті з промоторами, які не пригнічуються у присутності глюкози, і згадані дріжджі одночасно зброджують глюкозу та ксилозу у етанол.
6. 6. Дріжджі за п. 5, причому згадані промотори не потребують ксилози для індукування. -І
7. 7. Дріжджі за п. З, причому згадані гени зливаються з промоторами, які не пригнічуються у присутності глюкози, і згадані дріжджі одночасно зброджують глюкозу та ксилозу у етанол. (22)
8. 8. Дріжджі за п. 4, причому згадані гени злиті з промоторами, які не пригнічуються у присутності глюкози, б і згадані дріжджі одночасно зброджують глюкозу та ксилозу у етанол, причому згадані промотори також не потребують ксилози для індукування. се)
9. 9. Дріжджі за п. б, причому гени ксилозредуктази та ксилітолдегідрогенази походять від природних о дріжджів, що зброджують ксилозу у етанол.
10. 10. Дріжджі за п. 9, причому згаданими природними дріжджами є Сапаїда ЗПпепаїйаеє, Ріснпіа віїрйіз або Распузоїеп (аппорпішв.
11. 11. Дріжджі за п. 9, причому ген ксилулокінази походить від дріжджів або бактерій.
12. 12. Дріжджі за п. 11, причому ген ксилулокінази походить від Сапаїда Зпепайає, Рісніа віірійів, (Ф) Распузоїеп (аппорпйн5, Засспаготусез сегемівіае, Зспіговасспаготусевз ротбре або ЕзспПегіспіа соїї. ГІ
13. 13. Дріжджі за п. 1, причому згадані гени інтегровані до щонайменше приблизно 10 сайтів рибосомної ДНК цих дріжджів. во
14. 14. Дріжджі за п. 1, одержані шляхом трансформування клітин дріжджів плазмідою, до складу якої входять гени, що кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, причому ці гени служать як селекційні маркери.
15. 15. Дріжджі, що зброджують ксилозу у етанол, які містять дріжджі, які мають численні копії екзогенної ДНК, інтегровані до хромосомної ДНК даних дріжджів, причому згадана екзогенна ДНК містить гени, які кодують 65 / Ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, злиті з промоторами, які не пригнічуються у присутності глюкози, причому ці дріжджі одночасно зброджують глюкозу та ксилозу у етанол і підтримують свою здатність до зброджування ксилози у етанол впродовж щонайменше 20 генерацій у разі культивування за неселективних умов.
16. 16. Дріжджі за п. 15, причому згадані промотори не потребують ксилози для індукування.
17. 17. Дріжджі, що зброджують ксилозу у етанол, які містять дріжджі, що мають численні копії впровадженої ДНК, яка містить гени, які кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, причому згадані дріжджі зброджують ксилозу у етанол і підтримують свою здатність до зброджування ксилози у етанол у разі культивування за неселективних умов впродовж як мінімум 20 генерацій.
18. 18. Дріжджі за п. 17, причому згадані промотори не потребують ксилози для індукування. 70
19. 19. Спосіб зброджування ксилози у етанол, який включає зброджування ксилозовмісного середовища дріжджами за пп. 1, 15, 16, 17 або 18 для одержання етанолу.
20. 20. Плазмідний вектор для інтегрування послідовності екзогенної ДНК до дріжджів для утворення стійких інтегрантів, які зброджують ксилозу у етанол, причому згаданий реплікаційний/інтергаційний плазмідний вектор містить дріжджеву функціональну автономну реплікаційну послідовність та екзогенну ДНК, яка містить гени, які 7/5 Кодують ксилозредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, фланковану з кожного кінця фланкувальною послідовністю ДНК, яка є гомологічною повторювальній послідовності ДНК дріжджової клітини-мішені. с щі 6) «в) (о) (Се) (Се) і - -

    с . и? -І (о) (о) се) (42) іме) 60 б5