CN112285340A - 一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种α1‑酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，还涉及一种α1‑酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，一种α1‑酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述生物素结合α1‑酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1‑3:1之间，链霉亲和素结合生物素‑α1‑酸性糖蛋白单克隆抗体比例为0.5:1‑4:1之间。优点是：经多次研发实验后，采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，α1‑酸性糖蛋白抗体连接生物素1:2，二者1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.00‑3.00g/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，还涉及一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法。
背景技术
α1-酸性糖蛋白是一种非特异的急性时相反应蛋白，它是人体血浆中糖含量最高、酸性最强的糖蛋白。α1-酸性糖蛋白是由181个氨基酸残基组成的多肽链构成，分子结构为单链，含糖量约为40％，包括等分子的己糖、己糖胺和唾液酸，电泳移动时在α1位置，故称α1-酸性糖蛋白，其分子量约为40000KD，pH值为2.7-3.5。
α1-酸性糖蛋白主要由肝脏巨噬细胞和粒细胞产生，某些癌细胞也可进行合成。早期α1-酸性糖蛋白曾作为一种非特异性的肿瘤标志物被广泛认知，后来诸多研究表明，在某些肾病、胃病等患者体内α1-酸性糖蛋白浓度也有所升高，从而降低研究指数。正常人血清中α1-酸性糖蛋白含量较低，在感染、炎症和肿瘤等病理情况下其浓度显著升高。此外，α1-酸性糖蛋白也被认为是粘蛋白的主要成分，但目前鉴于粘蛋白操作繁琐、影响因素较多、检测结果灵敏度低，已被建议取消。近几年来，随着检验技术和检验设备的不断改进，α1-酸性糖蛋白检测灵敏度的显著提高，检测方法与测定结果标准化的逐渐实施，临床开始对α1-酸性糖蛋白有了新的认识，对α1-酸性糖蛋白的检测也日益受到重视。国外学术期刊报道，在***癌、卵巢癌等病理性变化时，血清中α1-酸性糖蛋白的浓度明显升高。
近年来，α1-酸性糖蛋白的临床价值越来越受到广泛关注。有研究表明，恶性肿瘤患者血清中α1-酸性糖蛋白浓度显著升高并与患者的治疗进程有关。另有研究发现腹水α1-酸性糖蛋白的测定不仅能鉴别渗出液和漏出液，而且有助于良恶性腹水的鉴别。前人通过对健康人α1-酸性糖蛋白浓度及其与年龄的相关性研究，指出尽管有关文献所列的α1-酸性糖蛋白浓度范围较宽，但其血清浓度较高者并不多见，提示作为一项非特异性的实验室指标，血清中较高浓度的α1-酸性糖蛋白可能预示某种疾病或病理状态的存在。由于α1-酸性糖蛋白的肝脏合成与释放受到体内多种激素尤其是性激素的调节，***可抑制α1-酸性糖蛋白的产生。
目前，用于α1-酸性糖蛋白的检测方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫法。这些检测方法存在诸多不足，如需要特定的设备，样本需要进行预处理，不能用全自动生化分析仪进行批量检测等。此外，放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫法应用比较普遍，但该方法为非均相免疫检测，测定过程较繁琐，耗时长，批间差和重复性相对较大，需要配备多种专门设备，一定程度上增加了成本。
鉴于此，本发明提供一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒，常规方法中采用胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体，采用该方法发现灵敏度和线性范围均较差。
发明内容
本发明的目的是：针对上述不足，提供一种改善重复性和灵敏度的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：
所述试剂R2的主要成分包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸、稳定剂和第二防腐剂；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球、生物素、链霉亲和素、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；主要成分浓度为：
进一步的技术方案是：
所述试剂R1的第一缓冲液A和第二缓冲液B为PBS缓冲液。
所述试剂R1的促进剂为PEG 6000。
所述试剂R1的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300中的一种或几种。
所述试剂R2中的第二缓冲液为MES缓冲液。
所述试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白。
所述试剂R2中第二防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300中的一种。
所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1-3:1之间，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间。
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入第一缓冲液A和第二缓冲液A，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入促进剂和第一防腐剂，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在6.80-8.00之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到4.50-6.50之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入稳定剂，待物料完全溶解后再投入第二防腐剂，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到6.30-8.50之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到0.3-3.0％的浓度，与链霉亲和素按一定比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到0.05-3.0g/L的浓度,与生物素按一定比例结合透析过夜后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005-0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：经多次研发实验后，采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，α1-酸性糖蛋白抗体连接生物素1:2，二者1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.00-3.00g/L。
附图说明
图1是本发明实施例5的胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示dOD。
图2是本发明实施例6的胶乳微球间接偶联α1-酸性糖蛋白抗体定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示dOD。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：其作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，浓度为0.8g/L，作为第二缓冲液A的十二水合磷酸氢二钠，浓度为8.75g/L，氯化钠，浓度为5.8g/L，作为促进剂的PEG 6000，浓度为40g/L，作为第一防腐剂的Proclin-950，浓度为0.8ml/L；
所述试剂R2的主要成分和组成浓度包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，浓度为8.05g/L，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为1.26g/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，浓度为0.5g/L和作为第二防腐剂的Proclin-950，浓度为0.8ml/L；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球，浓度为0.05％、生物素，浓度为5g/L、链霉亲和素，浓度为5g/L、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体，浓度为0.05g/L和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.005g/L。
所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为2:1，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1之间。
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在6.80，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到4.50，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入稳定剂，待物料完全溶解后再投入牛血清白蛋白，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到6.30，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到0.3％的浓度，与链霉亲和素按1:1比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到0.05g/L的浓度,与生物素按1:2比例结合透析过夜后，按照1：1加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
实施例二：
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：其作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，浓度为1.6g/L，作为第二缓冲液A的十二水合磷酸氢二钠，浓度为14g/L，氯化钠，浓度为10g/L，作为促进剂的PEG 6000，浓度为70g/L，作为第一防腐剂的Proclin-300，浓度为1.2ml/L；
所述试剂R2的主要成分和组成浓度包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，浓度为14g/L，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为4g/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，浓度为1g/L和作为第二防腐剂的Proclin-300，浓度为1.2ml/L；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球，浓度为0.6％、生物素，浓度为10g/L、链霉亲和素，浓度为10g/L、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体，浓度为1g/L和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.1g/L。
所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为2:1，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1之间。
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至225rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在7.2，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至225rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到5，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至225rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入牛血清白蛋白，待物料完全溶解后再投入Proclin-300，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到7，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到1％的浓度，与链霉亲和素按1:1比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到1g/L的浓度,与生物素按1:2比例结合透析过夜后，按照1：1加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.1g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
实施例三：
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：其作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，浓度为2.4g/L，作为第二缓冲液A的十二水合磷酸氢二钠，浓度为18g/L，氯化钠，浓度为15g/L，作为促进剂的PEG 6000，浓度为100g/L，作为第一防腐剂的叠氮钠，浓度为1.6ml/L；
所述试剂R2的主要成分和组成浓度包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，浓度为20g/L，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为7g/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，浓度为1.5g/L和作为第二防腐剂的叠氮钠，浓度为1.6ml/L；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球，浓度为1.2％、生物素，浓度为15g/L、链霉亲和素，浓度为15g/L、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体，浓度为2g/L和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.2g/L。
所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为2:1，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1之间。
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至260rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和叠氮钠，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在7.2，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至260rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到6，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至260rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入牛血清白蛋白，待物料完全溶解后再投入叠氮钠，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到8，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到2％的浓度，与链霉亲和素按1:1比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到2g/L的浓度,与生物素按1:2比例结合透析过夜后，按照1:1加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.2g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
实施例四：
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：其作为第一缓冲液A的二水合磷酸二氢钠，浓度为3.2g/L，作为第二缓冲液A的十二水合磷酸氢二钠，浓度为24.31g/L，氯化钠，浓度为20.0g/L，作为促进剂的PEG 6000，浓度为120g/L，作为第一防腐剂的Proclin-950，浓度为2.0ml/L；
所述试剂R2的主要成分和组成浓度包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中作为第二缓冲液的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，浓度为27.30g/L，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸，浓度为9.83g/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，浓度为2.0g/L和作为第二防腐剂的Proclin-950，浓度为2.0ml/L；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球，浓度为2.0％、生物素，浓度为20g/L、链霉亲和素，浓度为20g/L、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体，浓度为3g/L和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为0.3g/L。
所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为2:1，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1之间。
一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在8.00，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到6.50，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入牛血清白蛋白，待物料完全溶解后再投入Proclin-950，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到8.50，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到3.0％的浓度，与链霉亲和素按1:1比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到3.0g/L的浓度,与生物素按1:2比例结合透析过夜后，按照1:1比例加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
实施例五：
胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体，使用标准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1：胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体定标结果：
结果解析：如图1和表1所示，线性范围可做到0.00-3.00g/L，浓度大于3.00g/L时出现hook效应。
胶乳微球间接偶联α1-酸性糖蛋白抗体，使用标准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图2所示。
表2：胶乳微球间接偶联α1-酸性糖蛋白抗体定标结果：
结果解析：如图2和表2所示，线性范围可做到0.00-5.00g/L。
实施例六：
精密度CV检测：
胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体，随机取一样本，对同一样本重复检测10次，检测结果如表3所示。
表3：检测样本的胶乳微球直接偶联α1-酸性糖蛋白抗体精密度CV：
| 1 | 0.15 | 1.87 | 2.58 |
| 2 | 0.16 | 2.15 | 2.36 |
| 3 | 0.15 | 2.09 | 2.70 |
| 4 | 0.17 | 1.99 | 2.85 |
| 5 | 0.17 | 1.96 | 2.71 |
| 6 | 0.15 | 2.00 | 2.65 |
| 7 | 0.14 | 2.09 | 2.46 |
| 8 | 0.14 | 2.04 | 2.87 |
| 9 | 0.13 | 1.97 | 2.84 |
| 10 | 0.13 | 2.01 | 2.83 |
| 均值 | 0.15 | 2.02 | 2.69 |
| SD | 0.01 | 0.08 | 0.17 |
| CV | 9.37％ | 3.90％ | 6.50％ |
结果解析：精精密度CV较大，基本＞5％。
胶乳微球间接偶联α1-酸性糖蛋白抗体，随机取一样本，对同一样本重复检测10次，检测结果如表3所示。
表4：检测样本的胶乳微球间接偶联α1-酸性糖蛋白抗体精密度CV
| 1 | 0.15 | 1.87 | 2.60 |
| 2 | 0.14 | 1.91 | 2.65 |
| 3 | 0.14 | 1.96 | 2.53 |
| 4 | 0.14 | 1.92 | 2.67 |
| 5 | 0.14 | 1.79 | 2.54 |
| 6 | 0.14 | 1.78 | 2.51 |
| 7 | 0.16 | 1.84 | 2.61 |
| 8 | 0.15 | 1.88 | 2.69 |
| 9 | 0.15 | 1.95 | 2.52 |
| 10 | 0.14 | 1.88 | 2.57 |
| 均值 | 0.15 | 1.88 | 2.59 |
| SD | 0.00 | 0.06 | 0.06 |
| CV | 3.30％ | 3.25％ | 2.50％ |
结果解析：精密度CV明显改善，4％以内。
结果分析：经多次研发实验后，采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，α1-酸性糖蛋白抗体连接生物素1:2，二者1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.00-3.00g/L。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的主要成分和组成浓度包括：
所述试剂R2的主要成分包括：试剂R2的第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物，其中，保存液包括N,N-二羟乙基甘氨酸、稳定剂和第二防腐剂；胶乳微球抗体偶联物包括胶乳微球、生物素、链霉亲和素、α1-酸性糖蛋白单克隆抗体和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；主要成分浓度为：
2.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述试剂R1的第一缓冲液A和第二缓冲液B为PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述试剂R1的促进剂为PEG 6000。
4.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：
所述试剂R1的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述试剂R2中的第二缓冲液为MES缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述试剂R2中第二防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法，其特征在于：所述生物素结合α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为1:1-3:1之间，链霉亲和素结合生物素-α1-酸性糖蛋白单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间。
9.一种α1-酸性糖蛋白检测试剂盒胶乳免疫比浊法的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：A)、试剂R1制备：
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入第一缓冲液A和第二缓冲液A，搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入促进剂和第一防腐剂，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值在6.80-8.00之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备：
步骤B1：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌至物料完全溶解，清澈透明，配液罐底部无沉淀，调整PH值到4.50-6.50之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
步骤B2：保存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌至物料完全溶解，之后投入稳定剂，待物料完全溶解后再投入第二防腐剂，待清澈透明，配液罐底部无沉淀，调节pH值到6.30-8.50之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
步骤B3：胶乳微球抗体偶联物的制备
将胶乳微球用反应液稀释到0.3-3.0％的浓度，与链霉亲和素按一定比例结合，将α1-酸性糖蛋白单克隆抗体以反应液稀释到0.05-3.0g/L的浓度,与生物素按一定比例结合透析过夜后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005-0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入稳定剂封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，并定容至终浓度，进行标识。
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