CN118006773A

CN118006773A - 一种急性淋巴细胞白血病相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途

Info

Publication number: CN118006773A
Application number: CN202410017282.XA
Authority: CN
Inventors: 孙怡彤; 叶生鑫; 周靖雯; 陈文良
Original assignee: Nanjing Adicon Clinical Laboratories Co ltd
Current assignee: Nanjing Adicon Clinical Laboratories Co ltd
Priority date: 2024-01-05
Filing date: 2024-01-05
Publication date: 2024-05-10

Abstract

一种急性淋巴细胞白血病相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途。本发明制造出的建库试剂盒可利用杂交捕获法检测急性淋巴细胞白血病66种相关基因；仅需微量基因组DNA用于构建DNA文库，模板起始量可低至20ng；将酶切打断、末端补平和加A尾在一个体系里完成，然后再利用探针对文库进行杂交捕获和富集，具有耗时短，效率高的优点。

Description

一种急性淋巴细胞白血病相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种急性淋巴细胞白血病相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途。

背景技术

ALL诊断采用MICM(细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子遗传学)诊断模式，最基本的检查应包括细胞形态学、免疫表型，免疫分型采用多参数流式细胞术，最低诊断分型可以参考EGIL标准。中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(2021年版)建议开展二代测序技术(NGS)检测基因突变和基因拷贝数变异(如IKZF1和CDKN2A/B缺失等)，为患者诊断分型、预后判断、靶向治疗提供依据。

二代测序技术作为MICM中分子生物学的一部分，灵敏度高，作为金标准的一代sanger测序对突变频率10％以下的位点不能准确检出，而二代测序仍然有较好的检出；通量大，通过探针杂交捕获的方式可以一次检测数百个基因甚至全基因组上的所有序列。此外，二代测序(NGS)对可测量残留病灶(MRD)的评估优于传统检测，NGS评估的早期MRD阴性与最佳生存率相关。

本发明在二代测序的基础上，探寻一种可以快速完成对急性淋巴细胞白血病相关基因的突变检测的检测方法和试剂盒。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的第一目的是提供一组捕获探针，用于达到有效快速捕获急性淋巴细胞白血病相关基因的目的。

本发明的第二目的是提供上述捕获探针的用途，用于制造一种检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒，缓解了现有技术中缺少一种能够有效快速捕获急性淋巴细胞白血病相关基因的产品的问题。

本发明的第三目的是提供检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒，用于达到快速建立急性淋巴细胞白血病相关基因的靶向文库的目的。

本发明的第四目的是提供一种文库构建方法，实现了对急性淋巴细胞白血病相关基因有效富集的目的，并且该方法以极低起始量的基因组DNA为模板，大大降低了等待杂交反应的时间，提高了杂交效率。

本发明的第五目的是提供一种建库试剂盒的用途，达到了快速对急性淋巴细胞白血病相关基因精准分型的目的。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种捕获探针，所述捕获探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～1000中的至少一种。

作为本发明的进一步优选，一种捕获探针的用途，所述捕获探针用于制造一种检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒。

一种检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒，包括至少一组捕获探针，所述捕获探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～1000中的至少一种。

一种文库构建方法，使用上述捕获探针或建库试剂盒捕获急性淋巴细胞白血病相关基因。

作为本发明的进一步优选，所述急性淋巴细胞白血病相关基因包括：ABL1、BRAF、CCND3、CDKN1A、CDKN2A、CDKN2B、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTCF、DNM2、DNMT3A、EBF1、ECT2L、EED、EP300、ERG、ETV6、EZH2、FBXW7、FLT3、G6PD、GATA2、GATA3、IDH1、IDH2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A、KMT2D、KRAS、LEF1、MTOR、NF1、NOTCH1、NRAS、NSD2、NT5C2、NUDT15、PAX5、PHF6、PRPS1、PTEN、PTPN11、RB1、RELN、RPL10、RUNX1、SETD2、SH2B3、STAT5B、SUZ12、TBL1XR1、TP53、TPMT、WT1、XPC、BTG1、RPL5。

一种建库试剂盒的用途，至少包括下述中的一种：(1)检测急性淋巴细胞白血病相关基因；(2)检测急性淋巴细胞白血病相关基因中的变异情况；(3)遗急性淋巴细胞白血病相关基因筛查检测；(4)预测个体对急性淋巴细胞白血病易感倾向；(5)监测患者的微小病灶残留。

作为本发明的进一步优选，所述文库构建方法包括以下步骤：

(a)样品提取：收集待测样品并提取基因组DNA；

(b)DNA片段化：将DNA打断形成DNA片段；

(c)末端修复：对所述DNA片段进行末端修复和添加A-Tailing，然后进行纯化；

(d)接头并纯化；

(e)文库杂交并捕获。

一种文库构建方法在检测急性淋巴细胞白血病相关基因中的用途，文库构建方法得到的文库进行测序，将测序结果与数据库进行对比。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明设计的探针具有对文库进行杂交捕获和富集耗时短，效率高的优点。

本发明制造出的建库试剂盒，可利用杂交捕获法检测急性淋巴细胞白血病相关66种基因以及其变异情况；仅需微量基因组DNA用于构建DNA文库，模板起始量可低至20ng；将酶切打断、末端补平和加A尾在一个体系里完成，然后再利用探针对文库进行杂交捕获和富集，具有耗时短，效率高的优点。

本发明制造出的建库试剂盒中的快速杂交体系，杂交时间最短可至15min即可实现一般过夜杂交的效率，最终得到文库片段大小在300～450bp左右，能够兼容Illumina各种测序平台进行测序。

附图说明

图1为实施例1的片段分析结果。

图2为实施例1的样本变异列表。

图3为实施例2的片段分析结果。

图4为实施例2的样本变异列表。

具体实施方式

一、文库构建-酶切法

1.1)进行DNA片段化、末端修复和dA加尾。

1.1.1)在PCR仪上设置如下程序，热盖温度70℃：

温度	时间
		37℃	20min
65℃	30min
		4℃	hold

1.1.2)混合并瞬离试剂，配制反应液(冰上配制)，并分装至PCR管，冰上待用，反应液配置如下：

试剂	单反应体积
		Frag/AT Buffer	4uL
Frag/AT Enzyme	6uL
		总体积	10uL

1.1.3)用Qubit定量分析试剂盒测定gDNA的浓度，在上述反应液中加入40μlDNA样品，总量为50～200ng。密封反应管或盖上盖子，轻轻震荡混匀，瞬离后放入热盖温度70℃的PCR仪上，按1.1.1中程序运行。

1.2)连接通用接头。

1.2.1)在1.1的PCR反应时准备DNA纯化磁珠，充分震荡混匀，室温下平衡至少30min；准备80％乙醇；在冰上解冻Universal adapter(Twist Bioscience)和DNALigation Mix(Twist Bioscience)；设置PCR程序20℃hold，热盖关闭。

1.2.2)在每个含有带dA尾的DNA片段(1.1中制得)的样本板孔或单管中，加入5μl的Universal adapter，轻柔吹打混匀，然后置于冰上。加入20μl的Ligation Mix，轻柔吹打混匀，密封反应管或盖上盖子，瞬离后放入准备工作里设置的PCR仪上。

1.3)第一步磁珠纯化

1.3.1)在1.2得到的每个样本中加入60μl已混匀的DNA纯化磁珠(0.8x)，涡旋混匀，室温孵育5min。

1.3.2)瞬离后磁力架上静置5min，吸弃上清，加入200μl新鲜制备的80％乙醇，孵育一分钟，弃上清。重复一次。

1.3.3)使用10μl移液器小心地吸取残留的乙醇。在磁力架上晾干磁珠至磁珠无反光、干裂。

1.3.4)每个样本中加入18μl的ddH2O，吹打混匀，室温孵育25min；瞬离后放上磁力架，静置3min。

1.3.5)吸取15μl上清液转移到PCR管中，准备下一步PCR扩增。

1.4)UDI引物PCR扩增

1.4.1)在冰上解冻Equinox Library Amp Mix(2x)和UDI引物(TwistBioscience)；在PCR仪上设置如下程序，热盖温度105℃：

1.4.2)向1.3制得的各个gDNA文库中各加入10μl的UDI引物和颠倒混匀后的25μl的Equinox Library Amp Mix(2x)，轻轻吹打混匀。瞬离后转移到PCR仪中，按1.4.1程序运行。

1.5)第二步磁珠纯化

1.5.1)涡旋已预平衡的DNA纯化磁珠，直至混匀。在1.4制得的每个连接样本中添加50μl(1x)已混匀的DNA纯化磁珠。涡旋混匀，室温孵育5min。

1.5.2)瞬离后磁力架上静置5min，吸弃上清，加入200μl新鲜制备的80％乙醇，孵育一分钟，弃上清。重复一次。

1.5.3)使用10μl移液器吸取残留的乙醇。在磁力架上晾干磁珠至磁珠无反光、干裂。

1.5.4)每个样本中加入24μl的ddH2O，吹打混匀，室温孵育5min，瞬离后放上磁力架，静置2min。

1.5.5)取2μl稀释10倍后使用Qubit进行文库浓度测定，并用片段分析仪进行片段大小测定。

注：对50ng高质量gDNA在37℃下进行20分钟片段化，然后进行8次PCR循环，所获得产物的最终浓度值应≥50ng/μl。浓度低于50ng/μl可能反映出样本制备效率低，并且可能导致杂交后的文库多样性低。在上述情况下，平均片段长度通常在350～425bp之间(范围设置为150～1000bp)。

二、杂交捕获

2.1)文库杂交

2.1.1)文库池DNA混合方案：文库池常包含多个不同样本文库，根据文库DNA浓度计算文库池进入量，混合获得文库池。文库池DNA总量为1.5～4ug，建议同质量样本建立文库池，一个反应最多8个文库。

2.1.2)根据Qubit测定的文库浓度计算好不同文库的用量，在1.5mL离心管中对文库进行混合，轻轻震荡，瞬时离心。

2.1.3)按下表在混合好的样本加入预杂交试剂，轻轻震荡混匀，瞬时离心：

试剂	单反应体积
		Universal Blockers	8uL
Blocking Solution	5uL
		ALL相关基因Panel探针	4uL

2.1.4)将反应管打开管盖置于真空浓缩仪中，配平后45℃烘干直至管内溶液干燥完全。烘干过程约30min～60min。

2.1.5)将Fast Hybridization Mix(Twist Bioscience)在65℃孵育10min，直至沉淀完全溶解；按照下表设置PCR仪程序，热盖85℃。

温度	时间
		95℃	5min
60℃	15min～4h

2.1.6)烘干结束后，从真空浓缩仪里取出离心管，撕下封口膜，将预热的FastHybridization Mix(Twist Bioscience)迅速涡旋并取20μl重悬样本(注意不要让杂交液恢复到室温)，轻弹混匀，室温静置5min。

2.1.7)使用移液器上下吹吸10次，完全溶解DNA后，将管内所有溶液尽可能全部转移至一个新的PCR管中，再向管中加入30μl石蜡油(从管上壁加入，使石蜡油覆盖试剂表面)，瞬离去除气泡。

2.1.8)转移PCR管到已预热好的PCR仪中，运行2.1.5中程序。

2.2)文库捕获和清洗

2.2.1)在2.1的PCR反应时准备DNA结合磁珠Streptavidin Binding Beads(TwistBioscience)，充分震荡混匀，室温下平衡至少30min；在恒温金属浴上，66℃预热450μlFastWash Buffer 1；48℃预热700μlWash Buffer 2；按下表分装富集试剂至1.5mL离心管中。

试剂	单反应体积
		Fast Binding Buffer(Twist Bioscience)	900ul
Fast Wash Buffer 1(Twist Bioscience)	450ul
		Wash Buffer 2(Twist Bioscience)	700ul

2.2.2)震荡预平衡的Binding Beads(Twist Bioscience)直至完全混匀，取100μl磁珠至1.5mL离心管中。

2.2.3)向离心管中加入200μlFast Binding Buffer并用枪头吹打混匀；将离心管置于磁力架上1min或至溶液澄清，弃去上清，取下离心管；重复以上洗涤步骤2次，共3次。

2.2.4)3次清洗后再加入200μl Fast Binding Buffer，震荡重悬使充分混匀。

2.2.5)步骤2.1的杂交反应结束后2.2.8打开PCR仪盖并迅速将杂交液全部转移至平衡好的磁珠液中，立即吹打混匀。

2.2.6)将离心管合盖后再用封口膜封紧管口，然后置于在Biocate振荡器上，1200rpm，室温充分混匀30min。

2.2.7)将离心管快速离心，置于磁力架上1min，去上清。

2.2.8)将离心管从磁力架上拿下，加入200μl预热的FW1，轻混后迅速置于66℃孵育5min。重复2.2.7～2.2.8一次。

2.2.9)转移管内所有液体到一个新的1.5mL离心管中，置于磁力架上1min，去上清。

2.2.10)将离心管从磁力架上拿下，加入200μl预热的W2，轻混后迅速置于48℃孵育5min，磁力架上1min，去上清后再重复用W2清洗2次，共三次。

2.2.11)瞬离后置于磁力架上，用10μl枪头吸尽残液；加入45μl的ddH2O，吹打混匀，冰上孵育。

2.3)PCR扩增

准备DNA纯化磁珠，充分震荡混匀，室温下平衡至少30min；准备80％乙醇；在冰上解冻Equinox Library Amp Mix(2x)和Amplification Primers(Twist Bioscience)；在PCR仪上设置如下程序，热盖温度105℃。

准备PCR管，每管加入25μl的Equinox Library Amp Mix(2x)和2.5μl的Amplification Primers。取2.2制得的磁珠悬液22.5μl加入PCR管中，轻轻震荡混匀，瞬时离心。

转移PCR管到已预热好的PCR仪中，运行上述程序。

2.4)磁珠纯化

涡旋已预平衡的DNA纯化磁珠，直至混匀。在2.3制得的每个富集样本中添加90μl(1.8x)已混匀的DNA纯化磁珠。涡旋混匀，室温孵育5min。

瞬离后磁力架上静置5min，吸弃上清，加入200μl新鲜制备的80％乙醇，孵育一分钟，弃上清。重复一次。

使用10μl移液器吸取残留的乙醇。在磁力架上晾干磁珠至磁珠无反光、干裂。

每个样本中加入32μl的ddH2O，吹打混匀，室温孵育5min，瞬离后放上磁力架，静置2min。

转移30μl上清至干净的1.5ml离心管，取2μl使用dsDNA HS Assay Kit(Vazyme)进行文库浓度测定，文库浓度应大于0.5ng/μl。同时可采用2100片段分析仪检测文库片段长度分布，平均片段长度应该在300～400bp。纯化后富集文库若不能立即上机测序，可在-20℃以下保存。

本发明构建的文库能够兼容illumina各种测序平台进行测序。

实施例1

一例B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(B-ALL)骨髓样本，检测其相关基因的突变情况。使用天根血液基因组提取试剂盒提取基因DNA，按照上述方法建库并杂交捕获。杂交捕获文库的片段分析结果如图1所示。

使用illumina的Nextseq2000对杂交文库测序，并进行后续的生物信息学分析。得到该样本的变异列表如图2所示(注：“√”表示该变异在诊断、用药和预后相关证据中有临床意义，“-”表示暂无相关证据)。

实施例2

一例B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤(B-ALL)组织样本，检测其相关基因的突变情况。从蜡块样本中用切片机切下合适数量的组织切片，使用vazyme组织样本提取试剂盒提取基因DNA，按照上述方法建库并杂交捕获。杂交捕获文库的片段分析结果如图3所示。

使用illumina的Nextseq2000对杂交文库测序，并进行后续的生物信息学分析。得到该样本的变异列表如图4所示(注：“√”表示该变异在诊断、用药和预后相关证据中有临床意义，“-”表示暂无相关证据)。

捕获探针序列如下：

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Claims

1.一组捕获探针，其特征在于，所述捕获探针包括碱基序列SEQ ID

NO:1～1000中的至少一种。

2.如权利要求1所述的捕获探针的用途，其特征在于，所述捕获探针用于制造一种检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒。

3.一种检测急性淋巴细胞白血病多个基因型的建库试剂盒，其特征在于，包括至少一组捕获探针，所述捕获探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～1000中的至少一种。

4.一种文库构建方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的捕获探针或权利要求3所述的建库试剂盒捕获急性淋巴细胞白血病相关基因。

5.一种如权3所述建库试剂盒的用途，其特征在于，至少包括下述中的一种：

(1)检测急性淋巴细胞白血病相关基因；(2)检测急性淋巴细胞白血病相关基因中的变异情况；(3)遗传性急性淋巴细胞白血病相关基因筛查检测；(4)判断急性淋巴细胞白血病预后；(5)监测患者的微小病灶残留。

6.根据权利要求2～5任一所述的一种文库构建方法，其特征在于，所述急性淋巴细胞白血病相关基因包括：

ABL1、BRAF、CCND3、CDKN1A、CDKN2A、CDKN2B、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTCF、DNM2、DNMT3A、EBF1、ECT2L、EED、EP300、ERG、ETV6、EZH2、FBXW7、FLT3、G6PD、GATA2、GATA3、IDH1、IDH2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A、KMT2D、KRAS、LEF1、MTOR、NF1、NOTCH1、NRAS、NSD2、NT5C2、NUDT15、PAX5、PHF6、PRPS1、PTEN、PTPN11、RB1、RELN、RPL10、RUNX1、SETD 2、SH2B3、STAT5B、SUZ12、TBL1XR1、TP53、TPMT、WT1、XPC、BTG1、RPL5。