CN112195187B

CN112195187B - 一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN112195187B
Application number: CN202011108734.3A
Authority: CN
Inventors: 潘孝武; 李小湘; 黎用朝; 刘文强; 董铮; 熊海波; 盛新年
Original assignee: HUNAN RICE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: HUNAN RICE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2040-10-16
Also published as: CN112195187A

Abstract

本发明提供了一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用，属于基因工程技术领域，所述水稻分蘖角度调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的基因能够调控水稻分蘖角度，将水稻中的该基因敲除后，实现调控水稻分蘖角度。

Description

一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

水稻是我国第一大口粮作物，水稻品种的产量一直是育种家关注的重点问题。通过改良水稻株型，培育具有理想株型的新品种是提高水稻单产的重要途径。其中，分蘖角度指初级分蘖茎与主茎之间的夹角，是水稻株型的重要构成因素之一。分蘖角度直接决定水稻的种植密度，影响光合作用效率、抗倒伏能力以及病虫害发生情况，最终影响水稻的产量和收获指数。发掘分蘖角度调控基因，可以精准高效的改良水稻的分蘖角度，提高水稻群体的光合效率，最终获得理想的产量。

发掘分蘖角度明显变化的突变体是研究水稻分蘖角的重要途径。水稻散生突变体lazy和紧凑型突变体Er分别于1938年和1968年被报道。国内外众多学者针对lazy相关突变体的表型特征和分子机理开展了大量的研究，发现lazy突变体的分蘖角度和叶夹角都明显增大，并成功克隆了位于第11染色体的LAZY1基因。LAZY基因属于植物特有的基因，玉米中的同源基因ZmLA1突变导致茎秆匍匐；在细胞间的生长素运输过程中，PIN家族输出载体扮演着关键作用，在水稻中过量表达OsPIN2基因能够抑制LAZY1基因的表达水平，增强生长素的极性运输。与lazy突变体相似，水稻散生突变体lpa1表现出分蘖角度和叶夹角增大，同时茎秆的重力反应下降，但LPA1主要通过调节淀粉体沿重力方向的沉降速度影响重力反应。与LPA1的功能不同，另外一个C2H2型锌指蛋白PROG1的突变导致了野生稻匍匐生长向栽培稻直立生长习性的转变。

分蘖角度在不同水稻品种间差异明显，大部分籼稻的分蘖角度都大于粳稻。利用籼粳交遗传群体，大量控制分蘖角度的QTL被定位，QTL几乎分布于水稻的每一条染色体上。其中，qTA-9在各种不同的群体中均被检测到，且效应值最大。在此基础上，Yu和Komori等先后克隆了TAC1基因。与籼稻相比，粳稻中的TAC1基因位于3’UTR区域的内含子剪切位点发生突变，导致其表达量下调，从而赋予粳稻直立生长的特性。除TAC1以外，He等精细定位了分蘖角度基因qTAC8并预测了候选基因。Dong等利用全基因组关联分析(GWAS)，共鉴定了TAC1等30个控制水稻分蘖角度的QTL，并克隆了另一个主效QTL(TAC3)。现有技术中还未有发现新的基因调控水稻的分蘖角度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用，本发明提供的基因能够调控水稻分蘖角度，将水稻中的该基因敲除后，实现调控水稻分蘖角度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种水稻分蘖角度调控基因，所述水稻分蘖角度调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述水稻分蘖角度调控基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的水稻分蘖角度调控基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的水稻分蘖角度调控基因在调控水稻分蘖角度中的应用。

优选的，将水稻中的水稻分蘖角度调控基因敲除，实现调控水稻分蘖角度。

优选的，通过CRISPR-Cas9技术敲除水稻分蘖角度调控基因。

优选的，通过靶位点敲除水稻分蘖角度调控基因，所述靶位点的核苷酸序列如SEQID No.4和SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的蛋白质在调控水稻分蘖角度中的应用。

本发明提供了一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用，所述水稻分蘖角度调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的基因能够调控水稻分蘖角度，将水稻中的该基因敲除后，实现调控水稻分蘖角度。

附图说明

图1为突变体la2与野生型的分蘖角度比较；

图2为水稻分蘖角度基因LA2的定位过程；

图3为敲除株系的测序结果，加粗碱基为前间区序列邻近基序(PAM)，加下划线的碱基为靶序列，加框的碱基为***序列；

图4为LA2基因敲除株系的分蘖角度。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻分蘖角度调控基因，所述水稻分蘖角度调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

TACCTTTTCTCTTCAACGATATCCTCTATCCCAAAAATCGAGCCTTTTCCTCCCCCCTTCCTCCTCCACCGCCGCCCATCTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGATGGCTCCCTCCACCGCCCTCTCTCCGGTGGCCTTCAAGTCCTCCTTCTCGCCGCTCCTCTTCAACCCGACCCGTAAGCCATCCTCTCCCTCCATCCTTCTCTCTCCGCGCGGCGGAGTCAGCCGTAGCCGGGCGCTTTCCGTCGTCGGGCGCCGCTGCCAGCGCGCGCGCGCGCGCGGAGGAATCCTCCACGGCGGTATTCTTCGGAGCCCAATTCGATCGGGGTGGCCTCGTCTCCGATGCCGCCGCGGCCCACCGCTTTGCCTGGCGTTCGTATTATCGGGTGGCCTCTTAACTCTAATTAGTGCGGATGCGAGTTGGGTTGCTGTGCTTGCGGTTAGGGTTTCACTGGGCGTTAAAAGAGAGAAAAAGAAATTCATTAAGTCTCAATTTAGTTGAATGTTTTTGCGGCGGTGTGTGGGGGGAGATTGTTGCGTTTGTGCTGTTCTAGGTGACGGCCGGAAATATTTGGTTTGTTTTTAGGTTTGACAATAATCTTTTCGTCGGTTTTCGGGGTCCTTGTACAATTCTATCATTTCAACCATGTACAAAGATGTTCCTTTTTTATGTTAGGAATTGGTTTCATTTAGTTCTAGTGGACATACGATTCTGGCATGTAGGTAATTTATTTCATTATGGTAAGTTTTCTGTTGTAGTAGTATCTGTTTATTCAGGGAATTGTATAAAATGGAGCATTACACATTAGCTTAGTCCTTGGGCTTCCGTTCTCCCCTTTTCTTTTGATCGGTGGAGCTTTGATCTTTGTTGACCAGTGCGTCCTTGTTGATTATTTTTCTTATGTTATAGCAACACCTGAACATTTTGCACCTGTTGTTTCTTTGTTGTTCAGGTTCTAAGATAAATGTCGAAGGTGCATTCTGTTTGCCATGTTACAATAGGAAAAAGGCTAGCAATAGATCCTTTCGCGTGTACAGTTTATTTGGGGGAAAAAAGGACAAAGACGAGAATGGTGAAGAAGCACCATCAAAGGTAAGAAAATTAGATGCCTTCTTTCAATTTGAACTTCTGTTGTACTCCCAATAACTAAAAGAGTATCTTCATGGATGCCTGAAATGAAAACAATTGCAAATTCACAGGTGGATGTCTACCTTAATCAGTTCAATACTATGTGCTATTCATATCTTTATACTTTTATCTGAATAGTAATATGCTCAAGATAATGCCTTGCTCATTGCAAATTCTGTTGAAGTCTTAAACTCCTGTAGAAAATAGTTAAGAGTGTAACTCATCATGTTGATATTTCAGTTCGTGCTGAAATTAAATTCTGCATATAATTTTAAGGGAATATAAAATATTTTAACTAATATGTACTTTTGTTATCACCTCTACTTTATAGCTTCTATGTTCAGTTTTCTTCTCTTTCCAATGAATGATGCCACTTCTAAAATGATAAACTTTTACTTTATTTGGGTATTTGTATAGTTGACTAAGATGCATGAGCTGTATTCACTATGTTCCCTTGTTTGTGCACAAATACCTAGTATAGTAGGCATTTTTATTTTTGTTTGTAAACATCTTGTAGTTCTCATTTTTGTACTTACTTTTAGGCAGGAATTTTCGGAAATATGCAAAATCTTTATGAAACTGTGAAGAAGGCCCAGATGGTTGTCCAAGTTGAGGCTGTCCGGGTGCAAAAGGAGCTTGCAGCGTATGCATTTGGATATCTGAGTAATATTTGATATGTTATCGCTAAATAGCACAGCAGTGTGACTTTTTTCCTCTTGTTTTAGGACTGAGATCGATGGTTACTGTGAAGGGGAACTAATCAAGGTATGCTTTGGATTAGTTGATTAATGTTGTTGTTAACTGAATTCTTGCTAGCTGTATGTTTCATTGTGCCTTGAACATTGAAGGGTTTCTTTGTTAAATGACTGACATTTTAGCATTGTTGAAAAAGCCTGTTGAACTTGAGCCAGGCTATAAAGATCACATATTATCACTGACAAACATTGATCTTTGTTTCACTGAGAAAGGGCGGTCATTTCCTACAGTAAAACCAAATATATTCCCTTATATGTTCTTATACTGAAGAATGGCATGTATTTTTTATGATCTTAATTAGGTTGATCGCTATATGAAGTAATTAAAATCATTTGGTATCTCTTTTAGCTTTGGCTTAGATAAAGTTATGTTGAAAAGGTACCATCTTGGCACAAGAACACTGTCAAATCTGTGGGCAGGGAGGTGGTTATAAGTCATCAAATGATTTATGGTGGCATAGGTTGTTACCGTTTGAAAAGGTCACTGTCTTAACTCTTAAAGCCATTTGAAAATGTGCATGTTAATAATGTCTTAGCTTTTCAAATGACAAAAATAACGTTGCAATACCTTGACATTTTCTCCCATGAGCTAAGTGCTATGCTGGTATATTTTGTAGAGCCATATGCTGTCAAAGTTTGCTAAATCTTATTTGTTTCTTATAAGTTTAGCAGGACTATCCGATTATTACATTCCTTTGCTTTTCTCGAAAGTAGAAAATCACATGCATATACTTCCGGTGCAAGTATTTGACCTGATTCATTAACCAGGTAACACTTTCTGGGAACCAGCAGCCTGTAAGAGTTGAAATCACCGAAGCTGCAATGGAAGTGGGTGCTGAAGTATGTATTTTATCTACCATTTTAATCATTTTCTTTGACGATTTCTTGCATGTTCGCATGATTTTTGGCATGAGTCAACCATTTCAATGTTCACACATGAATTTGATAAATACCTTATGTATGTACCCGTTAGCAGACCAAAACAAAACCAAATTGTTCAAAGTGTGATATATATAGTATCCTTTCAGAAACTTTCTGAGCTGGTGAACGACGCCTACAAGGATGCACATCAGAGGAGTGTCCAGGTGCGAATCCTGCTATTACTTTTTGCGTAGAAATTGAAACTTGCGTTCTATACTAACACGGTACTGTACTTAAAACCTGCAGGCAATGAAGGAGAGGATGGCTGATCTGGCACAGAGCTTAGGAATGCCAGCAGGCCTTGGTGATGGACTCAAGTGATAGTGTGGTACATGAATGCTTTTCAATAAAAAAAAAAGTGTATCTCAATTTTGTATACTAGCTGTATTGAGTCATCAGTTTAAAATTCGTGGCGAGTACTGTTAGCTGTGTAAGAACTGTAATCGAGAACATCTGATCCTGTTTTCCTTAATCATTGGCACACCATAATGCATTGACGCAAGTGTGCTGTTTTACAACTGCTGTTGATGTGCAGAATGAAATCTGTTCCAAACA。

在本发明中，所述水稻分蘖角度调控基因由3358个碱基组成，自5’端第5-174位碱基为第一个外显子，自5’端第175-951位碱基为第一个内含子，自5’端第952-1091位碱基为第二个外显子，自5’端第1092-1669位碱基为第二个内含子，自5’端第1670-1780位碱基为第三个外显子，自5’端第1781-1852位碱基为第三个内含子，自5’端第1853-1892位碱基为第四个外显子，自5’端第1893-2650位碱基为第四个内含子，自5’端第2651-2722位碱基为第五个外显子，自5’端第2723-2910位碱基为第五个内含子，自5’端第2911-2967位碱基为第六个外显子，自5’端第2968-3049位碱基为第六个内含子，自5’端第3050-3358位碱基为第七个外显子。

在本发明中，所述水稻分蘖角度调控基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该序列由889个碱基组成，其编码序列为自5’端第98-655位碱，序列具体如下：

TTTTCTCTTCAACGATATCCTCTATCCCAAAAATCGAGCCTTTTCCTCCCCCCTTCCTCCTCCACCGCCGCCCATCTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGATGGCTCCCTCCACCGCCCTCTCTCCGGTGGCCTTCAAGTCCTCCTTCTCGCCGCTCCTCTTCAACCCGACCCGTTCTAAGATAAATGTCGAAGGTGCATTCTGTTTGCCATGTTACAATAGGAAAAAGGCTAGCAATAGATCCTTTCGCGTGTACAGTTTATTTGGGGGAAAAAAGGACAAAGACGAGAATGGTGAAGAAGCACCATCAAAGGCAGGAATTTTCGGAAATATGCAAAATCTTTATGAAACTGTGAAGAAGGCCCAGATGGTTGTCCAAGTTGAGGCTGTCCGGGTGCAAAAGGAGCTTGCAGCGACTGAGATCGATGGTTACTGTGAAGGGGAACTAATCAAGGTAACACTTTCTGGGAACCAGCAGCCTGTAAGAGTTGAAATCACCGAAGCTGCAATGGAAGTGGGTGCTGAAAAACTTTCTGAGCTGGTGAACGACGCCTACAAGGATGCACATCAGAGGAGTGTCCAGGCAATGAAGGAGAGGATGGCTGATCTGGCACAGAGCTTAGGAATGCCAGCAGGCCTTGGTGATGGACTCAAGTGATAGTGTGGTACATGAATGCTTTTCAATAAAAAAAAAAGTGTATCTCAATTTTGTATACTAGCTGTATTGAGTCATCAGTTTAAAATTCGTGGCGAGTACTGTTAGCTGTGTAAGAACTGTAATCGAGAACATCTGATCCTGTTTTCCTTAATCATTGGCACACCATAATGCATTGACGCAAGTGTGCTGTTTTACAACTGCTGTTGATGTGCAGAATGAAATCTGTTCCAAACA。

本发明还提供了上述技术方案所述的水稻分蘖角度调控基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

MAPSTALSPVAFKSSFSPLLFNPTRSKINVEGAFCLPCYNRKKASNRSFRVYSLFGGKKDKDENGEEAPSKAGIFGNMQNLYETVKKAQMVVQVEAVRVQKELAATEIDGYCEGELIKVTLSGNQQPVRVEITEAAMEVGAEKLSELVNDAYKDAHQRSVQAMKERMADLAQSLGMPAGLGDGLK。

本发明优选将水稻中的水稻分蘖角度调控基因敲除，实现调控水稻分蘖角度。本发明对敲除水稻中的水稻分蘖角度调控基因的方法没有图书限定，如采用CRISPR-Cas9技术敲除或采用RNAi干扰技术降低水稻分蘖角度调控基因的表达。在本发明中，当采用CRISPR-Cas9技术敲除水稻分蘖角度调控基因时，通过靶位点敲除水稻分蘖角度调控基因，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，具体如下：

SEQ ID No.4：5’-ACTTGAAGGCCACCGGAGAG-3’；

SEQ ID No.5：5’-GCTGGTGAACGACGCCTACA-3’。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

水稻分蘖角度调控基因(以下简称LA2基因)的定位和克隆

水稻散生分蘖突变体la2(该突变体可以从湖南省农作物种质资源库免费获取)是籼稻品种湘晚籼13号中发现的自然突变体，其分蘖角度明显增大，突变体在播种后70d的分蘖角度为45.2°，而野生型的分蘖角度为15.9°(图1)，其他性状包括叶夹角、株高、穗型等在野生型与突变体之间差异不显著。在突变体la2和野生型的F₂群体中，紧凑株(小分蘖角)和散生株(大分蘖角)的分离比符合3:1的比例，表明该散生突变受隐性单基因控制。利用la2突变体与直立生长的粳稻品种02428杂交，杂种F₁自交，种植其中一株F₁来源的所有种子获得了一个F₂分离群体。为了排除籼粳间自然变异的影响，从F₂群体中各挑选30株大分蘖角个体和30株小分蘖角个体，提取DNA后各个体DNA等量混合采用常规方法构建两个DNA混池，采用常规的集团分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)将LA2基因定位于第2染色体的短臂端。随后从该F₂群体中筛选目标区域杂合的单株自交，发展了多个F₃株系。利用其中一个表型明显分离的F₃群体，将LA2定位在一个约668Kb的区间内；在此区间内筛选多态性分子标记，并根据日本晴和93-11的序列开发新标记，进一步利用F₄群体中的2449个隐性单株将区间缩小为31Kb(图2)。

精细定位区间内共有3个开放阅读框(ORF)，测序分析发现，ORF3(Os02g0180200)的第6个外显子有一个单碱基突变(G突变为A)，导致第159位氨基酸发生改变(丝氨酸突变为天冬酰胺)，cDNA的测序结果验证了此突变，因此预测ORF3为LA2的候选基因；进一步测序分析发现，该核苷酸突变在本地区的多个水稻品种(包括籼稻、粳稻和野生稻材料)中都未发现，排除了材料混杂或串粉引起的核苷酸变异；同时通过查询水稻基因组变异数据库(RiceVarMap)，发现1479份水稻材料中均未检测到该单核苷酸多态性(SNP)，表明该变异在自然界是一个稀有突变。生物信息学分析表明，该基因编码一个DNA结合蛋白，第75-180位氨基酸为保守的YbaB结构域，突变氨基酸位于该结构域内。该基因在水稻中只有一个拷贝，其编码的蛋白序列与玉米、大麦等谷类作物中的同源蛋白相似度较高，但这一基因家族在植物中的功能还未见报道。上述分析结果初步表明，ORF3(Os02g0180200)就是本发明要保护的水稻分蘖角度调控基因LA2。

实施例2

LA2基因的互补验证

(1)遗传互补载体的构建

根据LA2基因及其上下游的序列设计引物，扩增片段总长5538bp，包含起始密码子ATG上游2Kb的启动子序列、起始密码子ATG到终止密码子TGA之间的基因序列(3038bp)、以及终止密码子TGA下游的500bp序列，并在引物中分别引入限制性内切酶的Sac I和BamH I，引物序列如下：

LA2-CV-F(SEQ ID No.6)：

5’-CATGATTACGAATTCGAGCTCCGCGATTCCTGTATTTGCATAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I的识别位点)；

LA2-CV-R(SEQ ID No.7)：

5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCGAGGAAGAGAGGTTGGGAAAAGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I的识别位点)。

提取野生型水稻(湘晚籼13号)的基因组DNA，利用LA2-CV-F/LA2-CV-R引物对，使用高保真Taq酶扩增5538bp的互补片段。PCR反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA 1300多克隆位点的Sac I和BamHI酶切位点之间，获得LA2的植物表达载体，命名为pCAMBIA 1300-LA2。

(2)遗传转化与转基因鉴定

将大分蘖角突变体la2的成熟种子去壳，用70％的酒精消毒30s，然后在有效浓度1.5％的次氯酸钠溶液中消毒30min，使用无菌水漂洗3-5次，再用0.5g/L的头孢霉素溶液浸泡30min，最后将成熟胚接种于诱导培养基上进行愈伤组织诱导。30d后挑取愈伤组织转接到相同的培养基上增殖培养，每10d继代1次，获得大量愈伤组织待用。将pCAMBIA 1300-LA2转化EHA105农杆菌中，获得重组农杆菌。取少量重组农杆菌于YEP固体培养基平板上划线，28℃暗培养48h，挑单菌落转接于YEP液体培养基中，28℃振荡培养，使OD_600nm至0.8。利用培养得到的重组菌液对水稻愈伤组织进行农杆菌转化(具体方法参考文献：曾千春,李旭刚,马炳田,陈松彪,徐鸿林,孟昆,魏晓丽,朱祯.2003.一个籼稻推广品种优良组培特性的发现.分子植物育种,1(5/6):783-790)。

收获T₀代转基因植株的种子，加代种植后获得T₁代转基因植株。提取T₁代转基因植株的DNA，使用引物对LA2-CV-TF/LA2-CV-TR进行扩增，筛选阳性转基因植株(PCR获得789bp的扩增片段)。分蘖角度调查结果表明，所有转基因阳性植株的分蘖角度都明显变小，分蘖角度平均值为15.3°，与野生型湘晚籼13号的分蘖角度没有显著性差异，从而进一步证明LA2基因就是控制分蘖角度的目标基因。

LA2-CV-TF(SEQ ID No.8)：5’-GTTCCAAACAGAGAAATGGG-3’；

LA2-CV-TR(SEQ ID No.9)：5’-CGTAACTTAGGACTTGTGCGA-3’。

实施例3

利用CRISPR-Cas9敲除LA2基因增加水稻分蘖角度

(1)基因敲除载体的构建和遗传转化

用于基因敲除的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H和pYLsgRNA载体(这两种载体可在Addgene网站(https://www.addgene.org)查看与购买)(多靶点表达载体的构建方法参考文献：Xingliang Ma,Qunyu Zhang,Qinlong Zhu,Wei Liu,Yan Chen,Rong Qiu,Bin Wang,Zhongfang Yang,Heying Li,Yuru Lin,Yongyao Xie,Rongxin Shen,Shuifu Chen,ZhiWang,Yuanling Chen,Jingxin Guo,Letian Chen,Xiucai Zhao,Zhicheng Dong and Yao-Guang Liu.2015.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants,8:1274-1284.)。根据CRISPR/Cas9***识别的前间区序列邻近基序(Protospaceradjacentmotif，PAM)，在LA2基因的起始密码子附近和保守结构域区设计两个靶位点LA2-T1和LA2-T2，靶点序列分别为SEQ ID No.4：5’-ACTTGAAGGCCACCGGAGAG-3’和SEQ ID No.:5：5’-GCTGGTGAACGACGCCTACA-3’，将靶序列对水稻基因组做Blast，确定靶位点的特异性。根据靶点序列设计两对接头引物(LA2T1-F/LA2T1-R，LA2T2-F/LA2T2-R)，将靶点引物变性后冷却至室温完成退火，然后将退火后的2个片段分别连接到pYLsgRNA-U3和pYLsgRNA-U6a载体上，其中LA2-T1连接到pYLsgRNA-U3上，LA2-T2连接到pYLsgRNA-U6a上。获得的产物经过两轮巢式PCR，第一轮PCR的扩增引物(U-F/gRNA-R)两个表达盒共用，第二轮PCR体系与第一轮PCR类似，将扩增引物换成Uctcg-B1’/gRctga-B2和Uctga-B2’/gRcggt-BL，扩增模板为第一轮PCR产物稀释50倍，两轮PCR获得含有LA2-T1和LA2-T2靶点的gDNA表达盒U3-LA2T1-gRNA和U6a-LA2T2-gRNA。将扩增产物纯化后，使用限制性内切酶BsaI酶切，然后连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α，取少量菌液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB培养基上，挑取单菌落摇菌过夜；以菌液和质粒为模板，使用SP1/LA2T1-R引物对进行PCR验证，同时对PCR产物进行测序验证，理论产物长度为525bp。验证后将重组质粒转入EHA105农杆菌，转基因水稻的获得方法同实施例2。

使用到的引物序列如下：

LA2T1-F(SEQ ID No.10)：5’-GGCACTTGAAGGCCACCGGAGAG-3’；

LA2T1-R(SEQ ID No.11)：5’-AAACCTCTCCGGTGGCCTTCAAG-3’；

LA2T2-F(SEQ ID No.12)：5’-GCCGCTGGTGAACGACGCCTACA-3’；

LA2T2-R(SEQ ID No.13)：5’-AAACTGTAGGCGTCGTTCACCAG-3’；

U-F(SEQ ID No.14)5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

gRNA-R(SEQ ID No.15)：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

Uctcg-B1’(SEQ ID No.16)：

5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’

gRctga-B2(SEQ ID No.17)：

5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；

Uctga-B2’(SEQ ID No.18)：

5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；

gRcggt-BL(SEQ ID No.19)：

5’-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；

SP1(SEQ ID No.20)：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’。

(2)打靶效果的检测

以野生型和转化株的gDNA为模板，扩增LA2基因的全长并测序。根据测序结果，从中挑选两个打靶成功的株系KO-5和KO-6，用于下一步的分蘖角度观察。如图3所示，KO-5株系在靶点2附近发生单碱基***，引起移码突变；KO-6在靶点1和靶点2附近均发生序列变异，其中靶点1附近发生8个碱基的序列缺失，靶点2附近发生2个碱基的序列缺失，均引起移码突变。具体如下：

Target1/靶点1

WT(SEQ ID No.21)：

ATGGCTCCCTCCACCGCCCTCTCTCCGGTGGCCTTCAAGTCCTCCTTCTCGCC；

KO-6(SEQ ID No.22)：ATGGCTCCCTCCACCGCCCT--------TGGCCTTCAAGTCCTCCTTCTCGCC；

Target2/靶点2

WT(SEQ ID No.23)：

CTTTCTGAGCTGGTGAACGACGCCTACAAGGATGCACATCAGAGGAGTG；

KO-5(SEQ ID No.24)：

CTTTCTGAGCTGGTGAACGACGCCT

ACAAGGATGCACATCAGAGGAGTG；

KO-6(SEQ ID No.25)：CTTTCTGAGCTGGTGAACGACGC--ACAAGGATGCACATCAGAGGAGTG。

(3)LA2敲除株系的分蘖角度调查

对KO-5和KO-6加代繁殖，获得T2代稳定纯合株系，在播种70d后调查野生型和敲除株系的分蘖角度。如图4所示，KO-5和KO-6的分蘖角度明显增大，分蘖角度分别为45.0°和45.8°，表明敲除LA2基因引起分蘖角度变大，获得散生分蘖水稻。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南省水稻研究所

<120> 一种水稻分蘖角度调控基因及其编码的蛋白和应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccttttct cttcaacgat atcctctatc ccaaaaatcg agccttttcc tccccccttc 60

ctcctccacc gccgcccatc tcgccgccgc cgccgccgcc gatggctccc tccaccgccc 120

tctctccggt ggccttcaag tcctccttct cgccgctcct cttcaacccg acccgtaagc 180

catcctctcc ctccatcctt ctctctccgc gcggcggagt cagccgtagc cgggcgcttt 240

ccgtcgtcgg gcgccgctgc cagcgcgcgc gcgcgcgcgg aggaatcctc cacggcggta 300

ttcttcggag cccaattcga tcggggtggc ctcgtctccg atgccgccgc ggcccaccgc 360

tttgcctggc gttcgtatta tcgggtggcc tcttaactct aattagtgcg gatgcgagtt 420

gggttgctgt gcttgcggtt agggtttcac tgggcgttaa aagagagaaa aagaaattca 480

ttaagtctca atttagttga atgtttttgc ggcggtgtgt ggggggagat tgttgcgttt 540

gtgctgttct aggtgacggc cggaaatatt tggtttgttt ttaggtttga caataatctt 600

ttcgtcggtt ttcggggtcc ttgtacaatt ctatcatttc aaccatgtac aaagatgttc 660

cttttttatg ttaggaattg gtttcattta gttctagtgg acatacgatt ctggcatgta 720

ggtaatttat ttcattatgg taagttttct gttgtagtag tatctgttta ttcagggaat 780

tgtataaaat ggagcattac acattagctt agtccttggg cttccgttct ccccttttct 840

tttgatcggt ggagctttga tctttgttga ccagtgcgtc cttgttgatt atttttctta 900

tgttatagca acacctgaac attttgcacc tgttgtttct ttgttgttca ggttctaaga 960

taaatgtcga aggtgcattc tgtttgccat gttacaatag gaaaaaggct agcaatagat 1020

cctttcgcgt gtacagttta tttgggggaa aaaaggacaa agacgagaat ggtgaagaag 1080

caccatcaaa ggtaagaaaa ttagatgcct tctttcaatt tgaacttctg ttgtactccc 1140

aataactaaa agagtatctt catggatgcc tgaaatgaaa acaattgcaa attcacaggt 1200

ggatgtctac cttaatcagt tcaatactat gtgctattca tatctttata cttttatctg 1260

aatagtaata tgctcaagat aatgccttgc tcattgcaaa ttctgttgaa gtcttaaact 1320

cctgtagaaa atagttaaga gtgtaactca tcatgttgat atttcagttc gtgctgaaat 1380

taaattctgc atataatttt aagggaatat aaaatatttt aactaatatg tacttttgtt 1440

atcacctcta ctttatagct tctatgttca gttttcttct ctttccaatg aatgatgcca 1500

cttctaaaat gataaacttt tactttattt gggtatttgt atagttgact aagatgcatg 1560

agctgtattc actatgttcc cttgtttgtg cacaaatacc tagtatagta ggcattttta 1620

tttttgtttg taaacatctt gtagttctca tttttgtact tacttttagg caggaatttt 1680

cggaaatatg caaaatcttt atgaaactgt gaagaaggcc cagatggttg tccaagttga 1740

ggctgtccgg gtgcaaaagg agcttgcagc gtatgcattt ggatatctga gtaatatttg 1800

atatgttatc gctaaatagc acagcagtgt gacttttttc ctcttgtttt aggactgaga 1860

tcgatggtta ctgtgaaggg gaactaatca aggtatgctt tggattagtt gattaatgtt 1920

gttgttaact gaattcttgc tagctgtatg tttcattgtg ccttgaacat tgaagggttt 1980

ctttgttaaa tgactgacat tttagcattg ttgaaaaagc ctgttgaact tgagccaggc 2040

tataaagatc acatattatc actgacaaac attgatcttt gtttcactga gaaagggcgg 2100

tcatttccta cagtaaaacc aaatatattc ccttatatgt tcttatactg aagaatggca 2160

tgtatttttt atgatcttaa ttaggttgat cgctatatga agtaattaaa atcatttggt 2220

atctctttta gctttggctt agataaagtt atgttgaaaa ggtaccatct tggcacaaga 2280

acactgtcaa atctgtgggc agggaggtgg ttataagtca tcaaatgatt tatggtggca 2340

taggttgtta ccgtttgaaa aggtcactgt cttaactctt aaagccattt gaaaatgtgc 2400

atgttaataa tgtcttagct tttcaaatga caaaaataac gttgcaatac cttgacattt 2460

tctcccatga gctaagtgct atgctggtat attttgtaga gccatatgct gtcaaagttt 2520

gctaaatctt atttgtttct tataagttta gcaggactat ccgattatta cattcctttg 2580

cttttctcga aagtagaaaa tcacatgcat atacttccgg tgcaagtatt tgacctgatt 2640

cattaaccag gtaacacttt ctgggaacca gcagcctgta agagttgaaa tcaccgaagc 2700

tgcaatggaa gtgggtgctg aagtatgtat tttatctacc attttaatca ttttctttga 2760

cgatttcttg catgttcgca tgatttttgg catgagtcaa ccatttcaat gttcacacat 2820

gaatttgata aataccttat gtatgtaccc gttagcagac caaaacaaaa ccaaattgtt 2880

caaagtgtga tatatatagt atcctttcag aaactttctg agctggtgaa cgacgcctac 2940

aaggatgcac atcagaggag tgtccaggtg cgaatcctgc tattactttt tgcgtagaaa 3000

ttgaaacttg cgttctatac taacacggta ctgtacttaa aacctgcagg caatgaagga 3060

gaggatggct gatctggcac agagcttagg aatgccagca ggccttggtg atggactcaa 3120

gtgatagtgt ggtacatgaa tgcttttcaa taaaaaaaaa agtgtatctc aattttgtat 3180

actagctgta ttgagtcatc agtttaaaat tcgtggcgag tactgttagc tgtgtaagaa 3240

ctgtaatcga gaacatctga tcctgttttc cttaatcatt ggcacaccat aatgcattga 3300

cgcaagtgtg ctgttttaca actgctgttg atgtgcagaa tgaaatctgt tccaaaca 3358

<210> 2

<211> 889

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttctcttc aacgatatcc tctatcccaa aaatcgagcc ttttcctccc cccttcctcc 60

tccaccgccg cccatctcgc cgccgccgcc gccgccgatg gctccctcca ccgccctctc 120

tccggtggcc ttcaagtcct ccttctcgcc gctcctcttc aacccgaccc gttctaagat 180

aaatgtcgaa ggtgcattct gtttgccatg ttacaatagg aaaaaggcta gcaatagatc 240

ctttcgcgtg tacagtttat ttgggggaaa aaaggacaaa gacgagaatg gtgaagaagc 300

accatcaaag gcaggaattt tcggaaatat gcaaaatctt tatgaaactg tgaagaaggc 360

ccagatggtt gtccaagttg aggctgtccg ggtgcaaaag gagcttgcag cgactgagat 420

cgatggttac tgtgaagggg aactaatcaa ggtaacactt tctgggaacc agcagcctgt 480

aagagttgaa atcaccgaag ctgcaatgga agtgggtgct gaaaaacttt ctgagctggt 540

gaacgacgcc tacaaggatg cacatcagag gagtgtccag gcaatgaagg agaggatggc 600

tgatctggca cagagcttag gaatgccagc aggccttggt gatggactca agtgatagtg 660

tggtacatga atgcttttca ataaaaaaaa aagtgtatct caattttgta tactagctgt 720

attgagtcat cagtttaaaa ttcgtggcga gtactgttag ctgtgtaaga actgtaatcg 780

agaacatctg atcctgtttt ccttaatcat tggcacacca taatgcattg acgcaagtgt 840

gctgttttac aactgctgtt gatgtgcaga atgaaatctg ttccaaaca 889

<210> 3

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro Val Ala Phe Lys Ser Ser Phe

1 5 10 15

Ser Pro Leu Leu Phe Asn Pro Thr Arg Ser Lys Ile Asn Val Glu Gly

20 25 30

Ala Phe Cys Leu Pro Cys Tyr Asn Arg Lys Lys Ala Ser Asn Arg Ser

35 40 45

Phe Arg Val Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Lys Lys Asp Lys Asp Glu Asn

50 55 60

Gly Glu Glu Ala Pro Ser Lys Ala Gly Ile Phe Gly Asn Met Gln Asn

65 70 75 80

Leu Tyr Glu Thr Val Lys Lys Ala Gln Met Val Val Gln Val Glu Ala

85 90 95

Val Arg Val Gln Lys Glu Leu Ala Ala Thr Glu Ile Asp Gly Tyr Cys

100 105 110

Glu Gly Glu Leu Ile Lys Val Thr Leu Ser Gly Asn Gln Gln Pro Val

115 120 125

Arg Val Glu Ile Thr Glu Ala Ala Met Glu Val Gly Ala Glu Lys Leu

130 135 140

Ser Glu Leu Val Asn Asp Ala Tyr Lys Asp Ala His Gln Arg Ser Val

145 150 155 160

Gln Ala Met Lys Glu Arg Met Ala Asp Leu Ala Gln Ser Leu Gly Met

165 170 175

Pro Ala Gly Leu Gly Asp Gly Leu Lys

180 185

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttgaaggc caccggagag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctggtgaac gacgcctaca 20

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgattacg aattcgagct ccgcgattcc tgtatttgca tag 43

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggtcgact ctagaggatc cgaggaagag aggttgggaa aagg 44

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttccaaaca gagaaatggg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtaacttag gacttgtgcg a 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcacttgaa ggccaccgga gag 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaacctctcc ggtggccttc aag 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccgctggtg aacgacgcct aca 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaactgtagg cgtcgttcac cag 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcgtgggtc tcgaccgggt ccatccactc caagctc 37

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccgacatag atgcaataac ttc 23

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggctccct ccaccgccct ctctccggtg gccttcaagt cctccttctc gcc 53

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atggctccct ccaccgccct tggccttcaa gtcctccttc tcgcc 45

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctttctgagc tggtgaacga cgcctacaag gatgcacatc agaggagtg 49

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctttctgagc tggtgaacga cgccttacaa ggatgcacat cagaggagtg 50

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctttctgagc tggtgaacga cgcacaagga tgcacatcag aggagtg 47

Claims

1.一种调控水稻分蘖角度的方法，其特征在于，将水稻分蘖角度调控基因敲除；

所述水稻分蘖角度调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过CRISPR-Cas9技术敲除水稻分蘖角度调控基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过靶位点敲除水稻分蘖角度调控基因，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻分蘖角度调控基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻分蘖角度调控基因或水稻分蘖角度调控基因的cDNA编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。